Assessing T Cell Bioenergetic Poise and Spare Respiratory Capacity Using Extracellular Flux Analysis / Valutazione dell'equilibrio bioenergetico delle cellule T e della capacità respiratoria di riserva utilizzando l'analisi del flusso extracellulare
Assessing T Cell Bioenergetic Poise and Spare Respiratory Capacity Using Extracellular Flux Analysis / Valutazione dell'equilibrio bioenergetico delle cellule T e della capacità respiratoria di riserva utilizzando l'analisi del flusso extracellulare
Segnalato dal Doyt. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Figure 1. The fundamentals of T cell energy metabolism with measurements of T cell metabolic phenotypes, illustrating a relationship between glycolysis/ OXPHOS ratio and cell fate, fitness, and function. Under chronic stimulation or in the presence of an inhibitory environment such as the tumor microenvironment, T cells can develop into an exhausted phenotype with impaired mitochondrial function. / I fondamenti del metabolismo energetico delle cellule T con misurazioni dei fenotipi metabolici delle cellule T, che illustrano una relazione tra il rapporto glicolisi/OXPHOS ed il destino, la forma fisica e la funzione delle cellule. Sotto stimolazione cronica o in presenza di un ambiente inibitorio come il microambiente tumorale, le cellule T possono svilupparsi in un fenotipo esaurito con funzione mitocondriale compromessa.
Abstract
The Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling kit is a robust solution for the complete assessment of T cell metabolism in real time. Metabolism has emerged as a key driver of T cell fate and function. Indeed, it has been demonstrated that metabolic reprogramming of T cells can be used as a strategy to improve the antitumor efficacy of adoptive T cell therapies. The XF T Cell Metabolic Profiling kit allows the simultaneous measurement of glycolytic and mitochondrial activity in T cell populations combined with the measurement of mitochondrial respiratory capacity. These parameters have been linked with optimal function and improved persistence of T cell therapies. Previously, measurement of mitochondrial respiratory capacity using FCCP required concentration optimization between cell types, differentiation stage, donor and healthy or disease state. The XF T Cell Metabolic Profiling kit uses an improved uncoupler (BAM15) for more consistent and accurate measurements of T cell bioenergetic capacity with less concentration optimization required than FCCP. In addition, this application note highlights the use of the kit in assessing the impact of the medium composition during T cell expansion following the XF T Cell Persistence Assay workflow. This workflow allows for evaluation of glycolysis and mitochondrial activity and capacity simultaneously, providing a comprehensive metabolic profile of T cells that can be incorporated into monitoring and improving the design and development of T cell therapies.
Introduction
The development of cell-mediated immunotherapies has revolutionized cancer research as well as the study of the immune system. One of the most promising types of cell therapies involves the genetic engineering of novel chimeric antigen receptor (CAR) T cells to target cancer cells. There is strong evidence suggesting that metabolic properties of T cells – that is, how T cells sustain bioenergetic demands – play an essential role in regulating their antitumor function and dictating the effectiveness of T cell-based immunotherapies. T cells undergo a series of changes in their metabolic phenotype during the activation and differentiation into effector and memory cells, which are critical to maintaining T cell function. Naïve T cells are in a quiescent state, with low metabolic demands sustained mainly by mitochondrial respiration. Antigen stimulation induces the exit of the quiescent state, a rapid increase in nutrient uptake, increased anabolic metabolism, and reprogramming of mitochondrial metabolism. These metabolic changes are critical to support rapid T cell proliferation and differentiation to produce cytokines or molecules that trigger cytotoxicity. After successfully clearing the antigenic stimulus, remaining differentiated memory T cells revert to a more quiescent phenotype supported primarily by mitochondrial activity and high spare respiratory capacity (SRC). Under the conditions of chronic stimulation or in a metabolically restricted environment, T cells can become metabolically dysfunctional – a state known as T cell exhaustion – where T cells exhibit decreased mitochondrial bioenergetic capacity and effector function (Figure 1). Due to the strong impact of metabolic modulation in T cell fate and function, determining the metabolic signatures of CAR-T and other adoptive T cell therapies can play a crucial role in defining T cell persistence and antitumor function. Moreover, modulation or reprogramming of the metabolic pathways of T cells can be used as a strategy to improve the antitumor efficiency of T cells.
The complete characterization of both glycolytic and mitochondrial bioenergetic pathways in T cells at different stages of T cell lifespan, as well as information about metabolic adaptations to different cellular environments or stress signals, are critical outputs to optimize T cell therapies and improve the antitumor potency of immunotherapy products. Designed to simultaneously interrogate glycolytic and mitochondrial function in live cells, Agilent Seahorse XF technology is one of the leading platforms used to study immune cell metabolism and is a key contributor to the current understanding of immunometabolism and the recognition of the fundamental role of the metabolic changes that occur during T cell activation and differentiation. This application note presents the new Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling Kit, designed to enable the simultaneous acquisition of robust measurements of glycolytic and mitochondrial activity in T cell populations combined with mitochondrial respiratory capacity. These measurements provide complete characterization of the T cell metabolic profile from a single assay and can be used to correlate with increased or decreased antitumor function of T cell therapy products. Obtaining these measurements can be especially valuable during the therapy development processes targeted at improving T cell persistence or avoid metabolic exhaustion postactivation in the tumor microenvironment.
Introduction
The development of cell-mediated immunotherapies has revolutionized cancer research as well as the study of the immune system. One of the most promising types of cell therapies involves the genetic engineering of novel chimeric antigen receptor (CAR) T cells to target cancer cells. There is strong evidence suggesting that metabolic properties of T cells – that is, how T cells sustain bioenergetic demands – play an essential role in regulating their antitumor function and dictating the effectiveness of T cell-based immunotherapies. T cells undergo a series of changes in their metabolic phenotype during the activation and differentiation into effector and memory cells, which are critical to maintaining T cell function. Naïve T cells are in a quiescent state, with low metabolic demands sustained mainly by mitochondrial respiration. Antigen stimulation induces the exit of the quiescent state, a rapid increase in nutrient uptake, increased anabolic metabolism, and reprogramming of mitochondrial metabolism. These metabolic changes are critical to support rapid T cell proliferation and differentiation to produce cytokines or molecules that trigger cytotoxicity. After successfully clearing the antigenic stimulus, remaining differentiated memory T cells revert to a more quiescent phenotype supported primarily by mitochondrial activity and high spare respiratory capacity (SRC). Under the conditions of chronic stimulation or in a metabolically restricted environment, T cells can become metabolically dysfunctional – a state known as T cell exhaustion – where T cells exhibit decreased mitochondrial bioenergetic capacity and effector function (Figure 1). Due to the strong impact of metabolic modulation in T cell fate and function, determining the metabolic signatures of CAR-T and other adoptive T cell therapies can play a crucial role in defining T cell persistence and antitumor function. Moreover, modulation or reprogramming of the metabolic pathways of T cells can be used as a strategy to improve the antitumor efficiency of T cells. Effector Naïve Memory Chronic stimulation/inhibitory environment Exhaustion Exhausted T cell Memory T cell Naïve T cell Activated TE cell APR SRC APR SRC APR SRC APR SRC Intervention Time Glycolysis: OXPHOS ratio Figure 1. The fundamentals of T cell energy metabolism with measurements of T cell metabolic phenotypes, illustrating a relationship between glycolysis/ OXPHOS ratio and cell fate, fitness, and function. Under chronic stimulation or in the presence of an inhibitory environment such as the tumor microenvironment, T cells can develop into an exhausted phenotype with impaired mitochondrial function. The complete characterization of both glycolytic and mitochondrial bioenergetic pathways in T cells at different stages of T cell lifespan, as well as information about metabolic adaptations to different cellular environments or stress signals, are critical outputs to optimize T cell therapies and improve the antitumor potency of immunotherapy products. Designed to simultaneously interrogate glycolytic and mitochondrial function in live cells, Agilent Seahorse XF technology is one of the leading platforms used to study immune cell metabolism and is a key contributor to the current understanding of immunometabolism and the recognition of the fundamental role of the metabolic changes that occur during T cell activation and differentiation.This application note presents the new Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling Kit, designed to enable the simultaneous acquisition of robust measurements of glycolytic and mitochondrial activity in T cell populations combined with mitochondrial respiratory capacity. These measurements provide complete characterization of the T cell metabolic profile from a single assay and can be used to correlate with increased or decreased antitumor function of T cell therapy products. Obtaining these measurements can be especially valuable during the therapy development processes targeted at improving T cell persistence or avoid metabolic exhaustion postactivation in the tumor microenvironment.
Performance review of mitochondrial uncoupler used in T cells
The study of mitochondrial function in T cells using the Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test combined with Agilent Seahorse XF analyzers has provided the foundational knowledge about T cell energy metabolism and its role in directing T cell fate and function. The Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit combines a series of reagents that allow a complete characterization of mitochondrial function. In particular, sequential injections of an ATP synthase inhibitor (oligomycin), a mitochondrial uncoupler (carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, FCCP) and a mitochondrial inhibitor (mixture of rotenone and antimycin A (rot/AA)) allow calculation in intact cells of the oxygen consumption rate coupled to mitochondrial ATP production (ATP-linked respiration), the uncoupled maximal respiration as well as the SRC, i.e, the difference between basal respiration and maximal respiratory capacity. These parameters have been widely used to characterize the mitochondrial function of different T cell populations and to describe processes that improve antitumor potency of T cells. However, despite the wide adoption of this assay in the immunometabolism field, its use in T cells presents some challenges, primarily due to the use of the protonophore uncoupler FCCP.
There are several reasons that the use of FCCP with T cells (and potentially other immune cells) is not ideal. First, the optimal concentration of FCCP varies depending on many factors, including immune cell type, differentiation stage, donor, and disease state. If its concentration is not titrated or optimized for each individual experiment, it can lead to underestimation of maximal respiratory capacity. Second, in naïve T cells and some other differentiated T cells, the oxygen consumption rate (OCR) after FCCP exposure is not stable, resulting in high variation in the measurements, and potentially under-reporting the maximal respiratory capacity. In addition, the use of FCCP in the XF Cell Mito Stress Test limits the ability of the assay to provide quantitative measurements of the glycolytic activity which is the glycolytic ATP (glycoATP) production rate. Calculation of glycoATP production rate using Seahorse XF ECAR (extracellular acidification rate) measurements requires correction from CO2 contribution which is estimated using basal OCR measurements and OCR after addition of rot/AA.8 However, when FCCP is used before rot/AA in the assay, it can result in underestimation of CO2 contribution and impacts quantification of glycolytic activity. This is especially important in cells that are highly oxidative, i.e., cells that rely primarily on mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) for energy, where CO2 contribution to ECAR is not negligible. Simultaneous assessment of mitochondrial ATP (mitoATP) production rate and glycoATP production rates allows characterizing basal cellular energetic demand (i.e., total cellular ATP production rate) and basal metabolic poise (i.e., the ratio between glycoATP and mitoATP production rates). These are critical parameters for determining T cell fate and function. Yet, they are not provided by the XF Cell Mito Stress Test, resulting in an incomplete characterization of T cell bioenergetics.
Development of the new Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling Kit
To enable the simultaneous acquisition of accurate, consistent, and quantitative bioenergetic measurements for both glycolytic and mitochondrial activity in T cell populations, the Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling Kit was developed. This kit allows accurate measurements of the maximal respiratory capacity in T cells by using the uncoupler BAM15 ((2-fluorophenyl){6-[(2-fluorophenyl)amino] (1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]pyrazin-5-yl)}amine). BAM15 is a novel uncoupler reported to have similar potency as FCCP but with less cytotoxicity and lower affinity for the plasma membrane, resulting in a broader effective range. As shown in Figures 2A to 2C (red lines), when naïve T cells are tested with XF Cell Mito Stress Test Kit, the rate of change in O2 level during the three minutes of the instrument measurement after FCCP injection is not constant or linear, resulting in variable OCR calculations and underestimation of maximal respiration (Figures 2D to 2F, red lines). In addition, there could be a significant overestimation of OCR after rot/AA injection, as indicated by the comparison of the kinetic traces obtained with FCCP injection or with vehicle injection (Figure 2D, red or blue trace). However, when the uncoupler BAM15 is used instead of FCCP, a stable increase in OCR is obtained after BAM15 injection (Figures 2A to 2C, green lines), resulting in a more accurate and precise determination of maximal respiration (Figures 2D to 2F, green lines).
Figure 2. Comparison of Oxygen consumption measurements using uncoupler FCCP and BAM15. Human and mouse naïve T cells were seeded at 2 × 105 and 1.5 × 105 cells/well, respectively, in Seahorse XF RPMI assay medium, pH 7.4 supplemented with 10 mM glucose, 2 mM glutamine, and 1 mM pyruvate. Changes in extracellular oxygen level in naïve human CD4+ (A), naïve human CD8+ (B), and spleen‑derived mouse CD8+ T cells (C) after addition of optimal concentrations of the uncouplers FCCP (red lines) or BAM15 (green lines). Oxygen consumption rate (OCR) obtained from the XF Cell Mito Stress Test (red lines) or T Cell Metabolic Profiling Kit assay (green lines) in naïve human CD4+ (D), naïve human CD8+ (E), and spleen-derived mouse CD8+ T cells (F). Blue line in 2D corresponds to the condition where assay medium was injected instead of uncoupler. / Confronto delle misurazioni del consumo di ossigeno utilizzando il disaccoppiatore FCCP e BAM15. Cellule T naïve umane e di topo sono state seminate a 2 × 105 e 1,5 × 105 cellule/pozzetto, rispettivamente, nel mezzo di analisi Seahorse XF RPMI, pH 7,4 integrato con 10 mM di glucosio, 2 mM di glutammina e 1 mM di piruvato. Variazioni del livello di ossigeno extracellulare nei linfociti CD4+ umani naïve (A), CD8+ umani naïve (B) e CD8+ di topo derivati dalla milza (C) dopo l'aggiunta di concentrazioni ottimali dei disaccoppiatori FCCP (linee rosse) o BAM15 (linee verdi) . Tasso di consumo di ossigeno (OCR) ottenuto dall'XF Cell Mito Stress Test (linee rosse) o dal test T Cell Metabolic Profiling Kit (linee verdi) in CD4+ umano naïve (D), CD8+ umano naïve (E) e CD8+ murino derivato dalla milza Cellule T (F). La linea blu in 2D corrisponde alla condizione in cui è stato iniettato il mezzo di analisi invece del disaccoppiatore.
These preliminary tests were followed with additional experiments using human naïve CD4+ , human naïve CD8+ , human PBMC, and spleen-derived mouse CD8+ T cells from at least three different donors per cell type. In all the cases, side‑by‑side titrations using FCCP or BAM15 were performed. Higher maximal respiration and lower standard deviations were consistently obtained with BAM15 as the uncoupler, when compared to those obtained at the optimal FCCP concentrations (Figures 3A to 3C). Titration experiments also demonstrated that the range of optimal BAM15 concentration is wider than the optimal FCCP range, indicating minimal need to optimize uncoupler concentration for each sample when BAM15 is used (Figures 3A and 3B, middle bar graphs).
Figure 3. Comparison of maximal respiration measurements from FCCP and BAM15 titration experiments using human naïve CD4+ T cells (A) and CD8+ T cells (B). Bar graphs in the middle represents the maximal respiration obtained at different uncoupler concentration. (C) % CV of maximal respiration obtained for the panel of naïve T cells tested when optimal concentrations of FCCP or 2.5 µM BAM15 were used. / Confronto delle misurazioni della respirazione massima da esperimenti di titolazione FCCP e BAM15 utilizzando cellule T CD4+ umane naïve (A) e cellule T CD8+ (B). I grafici a barre al centro rappresentano la respirazione massima ottenuta a diverse concentrazioni di disaccoppiatore. (C) % CV della respirazione massima ottenuta per il pannello di cellule T naïve testate quando sono state utilizzate concentrazioni ottimali di FCCP o 2,5 µM BAM15.
The glycoATP production rates calculated from using the XF T Cell Metabolic Profiling Kit (with BAM15 uncoupler) were also compared with those obtained in parallel experiments using the Agilent Seahorse XF Real-Time ATP Rate Assay Kit. The results show that there are no significant differences in the basal glycoATP production rates obtained from these two kits or assays (Figure 4).
Finally, a broad panel of T cells was selected to further evaluate the XF T Cell Metabolic Profiling Kit, from humans to mice and including different donors and differentiation states. Titration experiments were performed and maximal OCR values obtained at optimal FCCP concentration were compared with the values obtained at a single concentration of BAM15 (2.5 µM) for the T cell panel (Figure 5). In all the cases, the maximal OCR obtained with 2.5 µM BAM15 was at least 90% of the maximal OCR obtained at the optimal FCCP concentration within the same cell type. Maximal OCR obtained with 2.5 µM BAM15 was, on average, 20% higher than the value obtained with the optimal FCCP concentration, demonstrating that the BAM15 reagent from the kit can be used at a fixed concentration of 2.5 µM for all T cell types or requires minimal optimization.
Figure 5. Comparison of maximal respiration obtained at optimal FCCP concentration or 2.5 µM BAM15 from a broad panel of T Cells, including human PBMC, naïve CD4+ , naïve CD8+ , activated CD4+ , activated CD8+ , effector CD8+ , memory CD8+ , and mouse naïve and activated CD8+ T cells (n = 3 per cell type). / Confronto della respirazione massima ottenuta alla concentrazione FCCP ottimale o 2,5 µM BAM15 da un ampio pannello di cellule T, tra cui PBMC umano, CD4+ naïve, CD8+ naïve, CD4+ attivato, CD8+ attivato, CD8+ effettore, CD8+ di memoria e CD8+ T naïve e attivato di topo celle (n = 3 per tipo di cellula).
Application of XF T Cell Metabolic Profiling Kit in optimizing persistence for T cell therapy products
One critical attribute to consider when evaluating CAR-T and other adoptive T cell therapies is the metabolic signature of the cells, since it plays a crucial role in defining T cell persistence and antitumor function. Indeed, CAR-T cells that acquire an effector phenotype with high metabolic activity during in vitro expansion have been reported to display poor persistence and antitumor activity in vivo. However, CAR-T cells that show low-to-medium metabolic activity during in vitro expansion and high spare respiratory capacity confer good antitumor immunity, characterized by enhanced proliferation capabilities, higher rates of tumor cell killing, and cytokine production. Several publications indicate that expansion conditions during manufacturing could produce T cell products with an undesired metabolic phenotype that results in reduced in vivo potency. These publications also point out that metabolic conditioning of T cells during expansion can induce metabolic reprogramming that results in extended in vivo persistence and improved antitumor function.
Designed to assist T cell therapy development, the XF T Cell Metabolic Profiling Kit delivers a complete picture of T cell metabolic profile from a single assay which includes total basal energetic demand, basal metabolic poise, and spare respiratory capacity – all parameters were previously used to describe T cell metabolic states with increased or reduced persistence. Therefore, it is ideally suited for assessing and optimizing T cell expansion conditions that result in the desired metabolic phenotype for increased T cell persistence. Here, the XF T Cell Metabolic Profiling Kit was used to evaluated how cell culture medium composition (RPMI containing 10 mM glucose + 10% FBS or ImmunoCult XF Medium (STEMCELL Technologies)), as well as the addition of different interleukins (IL-2 or IL-15), can impact metabolic profile of T cell products. Previous studies indicated that cells expanded in IL-15 present a less differentiated phenotype than cells cultured in IL-2.13 In this study, pan T cells were activated from different healthy human donors with magnetic beads conjugated with CD3/CD28 antibodies. After three days, the magnetic beads were removed, and cells expanded in the indicated medium conditions (Figure 6). Cells were maintained in culture at a cell density of 1 × 106 cells/mL, with medium refreshed and volume adjusted every three days. At day 7, 14, and 22, samples were removed and analyzed using the XF T Cell Persistence assay supported by the XF T Cell Metabolic Profiling Kit following the recommended assay conditions. First, SRC in the course of cell expansion was compared. As shown in Figure 6A, at day 7 a difference in the SRC of cells expanded in IL-15 or IL-2 is observed, independent of the cell culture media used during expansion. The increased SRC of cells expanded in IL-15 is accentuated at day 22, particularly in the cells cultured in the optimized ImmunoCult XF medium (Figure 6C). Increased SRC is characteristic of memory‑like phenotype and has been previously associated with increased persistence.
The next step was examining the additional outputs enabled by this assay for better characterizing and improving expansion conditions, which are the basal ATP production rates from glycolysis and mitochondria (Figure 6, lower two graphs in each panel). Cells expanded in ImmunoCult XF medium containing IL-15 have a more oxidative metabolic poise (lower % ATP from glycolysis) compared to that containing IL-2 (Figure 6, lower right graph in each panel, yellow versus purple bars). In addition, cells expanded and differentiated in RPMI medium present higher metabolic demand (higher total basal ATP production rate) than cells expanded and differentiated in ImmunoCult XF medium, regardless which interleukin was used (Figure 6, lower left graph in each panel). Increased metabolic demand is associated with effector T cell phenotype. In fact, when the expression of the CCR7-A and CD45RO-A surface markers was analyzed using the Agilent NovoCyte Advanteon flow cytometer, it was observed that cells expanded in ImmunoCult XF medium maintained a higher ratio of CCR7-A+ /CD45RO-A+ central memory population compared to cells expanded in RPMI that were enriched in effector memory phenotype (Figure 7).
Conclusion
This document presents an optimized assay for the complete characterization of the metabolic profile of T cells. The assay combines the use of the XF analyzer with the XF T Cell Metabolic Profile Kit, providing an optimized uncoupler that allows for robust measurements of maximal respiration and spare respiratory capacity in T cells and minimal uncoupler concentration optimization. In addition, this assay allows users to obtain quantitative information about glycolytic activity in the same cell sample, together with a unique measurement of basal cell bioenergetic demand. To improve the ability to develop and predict T cell therapy efficiency, it is required to use a combination of tools and orthogonal assays that provide a comprehensive data set to characterize CAR-T cell therapeutic products. It is clear that metabolic characterization of T cells is one of the critical attributes that need to be analyzed to improve the persistence and antitumor potency of T cell products. The XF T Cell Persistence Assay delivers a multiparametric outputs that provide a complete characterization of T cell metabolic profile from the same sample and can be incorporated as a routine assay to optimize the design and manufacture of T cell‑derived therapeutics.
ITALIANO
Riassunto
Il kit Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling è una soluzione affidabile per la valutazione completa del metabolismo delle cellule T in tempo reale. Il metabolismo è emerso come un fattore chiave del destino e della funzione delle cellule T. Infatti, è stato dimostrato che la riprogrammazione metabolica delle cellule T può essere utilizzata come strategia per migliorare l'efficacia antitumorale delle terapie con cellule T adottive. Il kit XF T Cell Metabolic Profiling consente la misurazione simultanea dell'attività glicolitica e mitocondriale nelle popolazioni di cellule T combinata con la misurazione della capacità respiratoria mitocondriale. Questi parametri sono stati collegati con una funzione ottimale ed una migliore persistenza delle terapie con cellule T. In precedenza, la misurazione della capacità respiratoria mitocondriale mediante FCCP richiedeva l'ottimizzazione della concentrazione tra i tipi di cellule, lo stadio di differenziazione, il donatore e lo stato di salute o di malattia. Il kit XF T Cell Metabolic Profiling utilizza un disaccoppiatore migliorato (BAM15) per misurazioni più coerenti e accurate della capacità bioenergetica delle cellule T con una minore ottimizzazione della concentrazione richiesta rispetto a FCCP. Inoltre, questa nota applicativa evidenzia l'uso del kit nella valutazione dell'impatto della composizione del terreno durante l'espansione delle cellule T seguendo il flusso di lavoro del test XF T Cell Persistence Assay. Questo flusso di lavoro consente la valutazione simultanea della glicolisi e dell'attività e della capacità mitocondriale, fornendo un profilo metabolico completo delle cellule T che può essere incorporato nel monitoraggio e nel miglioramento della progettazione e dello sviluppo di terapie con cellule T.
Introduzione
Lo sviluppo delle immunoterapie cellulo-mediate ha rivoluzionato la ricerca sul cancro e lo studio del sistema immunitario. Uno dei tipi più promettenti di terapie cellulari prevede l'ingegneria genetica di nuove cellule T CAR (recettore chimerico dell'antigene) per colpire le cellule tumorali. Vi sono forti prove che suggeriscono che le proprietà metaboliche delle cellule T, ovvero il modo in cui le cellule T sostengono le richieste bioenergetiche, svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della loro funzione antitumorale e determinano l'efficacia delle immunoterapie basate sulle cellule T. Le cellule T subiscono una serie di cambiamenti nel loro fenotipo metabolico durante l'attivazione e la differenziazione in cellule effettrici e di memoria, che sono fondamentali per il mantenimento della funzione delle cellule T. Le cellule T naïve sono in uno stato quiescente, con basse richieste metaboliche sostenute principalmente dalla respirazione mitocondriale. La stimolazione dell'antigene induce l'uscita dallo stato di quiescenza, un rapido aumento dell'assorbimento dei nutrienti, un aumento del metabolismo anabolico e la riprogrammazione del metabolismo mitocondriale. Questi cambiamenti metabolici sono fondamentali per supportare la rapida proliferazione e differenziazione delle cellule T per produrre citochine o molecole che attivano la citotossicità. Dopo aver eliminato con successo lo stimolo antigenico, le rimanenti cellule T di memoria differenziata tornano ad un fenotipo più quiescente supportato principalmente dall'attività mitocondriale e dall'elevata capacità respiratoria di riserva (SRC). In condizioni di stimolazione cronica o in un ambiente metabolicamente ristretto, le cellule T possono diventare metabolicamente disfunzionali - uno stato noto come esaurimento delle cellule T - in cui le cellule T mostrano una ridotta capacità bioenergetica mitocondriale e funzione effettrice (Figura 1). A causa del forte impatto della modulazione metabolica nel destino e nella funzione delle cellule T, la determinazione delle firme metaboliche di CAR-T e di altre terapie adottive delle cellule T può svolgere un ruolo cruciale nella definizione della persistenza delle cellule T e della funzione antitumorale. Inoltre, la modulazione o riprogrammazione delle vie metaboliche delle cellule T può essere utilizzata come strategia per migliorare l'efficienza antitumorale delle cellule T.
La caratterizzazione completa delle vie bioenergetiche sia glicolitiche che mitocondriali nelle cellule T nelle diverse fasi della vita delle cellule T, così come le informazioni sugli adattamenti metabolici a diversi ambienti cellulari o segnali di stress, sono risultati critici per ottimizzare le terapie delle cellule T e migliorare la potenza antitumorale di prodotti immunoterapici. Progettata per interrogare simultaneamente la funzione glicolitica e mitocondriale nelle cellule vive, la tecnologia Agilent Seahorse XF è una delle principali piattaforme utilizzate per studiare il metabolismo delle cellule immunitarie e contribuisce in modo determinante all'attuale comprensione dell'immunometabolismo e al riconoscimento del ruolo fondamentale dei cambiamenti metabolici che si verificano durante l'attivazione e la differenziazione delle cellule T. Questa nota applicativa presenta il nuovo kit Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling, progettato per consentire l'acquisizione simultanea di robuste misurazioni dell'attività glicolitica e mitocondriale nelle popolazioni di cellule T combinate con la capacità respiratoria mitocondriale. Queste misurazioni forniscono una caratterizzazione completa del profilo metabolico delle cellule T da un singolo test e possono essere utilizzate per correlare con l'aumento o la diminuzione della funzione antitumorale dei prodotti della terapia con cellule T. L'ottenimento di queste misurazioni può essere particolarmente prezioso durante i processi di sviluppo della terapia mirati a migliorare la persistenza delle cellule T o evitare l'esaurimento metabolico dopo l'attivazione nel microambiente tumorale.
Lo sviluppo delle immunoterapie cellulo-mediate ha rivoluzionato la ricerca sul cancro e lo studio del sistema immunitario. Uno dei tipi più promettenti di terapie cellulari prevede l'ingegneria genetica di nuove cellule T CAR (recettore chimerico dell'antigene) per colpire le cellule tumorali. Vi sono forti prove che suggeriscono che le proprietà metaboliche delle cellule T, ovvero il modo in cui le cellule T sostengono le richieste bioenergetiche, svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della loro funzione antitumorale e determinano l'efficacia delle immunoterapie basate sulle cellule T. Le cellule T subiscono una serie di cambiamenti nel loro fenotipo metabolico durante l'attivazione e la differenziazione in cellule effettrici e di memoria, che sono fondamentali per il mantenimento della funzione delle cellule T. Le cellule T naïve sono in uno stato quiescente, con basse richieste metaboliche sostenute principalmente dalla respirazione mitocondriale. La stimolazione dell'antigene induce l'uscita dallo stato di quiescenza, un rapido aumento dell'assorbimento dei nutrienti, un aumento del metabolismo anabolico e la riprogrammazione del metabolismo mitocondriale. Questi cambiamenti metabolici sono fondamentali per supportare la rapida proliferazione e differenziazione delle cellule T per produrre citochine o molecole che attivano la citotossicità. Dopo aver eliminato con successo lo stimolo antigenico, le rimanenti cellule T di memoria differenziata tornano ad un fenotipo più quiescente supportato principalmente dall'attività mitocondriale e dall'elevata capacità respiratoria di riserva (SRC). In condizioni di stimolazione cronica o in un ambiente metabolicamente ristretto, le cellule T possono diventare metabolicamente disfunzionali - uno stato noto come esaurimento delle cellule T - in cui le cellule T mostrano una ridotta capacità bioenergetica mitocondriale e funzione effettrice (Figura 1). A causa del forte impatto della modulazione metabolica nel destino e nella funzione delle cellule T, la determinazione delle firme metaboliche di CAR-T e di altre terapie adottive delle cellule T può svolgere un ruolo cruciale nella definizione della persistenza delle cellule T e della funzione antitumorale. Inoltre, la modulazione o riprogrammazione delle vie metaboliche delle cellule T può essere utilizzata come strategia per migliorare l'efficienza antitumorale delle cellule T.
Effettore Memoria naïve
Stimolazione cronica/ambiente inibitorio
Esaurimento Cellula T esausta
Cellula T memoria Cellula T naïve Cellula TE attivata APR SRC APR SRC APR SRC APR SRC Tempo di intervento Glicolisi: rapporto OXPHOS Figura 1. I fondamenti del metabolismo energetico delle cellule T con misurazioni della cellula T fenotipi metabolici, che illustrano una relazione tra il rapporto glicolisi/OXPHOS ed il destino, la forma fisica e la funzione delle cellule. Sotto stimolazione cronica od in presenza di un ambiente inibitorio come il microambiente tumorale, le cellule T possono svilupparsi in un fenotipo esaurito con funzione mitocondriale compromessa. La caratterizzazione completa delle vie bioenergetiche sia glicolitiche che mitocondriali nelle cellule T nelle diverse fasi della vita delle cellule T, così come le informazioni sugli adattamenti metabolici a diversi ambienti cellulari o segnali di stress, sono risultati critici per ottimizzare le terapie delle cellule T e migliorare la potenza antitumorale di prodotti immunoterapici. Progettata per interrogare simultaneamente la funzione glicolitica e mitocondriale nelle cellule vive, la tecnologia Agilent Seahorse XF è una delle principali piattaforme utilizzate per studiare il metabolismo delle cellule immunitarie e contribuisce in modo determinante all'attuale comprensione dell'immunometabolismo ed al riconoscimento del ruolo fondamentale dei cambiamenti metabolici che si verificano durante l'attivazione e la differenziazione delle cellule T.3,4 Questa nota applicativa presenta il nuovo kit Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling, progettato per consentire l'acquisizione simultanea di robuste misurazioni dell'attività glicolitica e mitocondriale nelle popolazioni di cellule T combinate con la capacità respiratoria mitocondriale. Queste misurazioni forniscono una caratterizzazione completa del profilo metabolico delle cellule T da un singolo test e possono essere utilizzate per correlare con l'aumento o la diminuzione della funzione antitumorale dei prodotti della terapia con cellule T. L'ottenimento di queste misurazioni può essere particolarmente prezioso durante i processi di sviluppo della terapia mirati a migliorare la persistenza delle cellule T o evitare l'esaurimento metabolico dopo l'attivazione nel microambiente tumorale.
Revisione delle prestazioni del disaccoppiatore mitocondriale utilizzato nelle cellule T
Introduzione
Lo studio della funzione mitocondriale nelle cellule T utilizzando il test Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test combinato con gli analizzatori Agilent Seahorse XF ha fornito le conoscenze fondamentali sul metabolismo energetico delle cellule T e sul suo ruolo nel dirigere il destino e la funzione delle cellule T . Agilent XF Cell Mito Stress Test Kit combina una serie di reagenti che consentono una caratterizzazione completa della funzione mitocondriale. In particolare, iniezioni sequenziali di un inibitore dell'ATP sintasi (oligomicina), un disaccoppiante mitocondriale (carbonilcianuro p-(trifluorometossi)fenilidrazone, FCCP) e un inibitore mitocondriale (miscela di rotenone e antimicina A (rot/AA)) consentono il calcolo in cellule del tasso di consumo di ossigeno accoppiato alla produzione di ATP mitocondriale (respirazione legata all'ATP), la respirazione massimale disaccoppiata e l'SRC, ovvero la differenza tra respirazione basale e capacità respiratoria massimale. Questi parametri sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la funzione mitocondriale di diverse popolazioni di cellule T e per descrivere i processi che migliorano la potenza antitumorale delle cellule T. Tuttavia, nonostante l'ampia adozione di questo test nel campo dell'immunometabolismo, il suo utilizzo nelle cellule T presenta alcune sfide, principalmente a causa dell'uso del disaccoppiatore protonoforo FCCP.
Ci sono diversi motivi per cui l'uso di FCCP con le cellule T (e potenzialmente altre cellule immunitarie) non è l'ideale. Innanzitutto, la concentrazione ottimale di FCCP varia a seconda di molti fattori, tra cui il tipo di cellula immunitaria, lo stadio di differenziazione, il donatore e lo stato della malattia. Se la sua concentrazione non è titolata o ottimizzata per ogni singolo esperimento, può portare ad una sottostima della capacità respiratoria massima. In secondo luogo, nei linfociti T naïve ed in alcuni altri linfociti T differenziati, il tasso di consumo di ossigeno (OCR) dopo l'esposizione a FCCP non è stabile, determinando un'elevata variazione nelle dimensioni e potenzialmente una sottostima della capacità respiratoria massima. Inoltre, l'uso di FCCP nell'XF Cell Mito Stress Test limita la capacità del test di fornire misure quantitative dell'attività glicolitica che è il tasso di produzione di ATP glicolitico (glicoATP). Il calcolo del tasso di produzione di glicoATP utilizzando le misurazioni ECAR (tasso di acidificazione extracellulare) di Seahorse XF richiede la correzione dal contributo di CO2 che viene valutato utilizzando misurazioni OCR basali e OCR dopo l'aggiunta di rot/AA. Tuttavia, quando FCCP viene utilizzato prima di rot/AA nel dosaggio , può portare ad una sottostima del contributo di CO2 e alla quantificazione dell'impatto dell'attività glicolitica. Ciò è particolarmente importante nelle cellule che sono altamente ossidative, cioè cellule che si basano principalmente sulla fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) per l'energia, dove il contributo di CO2 all'ECAR non è trascurabile. La valutazione simultanea del tasso di produzione di ATP mitocondriale (mitoATP) e dei tassi di produzione di glicoATP consente di caratterizzare la domanda energetica cellulare basale (cioè il tasso di produzione cellulare totale di ATP) e l'equilibrio metabolico basale (cioè il rapporto tra i tassi di produzione di glicoATP e mitoATP). Questi sono parametri critici per determinare il destino e la funzione delle cellule T. tuttavia, non sono forniti dall'XF Cell Mito Stress Test, risultando in una caratterizzazione incompleta della bioenergetica delle cellule T.
Sviluppo del nuovo kit Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling
Per consentire l'acquisizione simultanea di misurazioni bioenergetiche accurate, coerenti e quantitative per l'attività glicolitica e mitocondriale nelle popolazioni di cellule T, è stato sviluppato il kit Agilent Seahorse XF T Cell Metabolic Profiling. Questo kit consente misurazioni accurate della massima capacità respiratoria nelle cellule T utilizzando il disaccoppiatore BAM15 ((2-fluorofenil){6-[(2-fluorofenil)ammino] (1,2,5-ossadiazolo[3,4-e] pirazin-5-il)}ammina). BAM15 è un nuovo disaccoppiatore segnalato per avere una potenza simile a FCCP ma con minore citotossicità e minore affinità per la membrana plasmatica, risultando in un intervallo efficace più ampio.9 Come mostrato nelle figure da 2A a 2C (linee rosse), quando vengono testate le cellule T naïve con XF Cell Mito Stress Test Kit, il tasso di variazione del livello di O2 durante i tre minuti della misurazione dello strumento dopo l'iniezione di FCCP non è costante o lineare, con conseguenti calcoli OCR variabili e sottostima della respirazione massimale (Figure da 2D a 2F, linee rosse ). Inoltre, potrebbe esserci una significativa sovrastima dell'OCR dopo l'iniezione rot/AA, come indicato dal confronto delle tracce cinetiche ottenute con l'iniezione FCCP o con l'iniezione del veicolo (Figura 2D, traccia rossa o blu). Tuttavia, quando si utilizza il disaccoppiatore BAM15 al posto di FCCP, si ottiene un aumento stabile dell'OCR dopo l'iniezione di BAM15 (figure da 2A a 2C, linee verdi), con conseguente determinazione più accurata e precisa della respirazione massimale (figure da 2D a 2F, linee verdi linee).
Questi test preliminari sono stati seguiti da ulteriori esperimenti utilizzando cellule CD4+ naïve umane, CD8+ naïve umane, PBMC umane e cellule T CD8+ di topo derivate dalla milza da almeno tre diversi donatori per tipo di cellula. In tutti i casi sono state eseguite titolazioni affiancate utilizzando FCCP o BAM15. Respirazione massima più elevata e deviazioni standard inferiori sono state costantemente ottenute con BAM15 come disaccoppiatore, rispetto a quelle ottenute alle concentrazioni FCCP ottimali (Figure da 3A a 3C). Gli esperimenti di titolazione hanno anche dimostrato che l'intervallo di concentrazione ottimale di BAM15 è più ampio dell'intervallo FCCP ottimale, indicando la necessità minima di ottimizzare la concentrazione del disaccoppiatore per ciascun campione quando viene utilizzato BAM15 (figure 3A e 3B, grafici a barre centrali).
I tassi di produzione di glicoATP calcolati utilizzando il kit XF T Cell Metabolic Profiling (con disaccoppiatore BAM15) sono stati confrontati anche con quelli ottenuti in esperimenti paralleli utilizzando il kit Agilent Seahorse XF Real-Time ATP Rate Assay. I risultati mostrano che non vi sono differenze significative nei tassi di produzione basale di glicoATP ottenuti da questi due kit o saggi (Figura 4).
Infine, è stato selezionato un ampio pannello di cellule T per valutare ulteriormente il kit di profilatura metabolica delle cellule T XF, dall'uomo ai topi ed includendo diversi donatori e stati di differenziazione. Sono stati eseguiti esperimenti di titolazione e i valori OCR massimi ottenuti alla concentrazione FCCP ottimale sono stati confrontati con i valori ottenuti a una singola concentrazione di BAM15 (2,5 µM) per il pannello delle cellule T (Figura 5). In tutti i casi, l'OCR massimo ottenuto con 2,5 µM BAM15 era almeno il 90% dell'OCR massimo ottenuto alla concentrazione FCCP ottimale all'interno dello stesso tipo cellulare. L'OCR massimo ottenuto con 2,5 µM di BAM15 è stato, in media, superiore del 20% rispetto al valore ottenuto con la concentrazione FCCP ottimale, a dimostrazione del fatto che il reagente BAM15 del kit può essere utilizzato a una concentrazione fissa di 2,5 µM per tutti i tipi di cellule T o richiede ottimizzazione minima.
Applicazione del kit di profilatura metabolica delle cellule T XF nell'ottimizzazione della persistenza per i prodotti per la terapia delle cellule T
Un attributo critico da considerare quando si valuta CAR-T ed altre terapie a base di cellule T adottive è la firma metabolica delle cellule, poiché svolge un ruolo cruciale nella definizione della persistenza delle cellule T e della funzione antitumorale. Infatti, è stato riportato che le cellule CAR-T che acquisiscono un fenotipo effettore con elevata attività metabolica durante l'espansione in vitro mostrano scarsa persistenza e attività antitumorale in vivo. Tuttavia, le cellule CAR-T che mostrano un'attività metabolica da bassa a media durante l'espansione in vitro ed un'elevata capacità respiratoria di riserva conferiscono una buona immunità antitumorale, caratterizzata da capacità di proliferazione potenziate, tassi più elevati di uccisione delle cellule tumorali e produzione di citochine. Diverse pubblicazioni indicano che le condizioni di espansione durante la produzione potrebbero produrre prodotti di cellule T con un fenotipo metabolico indesiderato che si traduce in una ridotta potenza in vivo. Queste pubblicazioni sottolineano anche che il condizionamento metabolico delle cellule T durante l'espansione può indurre la riprogrammazione metabolica che si traduce in un'estesa persistenza in vivo e in una migliore funzione antitumorale.
Progettato per assistere lo sviluppo della terapia delle cellule T, il kit XF T Cell Metabolic Profiling fornisce un quadro completo del profilo metabolico delle cellule T da un singolo test che include la domanda energetica basale totale, l'equilibrio metabolico basale e la capacità respiratoria di riserva - tutti i parametri sono stati precedentemente utilizzati per descrivere gli stati metabolici delle cellule T con persistenza aumentata o ridotta.10 Pertanto, è ideale per valutare e ottimizzare le condizioni di espansione delle cellule T che determinano il fenotipo metabolico desiderato per una maggiore persistenza delle cellule T. Qui, il kit XF T Cell Metabolic Profiling è stato utilizzato per valutare la composizione del mezzo di coltura cellulare (RPMI contenente 10 mM di glucosio + 10% FBS o ImmunoCult XF Medium (STEMCELL Technologies)), nonché l'aggiunta di diverse interleuchine (IL-2 o IL-15), può influire sul profilo metabolico dei prodotti delle cellule T. Precedenti studi hanno indicato che le cellule espanse in IL-15 presentano un fenotipo meno differenziato rispetto alle cellule coltivate in IL-2. In questo studio, le cellule Pan T sono state attivate da diversi donatori umani sani con biglie magnetiche coniugate con anticorpi CD3/CD28. Dopo tre giorni, le sfere magnetiche sono state rimosse e le cellule si sono espanse nelle condizioni medie indicate (Figura 6). Le cellule sono state mantenute in coltura a una densità cellulare di 1 × 106 cellule/mL, con terreno aggiornato e volume regolato ogni tre giorni. Al giorno 7, 14 e 22, i campioni sono stati prelevati e analizzati utilizzando il test XF T Cell Persistence supportato dal kit XF T Cell Metabolic Profiling seguendo le condizioni del test raccomandate.14 In primo luogo, è stato confrontato l'SRC nel corso dell'espansione cellulare. Come mostrato nella Figura 6A, al giorno 7 si osserva una differenza nell'SRC delle cellule espanse in IL-15 o IL-2, indipendentemente dal supporto di coltura cellulare utilizzato durante l'espansione. L'aumento dell'SRC delle cellule espanse in IL-15 è accentuato al giorno 22, in particolare nelle cellule coltivate nel mezzo ImmunoCult XF ottimizzato (Figura 6C). L'aumento di SRC è caratteristico del fenotipo simile alla memoria ed è stato precedentemente associato a una maggiore persistenza.
Il passaggio successivo è stato l'esame degli output aggiuntivi consentiti da questo test per una migliore caratterizzazione e miglioramento delle condizioni di espansione, che sono i tassi di produzione basale di ATP dalla glicolisi e dai mitocondri (Figura 6, due grafici inferiori in ciascun pannello). Le cellule espanse nel terreno ImmunoCult XF contenente IL-15 hanno un equilibrio metabolico più ossidativo (% di ATP inferiore dalla glicolisi) rispetto a quelle contenenti IL-2 (Figura 6, grafico in basso a destra in ciascun pannello, barre gialle rispetto a barre viola). Inoltre, le cellule espanse e differenziate nel terreno RPMI presentano una richiesta metabolica più elevata (velocità di produzione di ATP basale totale più elevata) rispetto alle cellule espanse e differenziate nel terreno ImmunoCult XF, indipendentemente dall'interleuchina utilizzata (Figura 6, grafico in basso a sinistra in ciascun pannello). L'aumento della domanda metabolica è associato al fenotipo delle cellule T effettrici. Infatti, quando l'espressione dei marcatori di superficie CCR7-A e CD45RO-A è stata analizzata utilizzando il citometro a flusso Agilent NovoCyte Advanteon, è stato osservato che le cellule espanse nel terreno ImmunoCult XF mantenevano un rapporto più elevato di CCR7-A+ /CD45RO-A+ centrale popolazione di memoria rispetto alle cellule espanse in RPMI che sono state arricchite nel fenotipo della memoria effettrice (Figura 7).
Conclusione
Questo documento presenta un saggio ottimizzato per la caratterizzazione completa del profilo metabolico delle cellule T. Il test combina l'uso dell'analizzatore XF con il kit XF T Cell Metabolic Profile, fornendo un disaccoppiatore ottimizzato che consente misurazioni robuste della respirazione massima e della capacità respiratoria di riserva nelle cellule T e l'ottimizzazione della concentrazione minima del disaccoppiatore. Inoltre, questo test consente agli utenti di ottenere informazioni quantitative sull'attività glicolitica nello stesso campione di cellule, insieme ad una misurazione unica della domanda bioenergetica delle cellule basali. Per migliorare la capacità di sviluppare e prevedere l'efficienza della terapia con cellule T, è necessario utilizzare una combinazione di strumenti ed analisi ortogonali che forniscano un set di dati completo per caratterizzare i prodotti terapeutici con cellule CAR-T. È chiaro che la caratterizzazione metabolica delle cellule T è uno degli attributi critici che devono essere analizzati per migliorare la persistenza e la potenza antitumorale dei prodotti delle cellule T. Il test XF T Cell Persistence Assay fornisce output multiparametrici che forniscono una caratterizzazione completa del profilo metabolico delle cellule T dallo stesso campione e può essere incorporato come test di routine per ottimizzare la progettazione e la produzione di terapie derivate dalle cellule T.
Da:
https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Agilent/2023/IMT%20app%20note.pdf
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