cGMP Signaling in the Neurovascular Unit—Implications for Retinal Ganglion Cell Survival in Glaucoma / Segnalazione cGMP nell'unità neurovascolare: implicazioni per la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche nel glaucoma

 cGMP Signaling in the Neurovascular Unit—Implications for Retinal Ganglion Cell Survival in Glaucoma / Segnalazione cGMP nell'unità neurovascolare: implicazioni per la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche nel glaucoma

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. The retinal neurovascular unit. The retinal NVU consists of three main cell types: neurons (retinal ganglion cells; RGCs), glial cells (including astrocytes and microglia), and vascular cells (including endothelial cells, vascular smooth muscle cells, and pericytes). / L'unità neurovascolare retinica. La NVU retinica è costituita da tre tipi di cellule principali: neuroni (cellule gangliari retiniche; RGC), cellule gliali (inclusi astrociti e microglia) e cellule vascolari (incluse cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari e periciti).

Abstract

Glaucoma is a progressive age-related disease of the visual system and the leading cause of irreversible blindness worldwide. Currently, intraocular pressure (IOP) is the only modifiable risk factor for the disease, but even as IOP is lowered, the pathology of the disease often progresses. Hence, effective clinical targets for the treatment of glaucoma remain elusive. Glaucoma shares comorbidities with a multitude of vascular diseases, and evidence in humans and animal models demonstrates an association between vascular dysfunction of the retina and glaucoma pathology. Integral to the survival of retinal ganglion cells (RGCs) is functional neurovascular coupling (NVC), providing RGCs with metabolic support in response to neuronal activity. NVC is mediated by cells of the neurovascular unit (NVU), which include vascular cells, glial cells, and neurons. Nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate (NO-cGMP) signaling is a prime mediator of NVC between endothelial cells and neurons, but emerging evidence suggests that cGMP signaling is also important in the physiology of other cells of the NVU. NO-cGMP signaling has been implicated in glaucomatous neurodegeneration in humans and mice. In this review, we explore the role of cGMP signaling in the different cell types of the NVU and investigate the potential links between cGMP signaling, breakdown of neurovascular function, and glaucoma pathology.

1. Introduction

Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide, with global prevalence of the disease estimated to surpass 100 million cases by 2040. Glaucoma describes an umbrella of optic neuropathies that lead to the progressive degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) and their axons that form the optic projection. The disease is characterized by the increased sensitivity of RGCs and their axons to intraocular pressure (IOP), with degeneration of RGCs occurring sectorially over time; i.e., from one retinotopic sector to the next. Current therapies aim to lower IOP using topical medication or surgical intervention; however, this is not effective for all patients and many progress to permanent vision loss. Moreover, a proportion of patients are normotensive, with IOPs within the typical range, and RGC axon degeneration still persists. These observations suggest that the etiology of the disease is much more complex and alternative mechanisms of pathophysiology warrant further investigation.

Glaucoma shares comorbidities with a number of systemic vascular diseases, including diastolic hypotension, diabetes, ischemic cardiac disease, peripheral vasospasm, and arterial hypertension. Advances in vascular imaging technology have provided evidence of a link between vascular dysfunction and glaucoma in both animal models and in the clinic. In normotensive glaucoma patients, vascular changes in the retina occur, the most prominent being obstruction of ocular blood flow, resulting in glaucomatous optic neuropathy. Adverse changes in blood vessel morphology that result in impaired ocular blood flow are also observed in glaucomatous retinas, irrespective of IOP level. Nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate (NO-cGMP) signaling is a primary mediator of vascular responses and has been implicated in glaucoma pathophysiology. In this review, we explore the role of cGMP signaling within the cells of the NVU and emphasize how dysfunctional cGMP signaling may lead to the breakdown of NVC evident in glaucoma. Using online literature databases such as PubMed and Web of Science, we searched combinations of terms such as “cGMP signaling”, “neurovascular”, “retina”, “retinal ganglion cell”, and “glia”, to conduct a comprehensive literature search. Initial inclusion criteria for publication date included articles from 2015 to the current date. However, highly cited earlier publications were also included if deemed an original publication of research in the field. The review herein will increase understanding of the vascular mechanisms of glaucoma and the potential role of NO-cGMP signaling, to facilitate the development of novel treatments for the disease.

2. The Retinal Neurovascular Unit and Glaucoma

The visual system has developed intricate regulatory mechanisms to fulfill the high metabolic demand of the retina. One such mechanism is neurovascular coupling (NVC), whereby an increased neuronal activity promotes signaling between cells of the neurovascular unit (NVU), resulting in increased supply of metabolites and removal of waste products by the vasculature. The retinal NVU consists of three main cell types: neurons, glial cells (including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes), and vascular cells (endothelial cells, vascular smooth muscle cells, and pericytes; Figure 1). Dysfunction in the NVU is evident in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases of the central nervous system (CNS), including Alzheimer’s Disease and Parkinson’s Disease. Such neurodegenerative diseases share many common pathophysiologies with glaucoma, and thus dysfunction in the NVU may also be a relevant mechanism of neurodegeneration of the visual system.

Vascular autoregulation and NVC mechanisms are severely compromised in glaucoma patients. Dysfunction of the NVC response to light flicker was perturbed in patients with early-stage glaucoma progression, with only moderate IOP increases. The direct effect of IOP on light-flicker-induced NVC was further tested using patients exposed to short-term induced IOP; however, no changes in NVC response were observed. The change in NVC evident in early-stage glaucoma patients could be due to reduced function of RGCs or due to the dysfunction of cells in the NVU, which remains undetectable in the clinic. Rodent models of glaucoma have been a valuable resource in trying to better understand neurovascular mechanisms of the disease. In a murine model of elevated IOP, NVC responses were perturbed at the microvascular level and involved pericyte cell networks in the retina. Specifically, elevation in IOP reduced pericyte-pericyte communication and perturbed NVC responses, suggesting that elevation in IOP directly impacts microcirculation in the retina. Local reduction of microcirculation may have a profound impact on the health of RGCs across the retina. Detection of microcirculatory changes in humans, however, remains a challenge, due to the lack of equipment with the ability to image at microcapillary resolution. Animal models of glaucoma are therefore invaluable in identifying underlying mechanisms of NVC dysfunction and may be critical in exploring vascular dysfunction in glaucoma pathology.

3. NO-cGMP Signaling in Glaucoma

The nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate (NO-cGMP) signaling pathway is integral to NVC mechanisms and is the prime mediator of vasodilation in endothelial cells. NO is produced by nitric oxide synthase enzymes in cells of the NVU in both physiological and pathophysiological conditions. NO is lipophilic and can freely traverse cellular membranes, where it binds to its primary receptor, soluble guanylate cyclase. GC1 binding of NO stimulates the production of cGMP, a second messenger capable of binding to multiple cellular protein targets such as cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs), cGMP-dependent protein kinases, and cGMP-gated ion channels. cGMP signaling is multifaceted, with the potential to exert broad effects on cellular physiology, depending upon the cellular target that it binds.

Dysfunction in cGMP signaling has been implicated in glaucoma pathophysiology in human patients and in animal models of the disease. Levels of NO and cGMP in aqueous humor and plasma are reduced in glaucoma patients. Furthermore, in a genome-wide association study (GWAS) of patients with primary open angle glaucoma (POAG), a single nucleotide polymorphism (rs11722059) located in the GUCY1A3/GUCY1B3 gene locus was significantly associated with paracentral visual field loss in female glaucoma patients [26]. GUCY1A3/GUCY1B3 encode the alpha and beta subunits of GC1, respectively. Identification of a risk variant in the GC1 gene and expression of GC1 in human and rodent ocular tissues including RGCs suggests that GC1 may have a role in the pathogenesis of glaucoma.

The role of cGMP signaling in RGC physiology and pathophysiology has been demonstrated in animal studies. In a mouse model of induced ocular hypertension (i.e., the microbead model of occlusion), increasing cGMP signaling through administration of tadalafil, a PDE inhibitor, prevented the degeneration of RGCs over time. The effects of tadalafil on RGCs were IOP-independent; i.e., tadalafil did not reduce the elevated pressure of the model, and further in vitro experiments demonstrated that cGMP was able to reduce apoptotic signaling in RGCs. Mice lacking the alpha catalytic subunit of guanylate cyclase (GC1−/−) were considered a novel murine model of POAG; the mice exhibit degeneration of RGCs with age, without large increases in IOP and an open irideocorneal angle. GC1−/− mice also develop retinal vascular dysfunction and aberrant retinal vascular morphology with age, and astrocyte morphology alterations precede vascular abnormalities. These results suggest that NO-cGMP signaling functions to maintain homeostasis in cells of the NVU, and thus the NO-cGMP pathway remains an attractive area of investigation for glaucoma. Although activation of GC and increases in cGMP signaling have been successful in experimentally lowering IOP via interaction with the trabecular meshwork and ciliary muscles, lowering IOP is not always effective in preventing glaucoma pathology, especially in glaucoma patients with IOPs in the normal range. Understanding the potential roles of cGMP signaling within the NVU will give a better understanding of how cGMP signaling can be leveraged as a novel IOP-independent therapeutic for glaucoma.

4. NO-cGMP Signaling in Vascular Cells

The vascular cells of the NVU in the brain consist of the endothelial cells, vascular smooth muscle cells, and pericytes. Nestled between the blood vessel lumen and the smooth muscle cells, the endothelium is responsible for modulation of vascular tone, thrombus formation, cell adhesion, smooth muscle proliferation, and sequestration of inflammatory factors. Within the retinal NVU, the function is similar; endothelial cells line retinal vessels responsible for RGC blood supply and smooth muscle cells control vascular tone. Critical to endothelial function is cGMP signaling; outside of the CNS, cGMP signaling plays a major role in decreasing endothelial cell permeability and is responsible for smooth muscle cell relaxation and subsequent vasodilation.

Within the NVU, NO-cGMP signaling plays a similar role in modulating vascular tone; NO produced in the endothelium acts on GC1 in smooth muscle cells, to induce vasodilation via smooth muscle relaxation (Figure 2). Moreover, cGMP is also implicated in decreasing the permeability of the endothelium of the NVU. Experimental treatment with the cGMP agonist 8-Br-cGMP decreased the permeability of an in vitro blood–brain barrier (BBB) model. Inhibition of GC1 by ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one) increased permeability, and inhibition of the cGMP-dependent protein kinase prevented the cGMP-mediated decrease in permeability. Hence, NO-cGMP signaling is critical to the vasodilation of blood vessels and in maintaining the integrity of the endothelial cell monolayer. Endothelial cell dysfunction is observed in patients with POAG; in both normotensive glaucoma (NTG) and hypertensive glaucoma patients, impairment of endothelial-cell mediated vasodilation in response to intravenous acetylcholine was evident. Taking into consideration the evident endothelial dysfunction in glaucoma and the role of NO-cGMP in endothelial permeability and function, it is possible that breakdown of NO-cGMP signaling may lead to dysfunction of endothelial cells, which may underlie vasculature-related glaucoma pathophysiology. Further studies are needed, to explore the potential link between dysfunctional NO-cGMP signaling in endothelium and glaucomatous degeneration.

Figure 2. The effects of cGMP on vascular cells of the retinal NVU. cGMP increases smooth muscle cell relaxation. In pericytes, cGMP has been shown to reduce intracellular Ca2+, decrease contractility, and increase NVC mechanisms. In endothelial cells, cGMP has been shown to increase vasodilation, while reducing endothelial cell permeability. / Gli effetti del cGMP sulle cellule vascolari della NVU retinica. cGMP aumenta il rilassamento delle cellule muscolari lisce. Nei periciti, è stato dimostrato che cGMP riduce il Ca2+ intracellulare, diminuisce la contrattilità e aumenta i meccanismi NVC. Nelle cellule endoteliali, è stato dimostrato che il cGMP aumenta la vasodilatazione, riducendo al contempo la permeabilità delle cellule endoteliali.

The vascular cells of the NVU also include pericytes; however, exploration of their role within the retinal NVU in glaucoma pathology is in its infancy compared to other cells of the retinal vasculature. Pericytes are situated in the basement membrane of microvessels and are responsible for a multitude of functions, including maintaining vascular stability, providing structural support for the blood vessels, mediating vasodilation and vasoconstriction, and BBB maintenance. The tone of pericyte-containing microvessels is largely controlled by the balance between Ca2+-mediated contractility and NO-mediated relaxation. Recently, a key role for pericytes in retinal NVC and glaucoma pathology was uncovered. The identification of inter-pericyte tunneling nanotubes (IP-TNTs) between pericyte cells in the retina led to the discovery that pericytes use IP-TNTs to coordinate vascular responses to neuronal activity across the retina. Damage to IP-TNTs in glaucoma impairs light-evoked neurovascular coupling via persistent Ca2+ influx, causing vasoconstriction. Similarly to smooth muscle cells, pericytes contract and relax to control vessel tone; however, they are also directly influenced by oxygen tension in the retina; in ischemic conditions, they become dysfunctional and fail to relax after constriction, exacerbating the lack of blood supply. Interestingly, in aged rat retinas, there is less pericyte-endothelial cell contact. Since age is a prominent risk factor for glaucoma, reduced pericyte-endothelial cell contact may predispose aged retinas to glaucomatous damage through weakened NVC. There is increasing evidence that vascular supply of blood is impaired in glaucoma. It is therefore plausible that glaucomatous RGC degeneration may be exacerbated by impaired pericyte activity, reducing blood supply and metabolic support to the cells.

The role of cGMP signaling in pericytes located outside of the CNS has been explored extensively and may provide a mechanistic link between retinal pericyte dysfunction (specifically pericyte-associated vasoconstriction and NVC breakdown) and the vascular-associated glaucomatous pathology observed in patients. In liver pericytes, exogenous NO supplementation and inhibition of cGMP breakdown via PDE inhibitor sildenafil citrate diminished the extent of endothelial dysfunction caused by contraction of active pericytes. Moreover, in the mouse brain, the GC1 inhibitor ODQ blunts the NO-induced relaxation of pericytes, decreases pericyte Ca2+ levels, and decreases whisker-pad stimulation-induced vasodilator responses in capillaries. This is consistent with the findings that pericytes mediate capillary dilation in the brain, and that pericyte-deficient mice exhibit neurovascular uncoupling, reduced oxygen supply to the brain, and metabolic stress. In retinal pericytes, Ca2+ influx, which causes pericyte contraction, can be inhibited via 8-Br-cGMP (a cGMP agonist), as well as SNP (a NO donor). It is therefore likely that NO-cGMP-mediated control of pericyte Ca2+ is related to changes in pericyte contractility and may impact retinal microvascular function. Across the vascular cells of the NVU, breakdown of NO-cGMP signaling may contribute to dysfunction in endothelial and smooth muscle-cell mediated vasodilation, endothelial monolayer permeability, and pericyte vasoactivity, all of which are pertinent to the vascular component of glaucomatous damage (Figure 2). However, further studies must refine the link between defective NO-cGMP signaling in these cells and the alterations in NVC present in glaucoma.

5. NO-cGMP Signaling in Glial Cells

The retinal glia, including astrocytes, Müller glia, and microglia, were thought to be relatively passive elements in the CNS; however, recently, it has become clear that they play a critical intermediary role between the neurons and vascular cells of the NVU. The predominant glial cells in the retina are the Müller glia (MG), which span the retinal layers, from the inner border with the vitreous humor, to the photoreceptor layer. Astrocytes are present in the superficial layer of the retina and make intimate connections between RGCs and blood vessels. Astrocytes and MG together form the blood–retinal barrier (BRB) and are integral to retinal NVC. Astrocytes play a critical role in shuttling energy resources to neurons, responding to glutamatergic activity by producing lactate and releasing it into the extracellular space, which neurons then utilize for metabolic demands. Astrocytes also regulate neurotransmitter release and re-uptake, to help maintain neuronal homeostasis. In humans, regarding glial cells, the fovea contains only MG subtypes, indicating that these cells alone are sufficient to supply the metabolic needs of the RGCs. Microglia are also resident glial cells that span multiple layers of the retina, yet their exact role in the basal NVU function of the retina is less understood compared to other glial cell types. Recently, it has been shown in the brain that microglia directly and dynamically contact endothelial, smooth muscle cells, pericytes, and astrocytes, and are able to regulate cerebral blood flow via vasoactive agents, including NO and cGMP. These results suggest that microglia, along with MG and astrocytes are important for NVC in the retina.

In glaucoma, glial dysfunction and/or activation may contribute to breakdown in NVC, rendering RGCs more susceptible to degeneration. Given their localization in the RGC layer and role in metabolic support, changes in astrocyte physiology may have a large impact on the health and physiology of RGCs. During pathological conditions in the retina, astrocytes respond robustly with gross morphological and physiological changes, which may prompt the dysfunction and degeneration of RGC axons. Important to astrocytic cellular networks is the intercellular communication via connexin proteins, which form gap junctions between astrocytes and other cells of the NVU. Changes in astrocyte morphology and connexin expression in the NVU have been demonstrated in early stages of glaucoma in animal models. Furthermore, astrocytic connexin-43 (Cx43), the most abundant connexin in astrocytes, was shown to facilitate the movement of energetic resources in the optic projection in response to injury. The role of MG and microglia in neurovascular function is less clear; however, MG undergo reactive gliosis in glaucoma, and increasing evidence supports a critical role of MG in maintenance of RGC physiology. Finally, reactive microglia in glaucoma release pro-inflammatory cytokines, triggering RGC degradation.

Examining the role of NO-cGMP signaling in the NVU may help to elucidate the relationship between glia, vascular function, and glaucoma pathology. In the CNS, decreased GC1 expression is detected in the reactive glia of post-mortem patients with neurodegenerative diseases such Alzheimer’s disease and multiple sclerosis. In cultured retinal MG, addition of cGMP analogues activates a calcium permeable, non-selective cation current via the opening of cGMP-gated channels, indicating that cGMP signaling, in part, regulates MG physiology. In the microglia, cGMP signaling pathways are involved in inflammatory gene expression. Pharmacological inhibition of GC1 prevents activation and migration of microglia to injured or inflamed sites in the CNS; recruitment can be rescued with the addition of a cGMP analog, suggesting that microglial recruitment is, at least in part, mediated by cGMP signaling.

To date, the role of NO-cGMP signaling in astrocyte function has been explored in many contexts, both within the CNS and systemically, and has been summarized in Figure 3. In cultured rat cerebellar astrocytes, cGMP directly affects the motility and morphology of cells and expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), suggesting that cGMP signaling directly modulates astrocyte physiology. In focal brain injury, inhibiting PDE increased cGMP and altered the glial inflammatory response, decreased oxidative stress and cell death, and increased angiogenesis (Figure 3). A potential role for cGMP signaling in retinal astrocyte physiology has been reported in a study using a germline GC1 alpha subunit knockout mouse [29]. In the study, GC1−/− mice that developed RGC degeneration with age were shown to have an altered retinal vascular phenotype; blood vessels in the peripheral retinal vasculature were dilated and exhibited shorter capillary branching. Interestingly, vascular changes were preceded by an increase in glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in astrocytes and changes in astrocyte morphology, specifically astrocytic matting around blood vessels and enlarged bulbous astrocytic endfeet. The effects in astrocytes may be due to reduced cGMP signaling in the astrocytes themselves; in human and rat cultured astrocytes, cGMP-PKG activity directly increases GFAP expression and RhoA inhibition, which are responsible for astrocyte morphological changes. Moreover, changes in astrocyte connexin expression have also been observed in GC1−/− mice. Cx43 is the most prevalent connexin in astrocytes, and GC1−/− mice exhibit a greater decrease in connexin-43 levels with age. Connexins are crucial in astrocyte cell communication in the NVU, and increases in pressure in vitro cause a decrease in gap-junction communication via alterations in connexin activity. cGMP/PKG activity has been shown to alter connexin activity, specifically through phosphorylation, hinting at a link between cGMP activity, connexins, and astrocyte function in the NVU. Given the aforementioned link between connexin expression and glaucoma, and the effect of cGMP levels on astrocyte connexin physiology, cGMP could be relevant to the dysfunction of the NVU observed in glaucoma.

Figure 3. The known effects of cGMP on glial cells. Red arrows represent downregulation, or negative activity, green arrows represent increased expression, or positive activity. (A) cGMP upregulates inflammatory gene expression and cell migration in microglia, (B) increases cation current within Müller cells via opening of cGMP-gated channels, and (C) decreases oxidative stress, differentially affects GFAP and Cx43 expression, and decreases Cx43 phosphorylation in astrocytes. / Gli effetti noti di cGMP sulle cellule gliali. Le frecce rosse rappresentano la downregulation o l'attività negativa, le frecce verdi rappresentano una maggiore espressione o attività positiva. (A) cGMP sovraregola l'espressione genica infiammatoria e la migrazione cellulare nella microglia, (B) aumenta la corrente cationica all'interno delle cellule di Müller attraverso l'apertura di canali cGMP-gated e (C) diminuisce lo stress ossidativo, influenza in modo differenziale l'espressione di GFAP e Cx43 e diminuisce la fosforilazione di Cx43 negli astrociti.

In cell types outside of the CNS, Cx43 expression and function is mediated by cGMP signaling. Rat mesangial cells treated with the NO donor S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) or 8-Br-cGMP increased expression of Cx43. Additionally, GC1−/− mice exhibit Cx43 phosphorylation in the intercalated disc of cardiac tissue, resulting in dysfunctional gap junction electrical conductivity. Finally, in rodent vascular smooth muscular cells, Cx43 expression increases in response to either 8-Br-cGMP treatment or BAY 41-2272, a GC1 stimulator, and PKG inhibition reverses this increase. The potential role of cGMP in astrocyte communication and gap junction function is intriguing; however, future investigations between NO-cGMP signaling and Cx43 expression in the retinal NVU are warranted.

Besides connexins, cGMP-gated channels also impart changes in astrocyte physiology that may perturb vascular function in glaucoma. cGMP-gated Ca2+ channels have been confirmed to populate the astrocytes of the rat forebrain, midbrain, and hindbrain, and are important for astrocyte function. MG also likely possess cGMP-gated Ca2+ channels. Within the endfeet of astrocytes in the NVU, Ca2+ signaling plays a critical role in maintaining the integrity of the BBB; yet, it is unknown if the cGMP-gated Ca2+ channels specifically contribute to the abnormal vascular function of astrocytes in the glaucomatous NVU. cGMP-gated Ca2+ channels in astrocytes have been investigated as a potential therapeutic target for vascular dysfunction in Alzheimer’s disease. Given that glaucoma shares many pathological commonalities with Alzheimer’s disease, investigating the putative role of cGMP-gated Ca2+ channels in retinal astrocytes in glaucoma may uncover a novel therapeutic target.

6. NO-cGMP Signaling in Retinal Neurons

In glaucoma, the degeneration of RGCs and their axons in the optic projection results in irreversible vision loss. The role of NO-cGMP signaling in RGCs appears to be multifaceted. In CNS neurons, NO-cGMP signaling is important in NVC, synaptic plasticity, and synaptic transmission. GC1 is expressed in pre- and post-synaptic terminals and in neuronal soma and spines. GC1 is also evident in RGC soma in the retina. The depolarization of neuronal membranes stimulates Ca2+ influx into RGCs, which activates neuronal nitric oxide synthase, leading to NO production and release, stimulating vasodilation in its target vascular cells via cGMP. Interestingly, GC1−/− mice develop RGC degeneration with age, and increasing availability of cGMP has a neuroprotective effect in murine glaucoma models. Furthermore, primary RGC cultures and mouse retinal explants exhibit decreased apoptotic signaling when supplemented with cGMP. Within the neuron itself, cGMP and its downstream effector PKG are key mediators for the neuroprotective effects of NO, and multiple studies have confirmed the neuroprotective effect of stimulating the NO-cGMP-PKG pathway in RGCs and in other neurons of the CNS. However, it is worth noting that activation of PKG has shown neurotoxicity, rather than neuroprotective effects, in RGCs, suggesting that alternative downstream effectors of cGMP, such as cGMP-gated channels and transcription factors, such as cAMP response element binding protein (CREB), may underpin the neuroprotective capacity of cGMP. cGMP-gated channels have been identified in RGCs and are responsible for modulation of neuron excitability. The transcription factor CREB is responsible for neuroprotective functions and is phosphorylated and activated by PKG in CNS neurons. Alternatively, cGMP, via PKG, can also modulate intracellular calcium signaling in RGCs and therefore may be responsible for limiting the neurotoxic effects to neurons of high intracellular Ca2+ levels. Since cGMP has multiple downstream effectors that may contribute to the neuroprotective effects observed in RGCs, further research is needed to distinguish the apparent neuroprotective and neurodegenerative arms of the cGMP signaling cascade.

7. Conclusions and Future Directions

Glaucoma is a devastating optic neuropathy afflicting millions worldwide, and yet the complex etiology of the disease results in the ensuing neurodegeneration not receiving effective treatment for many individuals. While the past understanding and treatment of the disease has focused on controlling IOP, the only current modifiable risk factor, recent research has elucidated a substantial contribution of retinal vasculature dysfunction to disease progression. Whether vascular dysfunction occurs early in glaucoma triggering neurodegenerative events, or whether RGC degeneration leads to the disruption of NVC remains challenging to determine.

It is clear that NO-cGMP signaling is integral to NVC between retinal neurons and the retinal vasculature and that proper cGMP signaling helps to maintain the integrity of the BRB. Interestingly, NO-cGMP signaling has additional roles in glial cell physiology and homeostasis. While we have highlighted the importance of NO-cGMP signaling in multiple cell types of the NVU and have provided evidence of dysfunctional cGMP signaling in glaucoma, a number of questions remain. Specifically, in glaucoma, how might dysfunctional NO-cGMP signaling in cells of the NVU directly contribute to RGC degeneration? Given the ubiquity of cGMP in cells of the NVU, answering this question will not be facile. Future studies implementing cell-specific knockouts or knockdowns of GC1, combined with animal models of neurodegeneration will be critical in elucidating the relationship between NO-cGMP signaling in the NVU, vascular dysfunction, and glaucoma pathology. Disentangling the specific role of NO-cGMP in cells of the NVU and the relationship to glaucomatous degradation would be indispensable in providing a more comprehensive understanding of the vascular mechanisms of the disease and help to provide effective novel therapeutic targets.

ITALIANO

Riassunto

Il glaucoma è una malattia progressiva legata all'età del sistema visivo e la principale causa di cecità irreversibile in tutto il mondo. Attualmente, la pressione intraoculare (IOP) è l'unico fattore di rischio modificabile per la malattia, ma anche quando la IOP si abbassa, la patologia della malattia spesso progredisce. Pertanto, obiettivi clinici efficaci per il trattamento del glaucoma rimangono sfuggenti. Il glaucoma condivide comorbidità con una moltitudine di malattie vascolari e le prove negli esseri umani e nei modelli animali dimostrano un'associazione tra la disfunzione vascolare della retina e la patologia del glaucoma. Parte integrante della sopravvivenza delle cellule gangliari della retina (RGC) è l'accoppiamento neurovascolare funzionale (NVC), che fornisce alle RGC un supporto metabolico in risposta all'attività neuronale. La NVC è mediata dalle cellule dell'unità neurovascolare (NVU), che includono cellule vascolari, cellule gliali e neuroni. La segnalazione dell'ossido nitrico-guanosina monofosfato ciclico (NO-cGMP) è un mediatore primario di NVC tra cellule endoteliali e neuroni, ma prove emergenti suggeriscono che la segnalazione di cGMP è importante anche nella fisiologia di altre cellule della NVU. La segnalazione NO-cGMP è stata implicata nella neurodegenerazione glaucomatosa nell'uomo e nei topi. In questa recensione, esploriamo il ruolo della segnalazione cGMP nei diversi tipi di cellule della NVU e indaghiamo sui potenziali collegamenti tra segnalazione cGMP, rottura della funzione neurovascolare e patologia del glaucoma.

Il glaucoma è la principale causa di cecità irreversibile in tutto il mondo, con una prevalenza globale stimata della malattia che supererà i 100 milioni di casi entro il 2040. Il glaucoma descrive un ombrello di neuropatie ottiche che portano alla progressiva degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni che formano la proiezione ottica. La malattia è caratterizzata dall'aumentata sensibilità delle RGC e dei loro assoni alla pressione intraoculare (IOP), con la degenerazione delle RGC che si verificano settorialmente nel tempo; cioè, da un settore retinotopico al successivo. Le attuali terapie mirano a ridurre la pressione intraoculare utilizzando farmaci topici o interventi chirurgici; tuttavia, questo non è efficace per tutti i pazienti e molti progrediscono verso la perdita permanente della vista. Inoltre, una percentuale di pazienti è normotesa, con IOP all'interno dell'intervallo tipico, e la degenerazione dell'assone RGC persiste ancora. Queste osservazioni suggeriscono che l'eziologia della malattia è molto più complessa e meccanismi alternativi di fisiopatologia richiedono ulteriori indagini.

Il glaucoma condivide comorbidità con una serie di malattie vascolari sistemiche, tra cui ipotensione diastolica, diabete, cardiopatia ischemica, vasospasmo periferico e ipertensione arteriosa. I progressi nella tecnologia di imaging vascolare hanno fornito la prova di un legame tra disfunzione vascolare e glaucoma sia nei modelli animali che nella clinica. Nei pazienti con glaucoma normoteso si verificano cambiamenti vascolari nella retina, il più importante dei quali è l'ostruzione del flusso sanguigno oculare, con conseguente neuropatia ottica glaucomatosa. Cambiamenti sfavorevoli nella morfologia dei vasi sanguigni che si traducono in una compromissione del flusso sanguigno oculare si osservano anche nelle retine glaucomatose, indipendentemente dal livello di IOP. La segnalazione dell'ossido nitrico-guanosina monofosfato ciclico (NO-cGMP) è un mediatore primario delle risposte vascolari ed è stata implicata nella fisiopatologia del glaucoma. In questa recensione, esploriamo il ruolo della segnalazione cGMP all'interno delle cellule della NVU e sottolineiamo come la segnalazione cGMP disfunzionale possa portare alla rottura della NVC evidente nel glaucoma. Utilizzando database di letteratura online come PubMed e Web of Science, abbiamo cercato combinazioni di termini come "segnalazione cGMP", "neurovascolare", "retina", "cellule gangliari retiniche" e "glia", per condurre una ricerca bibliografica completa. I criteri di inclusione iniziali per la data di pubblicazione includevano articoli dal 2015 alla data attuale. Tuttavia, sono state incluse anche pubblicazioni precedenti molto citate se ritenute una pubblicazione originale di ricerca nel campo. La revisione in questo documento aumenterà la comprensione dei meccanismi vascolari del glaucoma e del ruolo potenziale della segnalazione NO-cGMP, per facilitare lo sviluppo di nuovi trattamenti per la malattia.

2. L'Unità Neurovascolare Retinica e il Glaucoma

Il sistema visivo ha sviluppato intricati meccanismi regolatori per soddisfare l'elevata domanda metabolica della retina. Uno di questi meccanismi è l'accoppiamento neurovascolare (NVC), per cui un'aumentata attività neuronale promuove la segnalazione tra le cellule dell'unità neurovascolare (NVU), con conseguente aumento dell'offerta di metaboliti e rimozione dei prodotti di scarto da parte del sistema vascolare. La NVU retinica è costituita da tre tipi di cellule principali: neuroni, cellule gliali (inclusi astrociti, microglia e oligodendrociti) e cellule vascolari (cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari e periciti; Figura 1). La disfunzione nella NVU è evidente nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC), tra cui il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. Tali malattie neurodegenerative condividono molte fisiopatologie comuni con il glaucoma, e quindi la disfunzione nella NVU può anche essere un meccanismo rilevante di neurodegenerazione del sistema visivo.

L'autoregolazione vascolare ei meccanismi NVC sono gravemente compromessi nei pazienti affetti da glaucoma. La disfunzione della risposta NVC allo sfarfallio della luce è stata perturbata nei pazienti con progressione del glaucoma in fase iniziale, con aumenti della pressione intraoculare solo moderati. L'effetto diretto della IOP sulla NVC indotta dallo sfarfallio della luce è stato ulteriormente testato utilizzando pazienti esposti a IOP indotta a breve termine; tuttavia, non sono stati osservati cambiamenti nella risposta NVC. Il cambiamento di NVC evidente nei pazienti con glaucoma in stadio iniziale potrebbe essere dovuto alla ridotta funzionalità delle RGC o alla disfunzione delle cellule nella NVU, che rimane non rilevabile nella clinica. I modelli roditori di glaucoma sono stati una risorsa preziosa nel tentativo di comprendere meglio i meccanismi neurovascolari della malattia. In un modello murino di IOP elevata, le risposte NVC erano perturbate a livello microvascolare e coinvolgevano reti cellulari di periciti nella retina. In particolare, l'aumento della IOP ha ridotto la comunicazione pericita-pericita e le risposte NVC perturbate, suggerendo che l'aumento della IOP ha un impatto diretto sulla microcircolazione nella retina. La riduzione locale della microcircolazione può avere un profondo impatto sulla salute delle RGC attraverso la retina. La rilevazione dei cambiamenti microcircolatori negli esseri umani, tuttavia, rimane una sfida, a causa della mancanza di apparecchiature con la capacità di immagini a risoluzione microcapillare. I modelli animali di glaucoma sono quindi inestimabili nell'identificare i meccanismi alla base della disfunzione NVC e possono essere fondamentali nell'esplorazione della disfunzione vascolare nella patologia del glaucoma.

3. Segnalazione NO-cGMP nel glaucoma

La via di segnalazione dell'ossido nitrico-guanosina monofosfato ciclico (NO-cGMP) è parte integrante dei meccanismi NVC ed è il principale mediatore della vasodilatazione nelle cellule endoteliali. L'NO è prodotto dagli enzimi dell'ossido nitrico sintasi nelle cellule della NVU sia in condizioni fisiologiche che fisiopatologiche. L'NO è lipofilo e può attraversare liberamente le membrane cellulari, dove si lega al suo recettore primario, la guanilato ciclasi solubile. Il legame GC1 di NO stimola la produzione di cGMP, un secondo messaggero in grado di legarsi a più bersagli proteici cellulari come le fosfodiesterasi nucleotidiche cicliche (PDE), le protein chinasi dipendenti da cGMP e i canali ionici cGMP-dipendenti. La segnalazione cGMP è multiforme, con il potenziale per esercitare ampi effetti sulla fisiologia cellulare, a seconda del bersaglio cellulare che lega.

La disfunzione nella segnalazione cGMP è stata implicata nella fisiopatologia del glaucoma nei pazienti umani e nei modelli animali della malattia. I livelli di NO e cGMP nell'umore acqueo e nel plasma sono ridotti nei pazienti affetti da glaucoma. Inoltre, in uno studio di associazione genome-wide (GWAS) di pazienti con glaucoma primario ad angolo aperto (POAG), un polimorfismo a singolo nucleotide (rs11722059) localizzato nel locus del gene GUCY1A3/GUCY1B3 era significativamente associato alla perdita del campo visivo paracentrale nelle pazienti con glaucoma femminile. GUCY1A3/GUCY1B3 codificano rispettivamente le subunità alfa e beta di GC1. L'identificazione di una variante di rischio nel gene GC1 e l'espressione di GC1 nei tessuti oculari umani e di roditori, inclusi gli RGC, suggerisce che GC1 possa avere un ruolo nella patogenesi del glaucoma.

Il ruolo della segnalazione cGMP nella fisiologia e fisiopatologia RGC è stato dimostrato in studi sugli animali. In un modello murino di ipertensione oculare indotta (cioè il modello di occlusione a microsfere), l'aumento della segnalazione di cGMP attraverso la somministrazione di tadalafil, un inibitore della PDE, ha impedito la degenerazione delle RGC nel tempo. Gli effetti del tadalafil sugli RGC erano indipendenti dalla IOP; cioè, il tadalafil non ha ridotto la pressione elevata del modello e ulteriori esperimenti in vitro hanno dimostrato che cGMP era in grado di ridurre la segnalazione apoptotica negli RGC. I topi privi della subunità catalitica alfa della guanilato ciclasi (GC1-/-) sono stati considerati un nuovo modello murino di POAG; i topi mostrano una degenerazione delle RGC con l'età, senza grandi aumenti della IOP e un angolo irideocorneale aperto. I topi GC1−/− sviluppano anche disfunzione vascolare retinica e morfologia vascolare retinica aberrante con l'età, e le alterazioni morfologiche degli astrociti precedono le anomalie vascolari. Questi risultati suggeriscono che la segnalazione NO-cGMP funziona per mantenere l'omeostasi nelle cellule della NVU, e quindi il percorso NO-cGMP rimane un'area di indagine interessante per il glaucoma. Sebbene l'attivazione di GC e l'aumento della segnalazione di cGMP abbiano avuto successo nell'abbassare sperimentalmente la IOP attraverso l'interazione con il reticolo trabecolare e i muscoli ciliari, l'abbassamento della IOP non è sempre efficace nel prevenire la patologia del glaucoma, specialmente nei pazienti affetti da glaucoma con IOP nel range normale. Comprendere i ruoli potenziali della segnalazione cGMP all'interno della NVU fornirà una migliore comprensione di come la segnalazione cGMP può essere sfruttata come una nuova terapia indipendente dalla IOP per il glaucoma.

4. Segnalazione NO-cGMP nelle cellule vascolari

Le cellule vascolari della NVU nel cervello sono costituite da cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari e periciti. Incastonato tra il lume dei vasi sanguigni e le cellule muscolari lisce, l'endotelio è responsabile della modulazione del tono vascolare, della formazione di trombi, dell'adesione cellulare, della proliferazione della muscolatura liscia e del sequestro dei fattori infiammatori. All'interno della NVU retinica, la funzione è simile; le cellule endoteliali rivestono i vasi retinici responsabili dell'afflusso di sangue RGC e le cellule muscolari lisce controllano il tono vascolare. Fondamentale per la funzione endoteliale è la segnalazione cGMP; al di fuori del sistema nervoso centrale, la segnalazione cGMP svolge un ruolo importante nella diminuzione della permeabilità delle cellule endoteliali ed è responsabile del rilassamento delle cellule muscolari lisce e della successiva vasodilatazione.

All'interno della NVU, la segnalazione NO-cGMP svolge un ruolo simile nella modulazione del tono vascolare; L'NO prodotto nell'endotelio agisce su GC1 nelle cellule muscolari lisce, per indurre la vasodilatazione attraverso il rilassamento della muscolatura liscia (Figura 2). Inoltre, cGMP è anche implicato nella diminuzione della permeabilità dell'endotelio della NVU. Il trattamento sperimentale con l'agonista del cGMP 8-Br-cGMP ha ridotto la permeabilità di un modello di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro. L'inibizione di GC1 da parte di ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]chinoxalin-1-one) ha aumentato la permeabilità e l'inibizione della protein chinasi cGMP-dipendente ha impedito la diminuzione della permeabilità mediata da cGMP. Quindi, la segnalazione NO-cGMP è fondamentale per la vasodilatazione dei vasi sanguigni e per mantenere l'integrità del monostrato di cellule endoteliali. La disfunzione delle cellule endoteliali è osservata nei pazienti con POAG; sia nei pazienti con glaucoma normotensivo (NTG) sia in quelli con glaucoma ipertensivo, era evidente la compromissione della vasodilatazione mediata dalle cellule endoteliali in risposta all'acetilcolina per via endovenosa. Prendendo in considerazione l'evidente disfunzione endoteliale nel glaucoma ed il ruolo di NO-cGMP nella permeabilità e funzione endoteliale, è possibile che la rottura della segnalazione NO-cGMP possa portare a disfunzione delle cellule endoteliali, che possono essere alla base della fisiopatologia del glaucoma correlato alla vascolarizzazione. Sono necessari ulteriori studi per esplorare il potenziale collegamento tra la segnalazione NO-cGMP disfunzionale nell'endotelio e la degenerazione glaucomatosa.

Le cellule vascolari della NVU includono anche periciti; tuttavia, l'esplorazione del loro ruolo all'interno della NVU retinica nella patologia del glaucoma è agli inizi rispetto ad altre cellule del sistema vascolare retinico. I periciti sono situati nella membrana basale dei microvasi e sono responsabili di una moltitudine di funzioni, tra cui il mantenimento della stabilità vascolare, il supporto strutturale dei vasi sanguigni, la mediazione della vasodilatazione e della vasocostrizione e il mantenimento della BBB. Il tono dei microvasi contenenti periciti è ampiamente controllato dall'equilibrio tra contrattilità mediata da Ca2+ e rilassamento mediato da NO. Recentemente, è stato scoperto un ruolo chiave per i periciti nella NVC retinica e nella patologia del glaucoma. L'identificazione di nanotubi di tunneling inter-pericite (IP-TNT) tra le cellule di periciti nella retina ha portato alla scoperta che i periciti utilizzano IP-TNT per coordinare le risposte vascolari all'attività neuronale attraverso la retina. Il danno agli IP-TNT nel glaucoma compromette l'accoppiamento neurovascolare evocato dalla luce attraverso il persistente afflusso di Ca2+, causando vasocostrizione. Analogamente alle cellule muscolari lisce, i periciti si contraggono e si rilassano per controllare il tono dei vasi; tuttavia, sono anche direttamente influenzati dalla tensione dell'ossigeno nella retina; in condizioni ischemiche, diventano disfunzionali e non riescono a rilassarsi dopo la costrizione, esacerbando la mancanza di afflusso di sangue. È interessante notare che nelle retine di ratto invecchiato c'è meno contatto tra cellule endoteliali e periciti. Poiché l'età è un importante fattore di rischio per il glaucoma, il ridotto contatto tra periciti e cellule endoteliali può predisporre le retine invecchiate al danno glaucomatoso attraverso l'indebolimento della NVC. C'è una crescente evidenza che l'apporto vascolare di sangue è compromesso nel glaucoma. È quindi plausibile che la degenerazione glaucomatosa del RGC possa essere esacerbata da una ridotta attività dei periciti, riducendo l'afflusso di sangue e il supporto metabolico alle cellule.

Il ruolo della segnalazione cGMP nei periciti situati al di fuori del sistema nervoso centrale è stato ampiamente esplorato e può fornire un collegamento meccanicistico tra la disfunzione del pericito retinico (in particolare la vasocostrizione associata al pericito e la rottura del NVC) e la patologia glaucomatosa associata ai vasi osservata nei pazienti. Nei periciti epatici, l'integrazione esogena di NO e l'inibizione della degradazione del cGMP tramite l'inibitore della PDE sildenafil citrato ha ridotto l'entità della disfunzione endoteliale causata dalla contrazione dei periciti attivi. Inoltre, nel cervello del topo, l'inibitore GC1 ODQ attenua il rilassamento dei periciti indotto da NO, diminuisce i livelli di Ca2+ nei periciti e diminuisce le risposte vasodilatatorie indotte dalla stimolazione dei baffi nei capillari. Ciò è coerente con i risultati secondo cui i periciti mediano la dilatazione capillare nel cervello e che i topi con carenza di periciti mostrano disaccoppiamento neurovascolare, ridotto apporto di ossigeno al cervello e stress metabolico. Nei periciti retinici, l'afflusso di Ca2+, che causa la contrazione dei periciti, può essere inibito tramite 8-Br-cGMP (un agonista del cGMP), così come SNP (un donatore di NO). È quindi probabile che il controllo mediato da NO-cGMP del Ca2+ dei periciti sia correlato ai cambiamenti nella contrattilità dei periciti e possa avere un impatto sulla funzione microvascolare retinica. Attraverso le cellule vascolari della NVU, la rottura della segnalazione NO-cGMP può contribuire alla disfunzione nella vasodilatazione endoteliale e mediata dalle cellule muscolari lisce, nella permeabilità del monostrato endoteliale e nella vasoattività del pericito, tutte pertinenti alla componente vascolare del danno glaucomatoso (Figura 2). Tuttavia, ulteriori studi devono affinare il legame tra la segnalazione NO-cGMP difettosa in queste cellule e le alterazioni nella NVC presenti nel glaucoma.

5. Segnalazione NO-cGMP nelle cellule gliali

Si pensava che la glia retinica, compresi gli astrociti, la glia di Müller e la microglia, fossero elementi relativamente passivi nel sistema nervoso centrale; tuttavia, recentemente, è diventato chiaro che svolgono un ruolo intermedio fondamentale tra i neuroni e le cellule vascolari della NVU. Le cellule gliali predominanti nella retina sono la Müller glia (MG), che attraversano gli strati retinici, dal bordo interno con l'umor vitreo, allo strato dei fotorecettori. Gli astrociti sono presenti nello strato superficiale della retina e creano connessioni intime tra RGC e vasi sanguigni. Astrociti e MG insieme formano la barriera emato-retinica (BRB) e sono parte integrante della NVC retinica. Gli astrociti svolgono un ruolo fondamentale nel trasferire le risorse energetiche ai neuroni, rispondendo all'attività glutammatergica producendo lattato e rilasciandolo nello spazio extracellulare, che i neuroni utilizzano quindi per le richieste metaboliche. Gli astrociti regolano anche il rilascio e la ricaptazione dei neurotrasmettitori, per aiutare a mantenere l'omeostasi neuronale. Nell'uomo, per quanto riguarda le cellule gliali, la fovea contiene solo sottotipi MG, indicando che queste cellule da sole sono sufficienti a soddisfare le esigenze metaboliche delle RGC.

Le microglia sono anche cellule gliali residenti che si estendono su più strati della retina, tuttavia il loro ruolo esatto nella funzione NVU basale della retina è meno compreso rispetto ad altri tipi di cellule gliali. Recentemente, è stato dimostrato nel cervello che le microglia contattano direttamente e dinamicamente le cellule endoteliali, muscolari lisce, i periciti e gli astrociti e sono in grado di regolare il flusso sanguigno cerebrale tramite agenti vasoattivi, tra cui NO e cGMP. Questi risultati suggeriscono che la microglia, insieme a MG e astrociti, sono importanti per NVC nella retina.

Nel glaucoma, la disfunzione e/o l'attivazione gliale può contribuire alla rottura della NVC, rendendo le RGC più suscettibili alla degenerazione. Data la loro localizzazione nello strato RGC e il ruolo nel supporto metabolico, i cambiamenti nella fisiologia degli astrociti possono avere un grande impatto sulla salute e sulla fisiologia degli RGC. Durante le condizioni patologiche nella retina, gli astrociti rispondono in modo robusto con cambiamenti morfologici e fisiologici grossolani, che possono provocare la disfunzione e la degenerazione degli assoni RGC. Importante per le reti cellulari astrocitiche è la comunicazione intercellulare tramite le proteine connessine, che formano giunzioni tra astrociti e altre cellule della NVU. I cambiamenti nella morfologia degli astrociti e nell'espressione della connessina nella NVU sono stati dimostrati nelle prime fasi del glaucoma in modelli animali . Inoltre, la connessina astrocitica-43 (Cx43), la connessina più abbondante negli astrociti, ha dimostrato di facilitare il movimento delle risorse energetiche nella proiezione ottica in risposta al danno. Il ruolo di MG e microglia nella funzione neurovascolare è meno chiaro; tuttavia, la MG subisce gliosi reattiva nel glaucoma e prove crescenti supportano un ruolo critico della MG nel mantenimento della fisiologia RGC. Infine, le microglia reattive nel glaucoma rilasciano citochine pro-infiammatorie, innescando la degradazione delle RGC.

Esaminare il ruolo della segnalazione NO-cGMP nella NVU può aiutare a chiarire la relazione tra glia, funzione vascolare e patologia del glaucoma. Nel sistema nervoso centrale, viene rilevata una ridotta espressione di GC1 nella glia reattiva di pazienti post mortem con malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla. Nella MG retinica in coltura, l'aggiunta di analoghi del cGMP attiva una corrente cationica non selettiva, permeabile al calcio, attraverso l'apertura di canali controllati dal cGMP, indicando che la segnalazione del cGMP, in parte, regola la fisiologia della MG. Nella microglia, le vie di segnalazione cGMP sono coinvolte nell'espressione genica infiammatoria. L'inibizione farmacologica di GC1 previene l'attivazione e la migrazione della microglia verso siti feriti o infiammati nel sistema nervoso centrale; il reclutamento può essere salvato con l'aggiunta di un analogo cGMP, suggerendo che il reclutamento microgliale è, almeno in parte, mediato dalla segnalazione cGMP.

Ad oggi, il ruolo della segnalazione NO-cGMP nella funzione degli astrociti è stato esplorato in molti contesti, sia all'interno del sistema nervoso centrale che a livello sistemico, ed è stato riassunto nella Figura 3. Negli astrociti cerebellari di ratto in coltura, il cGMP influenza direttamente la motilità e la morfologia delle cellule e l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP), suggerendo che la segnalazione cGMP modula direttamente la fisiologia degli astrociti. Nella lesione cerebrale focale, l'inibizione della PDE aumentava il cGMP e alterava la risposta infiammatoria gliale, diminuiva lo stress ossidativo e la morte cellulare e aumentava l'angiogenesi (Figura 3). Un potenziale ruolo per la segnalazione cGMP nella fisiologia degli astrociti retinici è stato riportato in uno studio che utilizzava un topo knockout della subunità alfa GC1 della linea germinale. Nello studio, i topi GC1−/− che hanno sviluppato la degenerazione RGC con l'età hanno dimostrato di avere un fenotipo vascolare retinico alterato; i vasi sanguigni nella vascolarizzazione retinica periferica erano dilatati e mostravano una ramificazione capillare più corta. È interessante notare che i cambiamenti vascolari sono stati preceduti da un aumento dell'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti e da cambiamenti nella morfologia degli astrociti, in particolare stuoia astrocitica attorno ai vasi sanguigni e estremità astrocitarie bulbose allargate. Gli effetti negli astrociti possono essere dovuti alla ridotta segnalazione di cGMP negli astrociti stessi; negli astrociti umani e in coltura di ratto, l'attività di cGMP-PKG aumenta direttamente l'espressione di GFAP e l'inibizione di RhoA, che sono responsabili dei cambiamenti morfologici degli astrociti. Inoltre, nei topi GC1−/− sono stati osservati cambiamenti nell'espressione della connessina degli astrociti. Cx43 è la connessina più diffusa negli astrociti e i topi GC1−/− mostrano una maggiore diminuzione dei livelli di connessina-43 con l'età. Le connessine sono cruciali nella comunicazione cellulare degli astrociti nella NVU e gli aumenti di pressione in vitro causano una diminuzione della comunicazione gap-junction attraverso alterazioni nell'attività della connessina.

È stato dimostrato che l'attività cGMP/PKG altera l'attività della connessina, in particolare attraverso la fosforilazione, suggerendo un legame tra attività cGMP, connessine e funzione degli astrociti nella NVU. Dato il suddetto legame tra l'espressione della connessina e il glaucoma e l'effetto dei livelli di cGMP sulla fisiologia della connessina degli astrociti, il cGMP potrebbe essere rilevante per la disfunzione della NVU osservata nel glaucoma.

Nei tipi di cellule al di fuori del sistema nervoso centrale, l'espressione e la funzione di Cx43 è mediata dalla segnalazione cGMP. Le cellule mesangiali di ratto trattate con il donatore di NO S-nitroso-N-acetilpenicillamina (SNAP) o 8-Br-cGMP hanno aumentato l'espressione di Cx43 [101]. Inoltre, i topi GC1-/- mostrano la fosforilazione di Cx43 nel disco intercalare del tessuto cardiaco, con conseguente conduttività elettrica della giunzione disfunzionale. Infine, nelle cellule muscolari lisce vascolari di roditori, l'espressione di Cx43 aumenta in risposta al trattamento con 8-Br-cGMP o BAY 41-2272, uno stimolatore di GC1, e l'inibizione di PKG inverte questo aumento. Il ruolo potenziale di cGMP nella comunicazione degli astrociti e nella funzione di giunzione del gap è intrigante; tuttavia, sono giustificate future indagini tra la segnalazione NO-cGMP e l'espressione di Cx43 nella NVU retinica.

Oltre alle connessine, i canali cGMP-gated impartiscono anche cambiamenti nella fisiologia degli astrociti che possono perturbare la funzione vascolare nel glaucoma. È stato confermato che i canali del Ca2+ controllati da cGMP popolano gli astrociti del prosencefalo, del mesencefalo e del rombencefalo di ratto e sono importanti per la funzione degli astrociti. MG probabilmente possiede anche canali Ca2+ cGMP-gated. All'interno delle estremità degli astrociti nella NVU, la segnalazione del Ca2+ svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità della BBB; tuttavia, non è noto se i canali Ca2 + cGMP-gated contribuiscano specificamente alla funzione vascolare anormale degli astrociti nella NVU glaucomatosa. I canali Ca2+ cGMP-gated negli astrociti sono stati studiati come potenziale bersaglio terapeutico per la disfunzione vascolare nella malattia di Alzheimer. Dato che il glaucoma condivide molti punti in comune patologici con il morbo di Alzheimer, lo studio del ruolo presunto dei canali del Ca2+ cGMP-gated negli astrociti retinici nel glaucoma può scoprire un nuovo bersaglio terapeutico.

6. Segnalazione NO-cGMP nei neuroni retinici

Nel glaucoma, la degenerazione degli RGC e dei loro assoni nella proiezione ottica provoca una perdita irreversibile della vista. Il ruolo della segnalazione NO-cGMP negli RGC sembra essere multiforme. Nei neuroni del SNC, la segnalazione NO-cGMP è importante nella NVC, nella plasticità sinaptica e nella trasmissione sinaptica. GC1 è espresso nei terminali pre- e post-sinaptici e nel soma neuronale e nelle spine. GC1 è anche evidente nel soma RGC nella retina. La depolarizzazione delle membrane neuronali stimola l'afflusso di Ca2+ nelle RGC, che attiva l'ossido nitrico sintasi neuronale, portando alla produzione e al rilascio di NO, stimolando la vasodilatazione nelle sue cellule vascolari bersaglio tramite cGMP. È interessante notare che i topi GC1−/− sviluppano degenerazione RGC con l'età e la crescente disponibilità di cGMP ha un effetto neuroprotettivo nei modelli murini di glaucoma. Inoltre, le colture primarie di RGC e gli espianti di retina di topo mostrano una diminuzione della segnalazione apoptotica quando integrate con cGMP. All'interno del neurone stesso, cGMP e il suo effettore a valle PKG sono mediatori chiave per gli effetti neuroprotettivi dell'NO e numerosi studi hanno confermato l'effetto neuroprotettivo della stimolazione del percorso NO-cGMP-PKG nelle RGC  e in altri neuroni del SNC. Tuttavia, vale la pena notare che l'attivazione di PKG ha mostrato neurotossicità, piuttosto che effetti neuroprotettivi, nelle RGC, suggerendo che effettori a valle alternativi del cGMP, come i canali cGMP-dipendenti e i fattori di trascrizione, come la proteina legante l'elemento di risposta cAMP (CREB), può sostenere la capacità neuroprotettiva del cGMP. I canali cGMP-gated sono stati identificati negli RGC e sono responsabili della modulazione dell'eccitabilità dei neuroni. Il fattore di trascrizione CREB è responsabile delle funzioni neuroprotettive ed è fosforilato e attivato dalla PKG nei neuroni del SNC. In alternativa, cGMP, tramite PKG, può anche modulare la segnalazione del calcio intracellulare negli RGC e quindi può essere responsabile della limitazione degli effetti neurotossici sui neuroni con alti livelli intracellulari di Ca2+. Poiché cGMP ha più effettori a valle che possono contribuire agli effetti neuroprotettivi osservati negli RGC, sono necessarie ulteriori ricerche per distinguere gli apparenti bracci neuroprotettivi e neurodegenerativi della cascata di segnali cGMP.

7. Conclusioni e orientamenti futuri

Il glaucoma è una neuropatia ottica devastante che affligge milioni di persone in tutto il mondo, eppure la complessa eziologia della malattia fa sì che la conseguente neurodegenerazione non riceva un trattamento efficace per molti individui. Mentre in passato la comprensione e il trattamento della malattia si sono concentrati sul controllo della PIO, l'unico fattore di rischio modificabile attuale, la ricerca recente ha chiarito un contributo sostanziale della disfunzione vascolare retinica alla progressione della malattia. Rimane difficile stabilire se la disfunzione vascolare si verifichi precocemente nel glaucoma innescando eventi neurodegenerativi o se la degenerazione RGC porti all'interruzione della NVC.

È chiaro che la segnalazione NO-cGMP è parte integrante della NVC tra i neuroni retinici e il sistema vascolare retinico e che una corretta segnalazione cGMP aiuta a mantenere l'integrità del BRB. È interessante notare che la segnalazione NO-cGMP ha ruoli aggiuntivi nella fisiologia e nell'omeostasi delle cellule gliali. Sebbene abbiamo evidenziato l'importanza della segnalazione NO-cGMP in più tipi di cellule della NVU e abbiamo fornito prove della segnalazione disfunzionale del cGMP nel glaucoma, rimangono alcune domande. In particolare, nel glaucoma, in che modo la segnalazione NO-cGMP disfunzionale nelle cellule della NVU può contribuire direttamente alla degenerazione RGC? Data l'ubiquità del cGMP nelle cellule della NVU, rispondere a questa domanda non sarà facile. Studi futuri che implementano knockout o knockdown specifici delle cellule di GC1, combinati con modelli animali di neurodegenerazione, saranno fondamentali per chiarire la relazione tra la segnalazione NO-cGMP nella NVU, la disfunzione vascolare e la patologia del glaucoma. Districare il ruolo specifico di NO-cGMP nelle cellule della NVU e la relazione con la degradazione glaucomatosa sarebbe indispensabile per fornire una comprensione più completa dei meccanismi vascolari della malattia e contribuire a fornire nuovi bersagli terapeutici efficaci.

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