Differentiation and functional characterization of human iPSC-derived cardiomyocytes / Differenziazione e caratterizzazione funzionale di cardiomiociti umani derivati da iPSC

 Differentiation and functional characterization of human iPSC-derived cardiomyocytes / Differenziazione e caratterizzazione funzionale di cardiomiociti umani derivati da iPSC

Segnalato dal Dott. Giuseeppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1: Impact evaluation of different seeding densities on cardiomyocyte functional performance by analyzing cardiomyocyte marker expression and the number of beating patches in culture after 8 days of differentiation. For the selected human iPSC line, the seeding density of 300,000 cells/cm² was found to be the optimal seeding density, as it resulted in high expression of cTnT and numerous beating patches in culture. / Valutazione dell'impatto di diverse densità di seeding sulle prestazioni funzionali dei cardiomiociti analizzando l'espressione dei marcatori dei cardiomiociti e il numero di patch battenti in coltura dopo 8 giorni di differenziazione. Per la linea iPSC umana selezionata, la densità di semina di 300.000 cellule/cm² è risultata essere la densità di semina ottimale, in quanto ha comportato un'elevata espressione di cTnT e numerose macchie di battitura in coltura

Background

Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cell (human iPSC) lineages is a major tool for the development of cell-based disease models, drug screening platforms, and cell therapies. Each of these applications requires a consistent, efficient, and reliable differentiation protocol that generates cells that are functionally and phenotypically consistent. The generated human iPSC-derived model must show characteristics that resemble those of the primary cells, such as morphology, gene, and protein expression, as well as functional characteristics of the primary cells. Moreover, having a standardized and reliable method for differentiation ensures comparable results with varying cell lines between experiments. In this application note, we show a detailed phenotypical and functional characterization of differentiated human iPSCs into cardiomyocytes using StemMACS CardioDiff Kit XF, human. 

Materials and methods

 • StemMACS CardioDiff Kit XF, human (130-125-289) 

• Multi Tissue Dissociation Kit 3 (130-110-204) 

• StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, human (130-125-287) 

• Inside Stain Kit (130-090-477) 

• Matrigel® coated plates 

• Cardiac Troponin T Antibody, anti-human/mouse/rat, FITC, REAfinity™ (130-119-674)

• α-Actinin (Sarcomeric) Antibody, anti-human/mouse/rat, PE, REAfinity (130-123-996) 

• Myosin Heavy Chain Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, REAfinity (130-122-968) 

• MLC2a Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, REAfinity (130-118-674) •

 MLC2v Antibody, anti-human/mouse/rat, PE, REAfinity (130-119-680) 

• REA Control Antibody (I), human IgG1, APC, REAfinity (130-120-709) 

• REA Control Antibody (I), human IgG1, FITC, REAfinity (130-118-354) 

• REA Control Antibody (I), human IgG1, PE, REAfinity (130-118-347) 

Human iPSC differentiation into cardiomyocytes 

Using StemMACS CardioDiff Kit XF, human, human iPSCs were differentiated into cardiomyocytes following the protocol. To begin, the human iPSCs were seeded as single cells on Matrigel® coated plates in Mesoderm Induction Medium from the kit. Four different cell densities were used: 125,000 cells/cm²; 250,000 cells/cm²; 300,000 cells/cm²; and 400,000 cells/cm². On day 1, cells were maintained in Cardiac Cultivation Medium, on day 2 media was switched to Cardiac Induction Medium, and from day 3 to 8 changed back to Cardiac Cultivation Medium with daily media changes. 

Cell harvest 

The content of 3 wells in a 12-well plate were harvested using the Multi Tissue Dissociation Kit 3. The enzyme mix was prepared by mixing Enzyme T and Buffer X (Multi Tissue Dissociation Kit 3) in a 1:10 ratio, with 400 µL of the mix then added to each well. After 10 minutes of incubation at 37 °C, the reaction was stopped by adding 600 µL of StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, human containing 20% fetal calf serum (FCS) to each well. 

Cells were dislodged by gently pipetting up and down using a 1 mL pipette and applied to a 100 µm cell strainer. To increase cell yield, both the wells and strainer were further washed with 1 mL StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, human containing 20% FCS. 

Flow cytometry analysis 

A total of 1.54×10⁷ cells with a viability of 89% were harvested. Cells were resuspended in Inside Fix Solution (Inside Stain Kit) and incubated in the dark for 20 minutes at room temperature. Cells were then collected by centrifugation (at 300×g for 5 min), resuspended in 1 mL PEB (DPBS [-/-], 0.5% BSA, and 2mM EDTA), and collected again after a second centrifugation (at 300×g for 5 min). The samples for the isotype controls were obtained by resuspending the cells in 98 µL Inside Perm solution (Inside Stain Kit) plus 2 µL of the appropriate REA Control Antibody. Additionally, the samples for the double stain were obtained by resuspending the cells in 96 µL Inside Perm solution plus 2 µL of each antibody. After 10 minutes of incubation at room temperature, 1 mL of Inside Perm solution was added and samples were centrifuged (at 300×g for 5 min). The pellet was resuspended in 500 µL of PEB buffer and analyzed using BD FACSCalibur™. 

Exposure to cardiotropic compounds 

Human iPSC-derived cardiomyocytes were treated with 30 mM isoproterenol or 30 mM propranolol in the StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, human. Cells were visually monitored and beatings per minute were manually scored.

Results

Human iPSCs were successfully differentiated into cardiomyocytes with the first visible beating patches at day 7. After 8 days of differentiation, human iPSC-derived cells showed changes in morphology, protein expression, and beating properties comparable to cardiomyocyte fatespecification. The extent of such change was, as expected, dependent on the initial seeding density. Establishing the most successful seeding density for differentiation is vital when differentiating a human iPSC line for the first time into cardiomyocytes. This is then used to set starting cell numbers for future differentiation rounds. For the selected Human iPSC line, a high seeding density of 300,000 cells/cm² resulted in the best functional performance. Human iPSC-derived cardiomyocytes from high cell density wells showed wave-like beating patterns through the whole well. Furthermore, the cells showed a high expression of the cardiomyocyte marker, cardiac muscle troponin T (cTnT) (fig.1). Furthermore, human iPSC-derived cardiomyocytes showed expression of additional markers typical of cardiac fate, such as α-actinin and myosin heavy chain (MHC). Moreover, the higher cell expression of the atrial isoform of myosin regulatory light chain 2 (MLC2a) (27.3%) versus the lower expression of the ventricular isoform (MLC2v) (0.48%), indicated that cells started to express atrial-like characteristics just after 8 days of differentiation. (fig. 2).

Figure 2: Flow cytometry analysis showed a high expression of cardiac markers in human iPSC-derived cardiomyocytes after only 8 days of differentation using the StemMACS CardioDiff Kit XF, human. 53% of cells expressed both cTnT and α-actinin while 49.7% were positive for both cTnT and MHC. Furthermore, 27.3% of the cells expressed the atrial isoform (MLC2a), whereas only 0.48% of the cells expressed the ventricular isoform (MLC2v). / L'analisi della citometria a flusso ha mostrato un'elevata espressione di marcatori cardiaci nei cardiomiociti umani derivati da iPSC dopo soli 8 giorni di differenziazione utilizzando il kit StemMACS CardioDiff XF, umano. Il 53% delle cellule esprimeva sia cTnT che α-actinina mentre il 49,7% era positivo sia per cTnT che per MHC. Inoltre, il 27,3% delle cellule esprimeva l'isoforma atriale (MLC2a), mentre solo lo 0,48% delle cellule esprimeva l'isoforma ventricolare (MLC2v).

 Human iPSC-derived cardiomyocytes expressed cardiac associated marker while losing pluripotency marker expression Gene expression analysis showed a high expression of cardiac muscle troponin T (TNNT2) after 8 days of differentiation which was accompanied by a complete loss of expression of the pluripotency-associated marker POU5F1 (POU Class 5 Homeobox 1, OCT4). These results demonstrated the absence of undifferentiated human iPSCs in the wells that underwent differentiation with StemMACS CardioDiff Kit XF, human (fig. 3). 

Human iPSC-derived cardiomyocytes respond to treatment with cardiotropic compounds by altering their beating frequency Functional human iPSC-derived cardiomyocytes must show contractile properties and be able to react to external stimuli in a similar fashion to the primary cells. To evaluate their functionality, the iPSC-derived cardiomyocytes were exposed to two well-known cardiotropic compounds: isoproterenol and propranolol. Isoproterenol, also known as isoprenaline, is a medication used for the treatment of bradycardia (slow heart rate) and induces an increase in beating frequency.

 Conversely, propranolol opposes this effect, slowing down beat frequency. 

Human iPSC-derived cardiomyocytes exposed to 30 mM isoproterenol or 30 mM propranolol responded by modifying their beating patterns accordingly compared to the control, in line with the expected effects of the compounds (fig. 4).

Figure 3: Gene expression analysis showed a high expression of the stem cell-specific marker OCT4 in undifferentiated human iPSCs which, as expected, was lost after differentiation. Moreover, expression of the cardiac marker TNNT2 increased after just 8 days of differentiation using the StemMACS CardioDiff Kit XF, human within human iPSCderived cardiomyocytes. / L'analisi dell'espressione genica ha mostrato un'elevata espressione del marcatore specifico delle cellule staminali OCT4 in iPSC umane indifferenziate che, come previsto, è stato perso dopo la differenziazione. Inoltre, l'espressione del marcatore cardiaco TNNT2 è aumentata dopo soli 8 giorni di differenziazione utilizzando il kit StemMACS CardioDiff XF, umano all'interno di cardiomiociti derivati da iPSC umani.

Figure 4: Human iPSC-derived cardiomyocytes responded to cardiotropic compounds by modifying their beating patterns. / I cardiomiociti umani derivati da iPSC hanno risposto ai composti cardiotropici modificando i loro schemi di battito

Conclusions

 Human iPSC lines differentiated with StemMACS CardioDiff Kit XF, human show: 

• gene and protein expression typical of cardiomyocytes; 

• absence of remnant undifferentiated human iPSCs; and

 • appropriate beating responses to treatment with cardiotropic compounds. 

Combined, these results suggest the good quality of the human iPSC-derived cellular model generated.

ITALIANO

Conoscenza di fondo

La differenziazione diretta dei lignaggi di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC umane) è uno strumento importante per lo sviluppo di modelli di malattie cellulari, piattaforme di screening dei farmaci e terapie cellulari. Ognuna di queste applicazioni richiede un protocollo di differenziazione coerente, efficiente ed affidabile che generi cellule funzionalmente e fenotipicamente coerenti. Il modello derivato da iPSC umano generato deve mostrare caratteristiche che assomigliano a quelle delle cellule primarie, come la morfologia, l'espressione genica e proteica, nonché le caratteristiche funzionali delle cellule primarie. Inoltre, disporre di un metodo standardizzato ed affidabile per la differenziazione garantisce risultati comparabili con diverse linee cellulari tra gli esperimenti. In questa nota applicativa, mostriamo una caratterizzazione fenotipica e funzionale dettagliata di iPSC umane differenziate in cardiomiociti utilizzando StemMACS CardioDiff Kit XF, umano.

Materiali e metodi

  • Kit StemMACS CardioDiff XF, umano (130-125-289)

• Kit di dissociazione multitessuto 3 (130-110-204)

• StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, umano (130-125-287)

• Kit colorazione interna (130-090-477)

• Piastre rivestite in Matrigel®

• Anticorpo Cardiac Troponin T, anti-umano/topo/ratto, FITC, REAfinity™ (130-119-674)

• Anticorpo α-actinina (sarcomerico), anti-umano/topo/ratto, PE, REAfinity (130-123-996)

• Myosin Heavy Chain Antibody, anti-umano/topo/ratto, APC, REAfinity (130-122-968)

• Anticorpo MLC2a, anti-umano/topo/ratto, APC, REAfinity (130-118-674) •

  Anticorpo MLC2v, anti-umano/topo/ratto, PE, REAfinity (130-119-680)

• Anticorpo di controllo REA (I), IgG1 umana, APC, REAfinity (130-120-709)

• Anticorpo di controllo REA (I), IgG1 umana, FITC, REAfinity (130-118-354)

• Anticorpo di controllo REA (I), IgG1 umana, PE, REAfinity (130-118-347)

Differenziazione iPSC umana in cardiomiociti

Utilizzando StemMACS CardioDiff Kit XF, le iPSC umane umane sono state differenziate in cardiomiociti seguendo il protocollo. Per iniziare, le iPSC umane sono state seminate come singole cellule su piastre rivestite con Matrigel® in Mesoderm Induction Medium dal kit. Sono state utilizzate quattro diverse densità cellulari: 125.000 cellule/cm²; 250.000 cellule/cm²; 300.000 cellule/cm²; e 400.000 cellule/cm². Il giorno 1, le cellule sono state mantenute in Cardiac Cultivation Medium, il giorno 2 i media sono stati passati a Cardiac Induction Medium e dal giorno 3 all'8 sono tornati a Cardiac Cultivation Medium con cambi giornalieri di media.

Raccolta cellulare

Il contenuto di 3 pozzetti in una piastra da 12 pozzetti è stato raccolto utilizzando il Multi Tissue Dissociation Kit 3. La miscela enzimatica è stata preparata mescolando l'enzima T e il tampone X (Multi Tissue Dissociation Kit 3) in un rapporto 1:10, con 400 µL della miscela quindi aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo 10 minuti di incubazione a 37°C, la reazione è stata interrotta aggiungendo 600 µL di StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, human contenente il 20% di siero di vitello fetale (FCS) in ciascun pozzetto.

Le cellule sono state rimosse pipettando delicatamente su e giù usando una pipetta da 1 mL e applicate a un filtro cellulare da 100 µm. Per aumentare la resa cellulare, sia i pozzetti che il filtro sono stati ulteriormente lavati con 1 ml di StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, umano contenente il 20% di FCS.

Analisi di citometria a flusso

Sono state raccolte un totale di 1,54 × 10⁷ cellule con una vitalità dell'89%. Le cellule sono state risospese in Inside Fix Solution (Inside Stain Kit) e incubate al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state quindi raccolte mediante centrifugazione (a 300 × g per 5 minuti), risospese in 1 ml di PEB (DPBS [-/-], 0,5% BSA e 2 mM EDTA) e raccolte nuovamente dopo una seconda centrifugazione (a 300 × g per 5 minuti). I campioni per i controlli isotipici sono stati ottenuti risospendendo le cellule in 98 µL di soluzione Inside Perm (Inside Stain Kit) più 2 µL dell'anticorpo di controllo REA appropriato. Inoltre, i campioni per la doppia colorazione sono stati ottenuti risospendendo le cellule in 96 µL di soluzione Inside Perm più 2 µL di ciascun anticorpo. Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, è stato aggiunto 1 mL di soluzione Inside Perm e i campioni sono stati centrifugati (a 300 x g per 5 min). Il pellet è stato risospeso in 500 µL di tampone PEB e analizzato utilizzando BD FACSCalibur™.

Esposizione a composti cardiotropi

I cardiomiociti umani derivati da iPSC sono stati trattati con 30 mM di isoproterenolo o 30 mM di propranololo nello StemMACS Cardiac Cultivation Medium XF, umano. Le cellule sono state monitorate visivamente e le percosse al minuto sono state valutate manualmente.

Risultati

Le iPSC umane sono state differenziate con successo in cardiomiociti con le prime macchie di battitura visibili al giorno 7. Dopo 8 giorni di differenziazione, le cellule derivate da iPSC umane hanno mostrato cambiamenti nella morfologia, nell'espressione proteica e nelle proprietà di battitura paragonabili alla specifica del destino dei cardiomiociti. L'entità di tale cambiamento dipendeva, come previsto, dalla densità di semina iniziale. Stabilire la densità di semina di maggior successo per la differenziazione è fondamentale quando si differenzia per la prima volta una linea iPSC umana in cardiomiociti. Questo viene quindi utilizzato per impostare i numeri di cella iniziali per i futuri cicli di differenziazione. Per la linea Human iPSC selezionata, un'elevata densità di semina di 300.000 cellule/cm² ha prodotto le migliori prestazioni funzionali. I cardiomiociti derivati da iPSC umani provenienti da pozzetti ad alta densità cellulare hanno mostrato schemi di battimento ondulati attraverso l'intero pozzetto. Inoltre, le cellule hanno mostrato un'elevata espressione del marcatore del cardiomiocita, la troponina T del muscolo cardiaco (cTnT) (fig.1). Inoltre, i cardiomiociti umani derivati da iPSC hanno mostrato l'espressione di marcatori aggiuntivi tipici del destino cardiaco, come l'α-actinina e la catena pesante della miosina (MHC). Inoltre, la maggiore espressione cellulare dell'isoforma atriale della catena leggera regolatoria della miosina 2 (MLC2a) (27,3%) rispetto all'espressione inferiore dell'isoforma ventricolare (MLC2v) (0,48%), ha indicato che le cellule hanno iniziato a esprimere caratteristiche atriali appena dopo 8 giorni di differenziazione. (figura 2).

I cardiomiociti umani derivati da iPSC esprimevano il marcatore cardiaco associato mentre perdevano l'espressione del marcatore di pluripotenza L'analisi dell'espressione genica ha mostrato un'elevata espressione della troponina T del muscolo cardiaco (TNNT2) dopo 8 giorni di differenziazione che era accompagnata da una completa perdita di espressione del marcatore associato alla pluripotenza POU5F1 (POU Classe 5 Homeobox 1, OTT4). Questi risultati hanno dimostrato l'assenza di iPSC umane indifferenziate nei pozzetti sottoposti a differenziazione con StemMACS CardioDiff Kit XF, umano (fig. 3).

I cardiomiociti umani derivati da iPSC rispondono al trattamento con composti cardiotropici alterando la loro frequenza di battimento I cardiomiociti umani funzionali derivati da iPSC devono mostrare proprietà contrattili ed essere in grado di reagire agli stimoli esterni in modo simile alle cellule primarie. Per valutare la loro funzionalità, i cardiomiociti derivati da iPSC sono stati esposti a due ben noti composti cardiotropici: isoproterenolo e propranololo. L'isoproterenolo, noto anche come isoprenalina, è un farmaco utilizzato per il trattamento della bradicardia (frequenza cardiaca lenta) e induce un aumento della frequenza del battito.

Al contrario, il propranololo si oppone a questo effetto, rallentando la frequenza del battito.

I cardiomiociti umani derivati da iPSC esposti a 30 mM di isoproterenolo o 30 mM di propranololo hanno risposto modificando di conseguenza i loro modelli di battito rispetto al controllo, in linea con gli effetti attesi dei composti (figura 4).

Conclusioni

Linee iPSC umane differenziate con StemMACS CardioDiff Kit XF, esposizione umana:

• espressione genica e proteica tipica dei cardiomiociti;

• assenza di iPSC umane residue indifferenziate; 

  • adeguate risposte al battito cardiaco al trattamento con composti cardiotropi. 

Combinati, questi risultati suggeriscono la buona qualità del modello cellulare derivato da iPSC umano generato.

Da:

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