Real-Time 96-Well Antibody
Internalization Assays Using
Incucyte® Fabfluor-pH
Antibody Labeling Dye / Saggi di internalizzazione degli anticorpi a 96 pozzetti in tempo reale utilizzando il colorante di marcatura degli anticorpi Incucyte® Fabfluor-pH
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Figure 1: Principle of antibody Internalization assay using Incucyte® Fabfluor-pH labeling dye (A). Fluorogenic signal as internalized
antibody is processed into the acidic endosome and lysosome. Data to show the pH sensitivity of the labeling probe (B and C). Note
the relatively low fluorescence of Fabfluor-pH at pH 7.0. / Principio del test di internalizzazione dell'anticorpo utilizzando il colorante di marcatura Incucyte® Fabfluor-pH (A). Il segnale fluorogenico come anticorpo internalizzato viene elaborato nell'endosoma acido e nel lisosoma. Dati per mostrare la sensibilità al pH della sonda di etichettatura (B e C). Si noti la fluorescenza relativamente bassa di Fabfluor-pH a pH 7,0.Introduction
Monoclonal antibodies are now widely used as
anti-cancer, anti-inflammatory, and anti-viral
therapeutic agents. An important property of antibodies is the extent, location, and rate of internalization into cells. For example, antibody-drug
conjugates (ADCs) deliver cytotoxic payloads to
cells and the specificity and degree of cellular
uptake is critical to the efficacy and safety of the
molecule. Monoclonal antibodies are also used in
immunotherapy to label tumor cells for immune
cell clearance (e.g., ADCC, ADCP1-3) and to drive
internalization of receptors associated with tumor
survival (e.g., EGFR4,5).
In each case, the rate of removal from the cell surface will strongly influence the therapeutic profile
of the antibody. More generally, internalization of
antibodies by either specific (target mediated) or
non-specific (e.g., pinocytosis in endothelial cells)
mechanisms is a key determinant of the half-life in
the body, and small modifications to monoclonal
antibody structure can have profound effects on
duration of activity. For these reasons, understanding the internalization of antibodies into cells, and
being able to compare the uptake of different antibodies, is a key requirement in antibody selection
and optimization for biologics drug discovery.
Current methods to directly quantify antibody internalization are laborious, time-consuming, and
not amenable to testing multiple antibodies. These
assays generally require labeling each antibody
with a fluorescent tag—in most cases the labeled
antibody must be separated from the free label
via a column or wash step. The analysis requires
that the signal from the internalized antibody can
be robustly isolated from that outside the cells.
Wash steps, blocking dyes and/or a reduction in
temperature to slow cellular activity are common.
Almost all (e.g., flow cytometry, high content imaging) provide only end point assays and multiple
experiments are required to follow internalization
over time.
In this application note, we describe an integrated
assay solution, based on Incucyte® live-cell imaging and analysis and a novel pH-sensitive dye coupled antibody fragment (Incucyte® Fabfluor-pH Antibody Labeling Dyes), that is designed to address
these limitations. This solution provides a simple,
turnkey method for comparing the internalization
of large numbers of antibodies and is amenable for
use throughout the industrial antibody drug discovery process and basic scientific research.
Assay Principle
Incucyte® Fabfluor-pH Antibody Labeling Dyes are
Fc-region targeting Fab fragments conjugated to
a pH-sensitive fluorescent probe. These reagents
enable a generic one-step, no-wash, labeling
protocol for all isotype matched, Fc-containing
test antibodies. At pH 7.0, the Fab-Ab complex
has little or no fluorescence. When labeled antibodies are added to cells, a fluorogenic signal is
observed as the Fab-Ab complex is internalized
and processed via acidic (pH 4.5–5.5) lysosomes
and endosomes (Figure 1). The full time course
of internalization is visualized and automatically
quantified using Incucyte® real-time live-cell analysis. The labeling method and assay workflow is
commensurate with comparing internalization
rates of large numbers of antibodies (10–100’s) in
miniaturized (96/384-well) plate formats.
General Methods and Materials
Cell Culture and Reagents
BT-474 cells (DMEM+10% FCS), HT-1080 cells
(F12K+10% FCS, 1% glutamax, 1u/mL pen/strep),
Jurkat and Raji cells (both RPMI 1640+10% FCS)
were grown in 75 cm2
tissue culture treated flasks.
All cell lines were provided by ATCC and culture
reagents were obtained from Life Technologies.
Commercially available test antibodies were CD71
clone 1a, 2, CD20 (Sigma), clone 3-5 (Abcam), CD3,
CD45 (Biolegend), human IgG isotype control
(Absolute Antibody), mouse IgG1 isotype control
(R&D Systems).
Antibody Labeling
Test antibody at known concentration was mixed
with isotype matched, Incucyte® Fabfluor-pH
Dye at a molar ratio of 1 to 3 in complete growth
media. Reactions were performed at twice the final
required assay concentration in either a round
bottom 96-well plate (Costar Cat. No. 3799) or an
amber microtube, depending on the volumes
required, and incubated for 15 min at 37° C.
Any required dilutions (e.g., for construction of
concentration response-curves) were performed
post conjugation to maintain the labeling ratio.
Fabfluor-pH labeled antibody (50 μL) was then
added directly to pre-plated cells (in 50 μL).
Incucyte® Antibody
Internalization Experiments
Cells were plated (BT-474 10K per well, 16 h, HT1080 8K per well 4 h) on flat-bottom 96-well plates
(Costar Cat. No. 3595) prior to assay. For assays using
non-adherent cell types, plates were coated with
poly-L-ornithine (PLO, Sigma Cat. No. P4957) for 1 h
and allowed to dry for 30 min prior to cell seeding.
Cells were seeded at 30 K/well, 1 h prior to assay.
Following addition of Ab/Fab complex assay plates
were immediately placed in an Incucyte® Live-Cell
Analysis System and scanned for HD phase and red
fluorescence images at 10X or 20X magnification
every 15–30 minutes for up to 48 h.
Figure 2: Internalization of Incucyte® Fabfluor-pH labeled α-CD71 in HT-1080 cells. HT-1080 cells were treated with either Incucyte® Fabfluor-pH
labeled α-CD71 or IgG1 isotype control (4 μg/mL), HD phase and red fluorescence images (10X) were captured every 15 min over 12 h. Images
of cells treated with Fabfluor-pH- α-CD71 display red, cytosolic fluorescence (A). Cells treated with labeled isotype control display no cellular
fluorescence (B). Time course data shows a rapid increase in red object area over time in cells treated with labeled α-CD71 but not with isotype
control (C). Images shown taken at 6 h post treatment, data shown as mean of 3 wells ± SEM. / Internalizzazione di Incucyte® Fabfluor-pH marcato con α-CD71 in cellule HT-1080. Le cellule HT-1080 sono state trattate con Incucyte® Fabfluor-pH marcato con controllo isotipico α-CD71 o IgG1 (4 μg/mL), la fase HD e le immagini di fluorescenza rossa (10X) sono state acquisite ogni 15 minuti per 12 ore. Le immagini delle cellule trattate con Fabfluor-pH-α-CD71 mostrano una fluorescenza citosolica rossa (A). Le cellule trattate con il controllo isotipico marcato non mostrano fluorescenza cellulare (B). I dati sull'andamento temporale mostrano un rapido aumento dell'area dell'oggetto rosso nel tempo nelle cellule trattate con α-CD71 marcato ma non con controllo isotipico (C). Immagini mostrate scattate a 6 ore dopo il trattamento, dati mostrati come media di 3 pozzetti ± SEM.(Anti-CD71 internalization red fluorescence area) was detectable at 1 K cells
per well and markedly increased at higher plating
densities (Figure 3 A and B). Over time (0–12 h)
the internalization signal continued to rise. When
the red fluorescence area was normalized to the
total cell area (Phase Confluence) to account for
proliferation, the time course signals were highly
similar. 
Figure 3: Antibody internalization response is cell number dependent. An increasing density of HT-1080 cells were seeded (1–20
K/well) and treated with Incucyte® Fabfluor-pH labeled α-CD71 (4 μg/mL). HD phase and red fluorescence images (10X) were
captured every 30 min over 12 h. The time- course of red object area data demonstrates an increasing internalization signal with
increasing cell number (A and B). When the red object signal is normalized for phase area, it is clear the internalization response
size is dependent on cell number (C and D). All data shown as a mean of 3 wells ± SEM, bar graphs show area under the curve (AUC)
calculated from time course data. / La risposta all'internalizzazione degli anticorpi dipende dal numero di cellule. Una densità crescente di cellule HT-1080 è stata seminata (1-20 K/pozzetto) e trattata con Incucyte® Fabfluor-pH marcato con α-CD71 (4 μg/mL). Le immagini di fase HD e di fluorescenza rossa (10X) sono state acquisite ogni 30 minuti per 12 ore. Il corso temporale dei dati dell'area dell'oggetto rosso dimostra un segnale di internalizzazione crescente con l'aumento del numero di celle (A e B). Quando il segnale dell'oggetto rosso viene normalizzato per l'area di fase, è chiaro che la dimensione della risposta di internalizzazione dipende dal numero di cella (C e D). Tutti i dati mostrati come media di 3 pozzetti ± SEM, i grafici a barre mostrano l'area sotto la curva (AUC) calcolata dai dati dell'andamento temporale.
Importantly, after 4 h there was no further increase in the normalized signal, indicating that
antibody internalization had reached equilibrium.
This normalization method helps minimize the
impact of well-to-well cell seeding variation and
isolate the true internalization rate signal from
cell proliferation.
Signal Co-Localization
With
Lysosomal Marker
To confirm the presence of the internalized antibody in the lysosome, we conducted dual labeling
experiments with LysoSensor® Green (Thermo Scientific), an end-point lysosomal marker. HT-1080
cells were treated with Fabfluor-pH-labeled-CD71
for 3 h and monitored for antibody internalization. LysoSensor Green was added, and the plate
then returned to the Incucyte® to measure red
(CD71) and green (LysoSensor) fluorescence. A
strong co-incident signal was observed in the two
signal channels, 74% of the red signal was co-localized with green, supporting the premise that
the Fabfluor labeled antibody was internalized to
the lysosome.
Applicability Across Different Cell Types
and Antibodies
To demonstrate the broad application and specificity of the method, internalization was assessed for
a range of test antibodies targeted against specific
CD markers expressed in different cell lines (Figure
5). Anti-CD20 was internalized in the B cell line Raji,
but not Jurkat, a T cell line. Conversely, anti-CD3
was internalized in Jurkat but not Raji. Antibodies
to CD71 and CD45, general lymphocyte markers,
were internalized in both cell types. Importantly,
IgG was not internalized in either. These data are in
alignment with the known CD surface marker expression of these cell lines, and provide strong confidence in the signal specificity and generic utility
of the method.
Figure 4: Co-localization of Incucyte® Fabfluor-pH labeled α-CD71 and LysoSensor® Green in HT-1080 cells. Internalization of Incucyte®
Fabfluor-pH labeled α-CD71 (4 μg/mL) was established for 3 h in HT- 1080 cells before addition of LysoSensor® Green DND-189 (Thermo,
0.25 μM). Images show individual LysoSensor® Green and Fabfluor-pH labeled α-CD71 red signal (A and B), co-localization of red and
green signals (C), and the co-localized analysis mask shown in yellow (D). (E) Incucyte® analysis of the coincidence of the red and green
fluorescence confirms co-localization of 74% of the red signal with the green signal. Images captured at 20X magnification, 30 min post
LysoSensor® addition, data shown as mean of 4 wells ± SEM. / Co-localizzazione di Incucyte® Fabfluor-pH marcato con α-CD71 e LysoSensor® Green in cellule HT-1080. L'internalizzazione di Incucyte® Fabfluor-pH marcato con α-CD71 (4 μg/mL) è stata stabilita per 3 ore in cellule HT-1080 prima dell'aggiunta di LysoSensor® Green DND-189 (Thermo, 0,25 μM). Le immagini mostrano il singolo segnale rosso α-CD71 marcato con LysoSensor® Green e Fabfluor-pH (A e B), la co-localizzazione dei segnali rosso e verde (C) e la maschera di analisi co-localizzata mostrata in giallo (D). (E) L'analisi Incucyte® della coincidenza della fluorescenza rossa e verde conferma la co-localizzazione del 74% del segnale rosso con il segnale verde. Immagini acquisite con ingrandimento 20X, 30 minuti dopo l'aggiunta di LysoSensor®, dati mostrati come media di 4 pozzetti ± SEM.Risultati della traduzione
Figure 5: Internalization of CD surface marker targeted antibodies in lymphocytic cell lines. Jurkat (T cell-like) and Raji (B cell-like) cells
(30 K/well) were treated with different Incucyte® Fabfluor-pH labeled antibodies (4 μg/mL). HD phase and red images were captured
every 30 min using a 20X objective over 12 h. Time course data (A and B) and area under the curve (AUC, C) analysis demonstrates the
response profile in both cell lines. All data shown as a mean of at least 4 wells ± SEM, time course data shown as normalized red area. / Internalizzazione di anticorpi mirati al marcatore di superficie CD in linee cellulari linfocitarie. Le cellule Jurkat (simili a cellule T) e Raji (simili a cellule B) (30 K/pozzetto) sono state trattate con diversi anticorpi marcati Incucyte® Fabfluor-pH (4 μg/mL). La fase HD e le immagini rosse sono state acquisite ogni 30 minuti utilizzando un obiettivo 20X su 12 ore. I dati sull'andamento temporale (A e B) e l'analisi dell'area sotto la curva (AUC, C) dimostrano il profilo di risposta in entrambe le linee cellulari. Tutti i dati mostrati come media di almeno 4 pozzetti ± SEM, i dati dell'andamento temporale mostrati come area rossa normalizzata.Quantitative Pharmacological Analysis
Pharmacological,
Kinetic Quantification
of Antibody Internalization
To illustrate the quantitative nature of the method
and suitability for analyzing therapeutic antibodies, we sought to determine EC50 values for the internalization of Herceptin (Trastuzumab) and Rituxan (Rituximab), two clinically used monoclonal
antibodies. After labeling of each antibody with
the Fabfluor-pH reagent, the antibody was serially
diluted (1:2) prior to addition to the cells to enable
construction of a concentration-response curve.
Handling the labeled antibody this way is good
practice to eliminate any variation in Fab labeling
efficiency which could occur across the concentration range. In BT-474 Her2-positive breast carcinoma cells, clear time and concentration dependent
internalization of Herceptin was observed over 48
h. From an area under the time-course (AUC) analysis, the EC50 value for internalization was 323 ng/mL
= 2.1 nM, Figure 6). In Raji cells, the EC = 50 value for
Rituxan was 426 ng/mL = 2.6 nM, Figure 7). These =
EC50 values are similar to the known KD values for
Herceptin and Rituxan for their target receptors
(both approximately 5 nM).
Comparison of Multiple Test Antibodies
for High-Throughput Screening
The features of the Incucyte® Antibody Internalization Assay are such that it should be facile to
parallel label many antibodies and compare their
internalization. To validate this, we took 6 different
commercially available anti-CD71 antibodies and
compared their internalization properties headto-head. The antibodies were plated in 96-well
plates and labeled in full media with the Incucyte®
Fabfluor-pH Dye. Serial dilutions were performed
in full media (8 point, 1:2). Labeled IgG and Fabfluor-pH alone were added to control wells. Labeled antibodies were then added to pre-plated
HT-1080 cells and monitored for internalization
for 12 h.
Figure 6: Quantitative pharmacological analysis of Incucyte®
Fabfluor-pH labeled Herceptin. BT-474 Her2-positive cells
were treated with increasing concentrations of Fabfluor-pH
labeled Herceptin. The time course graph displays an increase
normalized red area over time with increasing Herceptin
concentrations (A). Area under the curve analysis of this
response displays a clear concentration dependent response
with an EC50 of 323 ng/mL (B). All data shown as a mean of 3
wells ± SEM, time course data shown as normalized red area. / Analisi farmacologica quantitativa di Herceptin marcato con Fabfluor-pH Incucyte®. Le cellule BT-474 Her2-positive sono state trattate con concentrazioni crescenti di Herceptin marcato con Fabfluor-pH. Il grafico dell'andamento temporale mostra un aumento dell'area rossa normalizzata nel tempo con l'aumento delle concentrazioni di Herceptin (A). L'analisi dell'area sotto la curva di questa risposta mostra una chiara risposta dipendente dalla concentrazione con un EC50 di 323 ng/mL (B). Tutti i dati mostrati come media di 3 pozzetti ± SEM, i dati dell'andamento temporale mostrati come area rossa normalizzata
Figure 7: Quantitative pharmacological analysis of Incucyte®
Fabfluor-pH labeled Rituxan. Raji cells were treated with
increasing concentrations of Fabfluor-pH labeled Rituxan. The
time course graph displays an increase normalized red area over
time with increasing Rituxan concentrations (A). Area under the
curve analysis of this response displays a clear concentration
dependent response with an EC50 of 426 ng/mL (B). All data
shown as a mean of 3 wells SEM, time course data shown as
normalized red area. / Analisi farmacologica quantitativa di Incucyte® Rituxan marcato con Fabfluor-pH. Le cellule Raji sono state trattate con concentrazioni crescenti di Rituxan marcato con Fabfluor-pH. Il grafico dell'andamento temporale mostra un aumento dell'area rossa normalizzata nel tempo con l'aumento delle concentrazioni di Rituxan (A). L'analisi dell'area sotto la curva di questa risposta mostra una chiara risposta dipendente dalla concentrazione con un EC50 di 426 ng/mL (B). Tutti i dati mostrati come media di 3 pozzetti SEM, i dati dell'andamento temporale mostrati come area rossa normalizzata.
Of the 6 antibodies, 3 (Ab 1a, Ab2 and Ab 1b)
produced large internalization signals and
were detected at low concentrations (< 0.05 µg
mL-1). Reassuringly, Ab 1a and Ab 1b were the
same antibody clone from different suppliers
and gave similar internalization responses. Abs
3, 4, and 5 were internalized more weakly and
only at higher con- centrations (Figure 8). From
the control responses, a mean Z’ value of 0.82
was determined (2 plates 0.75, 0.87) indicating a microplate assay with high robustness. These
data confirm the suitability of the method
for comparing the internalization of multiple
antibodies at a single target, and illustrate that
the internalization profile is a property of the
antibody per se. Indeed, the assay precision and
workflows are such that hundreds of different
antibodies could be compared at once and
further throughput could be achieved through
miniaturization to 384-well format.
Figure 8: Screening test Abs for internalization. Six different CD71 antibodies including one clone from 2 different suppliers (clone 1a
& 1b) were tested head-to-head in HT-1080 cells. The antibodies were labeled with Incucyte® Fabfluor-pH Dye prior to addition to cells
and the internalization signal captured every 30 min over 12 h using a 10X magnification. Plate views taken from Incucyte® show clear
positive and negative control responses in column 11 and 12 with concentration dependent responses for each antibody across two
plates (A). Head-to-head analysis of antibody data shows a range of responses across these clones (B) control responses at 12 h display
a clear positive response. All data shown as mean of 3 wells ± SEM, controls shown as mean of 8 wells. / Test di screening Abs per internalizzazione. Sei diversi anticorpi CD71, incluso un clone di 2 diversi fornitori (clone 1a e 1b), sono stati testati testa a testa nelle cellule HT-1080. Gli anticorpi sono stati etichettati con Incucyte® Fabfluor-pH Dye prima dell'aggiunta alle cellule e il segnale di internalizzazione è stato catturato ogni 30 minuti per 12 ore utilizzando un ingrandimento 10X. Le viste delle piastre ottenute da Incucyte® mostrano chiare risposte di controllo positive e negative nelle colonne 11 e 12 con risposte dipendenti dalla concentrazione per ciascun anticorpo su due piastre (A). L'analisi testa a testa dei dati sugli anticorpi mostra una gamma di risposte tra queste risposte di controllo dei cloni (B) a 12 ore mostrano una chiara risposta positiva. Tutti i dati mostrati come media di 3 pozzetti ± SEM, controlli mostrati come media di 8 pozzetti.
ITALIANO
Introduzione
Gli anticorpi monoclonali sono ora ampiamente utilizzati come agenti terapeutici antitumorali, antinfiammatori ed antivirali. Una proprietà importante degli anticorpi è l'estensione, la posizione ed il tasso di internalizzazione nelle cellule. Ad esempio, i coniugati anticorpo-farmaco (ADC) forniscono carichi utili citotossici alle cellule e la specificità ed il grado di assorbimento cellulare sono fondamentali per l'efficacia e la sicurezza della molecola. Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati anche in immunoterapia per etichettare le cellule tumorali per la clearance delle cellule immunitarie (ad esempio, ADCC, ADCP1-3) e per guidare l'internalizzazione dei recettori associati alla sopravvivenza del tumore (ad esempio, EGFR). In ogni caso, la velocità di rimozione dalla superficie cellulare influenzerà fortemente il profilo terapeutico dell'anticorpo. Più in generale, l'internalizzazione degli anticorpi mediante meccanismi specifici (target mediati) o non specifici (ad esempio, pinocitosi nelle cellule endoteliali) è un fattore determinante dell'emivita nel corpo e piccole modifiche alla struttura degli anticorpi monoclonali possono avere effetti profondi sulla durata dell'attività. Per questi motivi, comprendere l'interiorizzazione degli anticorpi nelle cellule ed essere in grado di confrontare l'assorbimento di diversi anticorpi è un requisito fondamentale nella selezione ed ottimizzazione degli anticorpi per la scoperta di farmaci biologici. I metodi attuali per quantificare direttamente l'internalizzazione degli anticorpi sono laboriosi, richiedono tempo e non sono suscettibili di testare più anticorpi. Questi test generalmente richiedono l'etichettatura di ciascun anticorpo con un'etichetta fluorescente: nella maggior parte dei casi l'anticorpo etichettato deve essere separato dall'etichetta libera tramite una colonna od una fase di lavaggio. L'analisi richiede che il segnale proveniente dall'anticorpo internalizzato possa essere isolato in modo robusto da quello esterno alle cellule. Sono comuni le fasi di lavaggio, i coloranti bloccanti e/o una riduzione della temperatura per rallentare l'attività cellulare. Quasi tutti (ad es. Citometria a flusso, imaging ad alto contenuto) forniscono solo analisi del punto finale e sono necessari più esperimenti per seguire l'interiorizzazione nel tempo. In questa nota applicativa, descriviamo una soluzione di analisi integrata, basata sull'imaging e sull'analisi di cellule vive Incucyte® e un nuovo frammento anticorpale accoppiato con colorante sensibile al pH (Incucyte® Fabfluor-pH Antibody Labelling Dyes), progettato per affrontare queste limitazioni. Questa soluzione fornisce un metodo semplice e chiavi in mano per confrontare l'internalizzazione di un gran numero di anticorpi ed è suscettibile di utilizzo durante il processo di scoperta di farmaci anticorpali industriali e la ricerca scientifica di base.
Principio del dosaggio
I coloranti di marcatura dell'anticorpo Fabfluor-pH Incucyte sono frammenti Fab mirati alla regione Fc coniugati ad una sonda fluorescente sensibile al pH. Questi reagenti consentono un protocollo di etichettatura generico in un'unica fase, senza lavaggio, per tutti gli anticorpi del test contenenti Fc corrispondenti all'isotipo. A pH 7,0, il complesso Fab-Ab ha poca o nessuna fluorescenza. Quando gli anticorpi marcati vengono aggiunti alle cellule, si osserva un segnale fluorogenico mentre il complesso Fab-Ab viene interiorizzato ed elaborato tramite lisosomi ed endosomi acidi (pH 4,5–5,5) (Figura 1). Il corso a tempo pieno dell'internalizzazione viene visualizzato e quantificato automaticamente utilizzando l'analisi delle cellule vive in tempo reale Incucyte®. Il metodo di etichettatura ed il flusso di lavoro del test sono commisurati al confronto dei tassi di internalizzazione di un gran numero di anticorpi (10-100) in formati di piastre miniaturizzate (96/384 pozzetti).
Metodi generali e materiali
Coltura cellulare e reagenti
Sono state coltivate cellule BT-474 (DMEM+10% FCS), cellule HT-1080 (F12K+10% FCS, 1% glutamax, 1u/mL pen/strep), cellule Jurkat e Raji (entrambe RPMI 1640+10% FCS) in fiasche trattate per coltura tissutale da 75 cm2. Tutte le linee cellulari sono state fornite da ATCC e i reagenti di coltura sono stati ottenuti da Life Technologies. Gli anticorpi di prova disponibili in commercio erano CD71 clone 1a, 2, CD20 (Sigma), clone 3-5 (Abcam), CD3, CD45 (Biolegend), controllo isotipo IgG umano (Absolute Antibody), controllo isotipo IgG1 di topo (R&D Systems). L'anticorpo del test di marcatura dell'anticorpo a concentrazione nota è stato miscelato con il colorante Incucyte® Fabfluor-pH corrispondente all'isotipo in un rapporto molare da 1 a 3 in terreni di crescita completi. Le reazioni sono state eseguite al doppio della concentrazione del test finale richiesta in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo (Costar Cat. No. 3799) o in una microprovetta color ambra, a seconda dei volumi richiesti, e incubate per 15 minuti a 37° C. le diluizioni (ad esempio, per la costruzione di curve di risposta alla concentrazione) sono state eseguite dopo la coniugazione per mantenere il rapporto di etichettatura. L'anticorpo marcato con Fabfluor-pH (50 μL) è stato quindi aggiunto direttamente alle cellule pre-placcate (in 50 μL). Esperimenti di internalizzazione dell'anticorpo Incucyte® Le cellule sono state piastrate (BT-474 10 K per pozzetto, 16 h, HT1080 8 K per pozzetto 4 h) su piastre a fondo piatto da 96 pozzetti (Costar Cat. No. 3595) prima dell'analisi. Per i saggi che utilizzano tipi di cellule non aderenti, le piastre sono state rivestite con poli-L-ornitina (PLO, Sigma Cat. No. P4957) per 1 ora e lasciate asciugare per 30 minuti prima della semina cellulare. Le cellule sono state seminate a 30 K/pozzetto, 1 ora prima dell'analisi. Dopo l'aggiunta di piastre per analisi del complesso Ab/Fab, le piastre sono state immediatamente collocate in un sistema di analisi delle cellule vive Incucyte® e scansionate per immagini di fase HD e fluorescenza rossa a ingrandimento 10X o 20X ogni 15-30 minuti per un massimo di 48 ore.
Le immagini sono state analizzate automaticamente utilizzando il software Incucyte® integrato per le seguenti metriche:
(1) Confluenza di fase (misura dell'area cellulare), area dell'oggetto di fluorescenza rossa (indice di anticorpo internalizzato marcato con Fabfluor-pH). La sottrazione Top Hat è stata utilizzata per ridurre al minimo qualsiasi segnale di fluorescenza di fondo. Dati di convalida Proof of Concept Come prova del concetto, è stata misurata l'internalizzazione di un anticorpo contro CD71, il recettore della transferrina, nelle cellule di fibrosarcoma HT-1080. L'anticorpo anti-CD71 (clone MEM189) e un controllo dell'isotipo IgG1 di topo sono stati marcati con un colorante di marcatura dell'anticorpo IgG1 di topo Incucyte@ Fabfluor-pH Red Mouse corrispondente all'isotipo come descritto. Anticorpi marcati con Fabfluor-pH (4 μg/mL) sono stati aggiunti alle cellule e monitorati (contrasto di fase, fluorescenza rossa) per 12 ore in un sistema di analisi delle cellule vive Incucyte®. È stato osservato un rapido aumento dipendente dal tempo della fluorescenza rossa con anti-CD71, ma non isotipo o controllo dei media, dal primo punto temporale (15 min) del dosaggio (Figura 2). A 12 ore, il segnale: lo sfondo del test era > 15 volte. Il segnale rosso è stato osservato nel compartimento citosolico delle cellule ma non nel nucleo, coerente con la localizzazione prevista dell'anticorpo interiorizzato ai lisosomi e agli endosomi. L'area di fluorescenza (µm2/pozzetto) è stata utilizzata per quantificare il segnale specifico. Analoghi test di prova del concetto sono stati condotti utilizzando anche il colorante per l'etichettatura degli anticorpi Incucyte® Fabfluor-pH Orange. Normalizzazione per numero di cellule In teoria, il segnale di internalizzazione dell'anticorpo dovrebbe aumentare in funzione del numero di cellule. Per verificare ciò e per comprendere il contributo della proliferazione cellulare al segnale nel tempo, sono stati condotti esperimenti su cellule piastrate a densità diverse (1-20 K per pozzetto).
(Area di fluorescenza rossa di internalizzazione Anti-CD71) era rilevabile a 1 cellule K per pozzetto e notevolmente aumentata a densità di placcatura più elevate (Figura 3 A e B). Nel tempo (0-12 ore) il segnale di internalizzazione ha continuato a salire. Quando l'area di fluorescenza rossa è stata normalizzata all'area totale delle cellule (confluenza di fase) per tenere conto della proliferazione, i segnali del decorso temporale erano molto simili.
È importante sottolineare che dopo 4 ore non vi è stato alcun ulteriore aumento del segnale normalizzato, indicando che l'internalizzazione dell'anticorpo aveva raggiunto l'equilibrio. Questo metodo di normalizzazione aiuta a ridurre al minimo l'impatto della variazione di seeding cellulare da pozzo a pozzo ed isolare il vero segnale del tasso di internalizzazione dalla proliferazione cellulare.
Co-localizzazione del segnale con marcatore lisosomiale
Per confermare la presenza dell'anticorpo interiorizzato nel lisosoma, abbiamo condotto esperimenti di doppia etichettatura con LysoSensor® Green (Thermo Scientific), un marcatore lisosomiale end-point. Le cellule HT-1080 sono state trattate con CD71 marcato con Fabfluor pH per 3 ore e monitorate per l'internalizzazione degli anticorpi. È stato aggiunto il LysoSensor Green, quindi la piastra è tornata nell'Incucyte® per misurare la fluorescenza rossa (CD71) e verde (LysoSensor). È stato osservato un forte segnale coincidente nei due canali del segnale, il 74% del segnale rosso era co-localizzato con il verde, a sostegno della premessa che l'anticorpo marcato con Fabfluor fosse interiorizzato nel lisosoma.
Applicabilità su diversi tipi di cellule e anticorpi
Per dimostrare l'ampia applicazione e specificità del metodo, l'internalizzazione è stata valutata per una gamma di anticorpi di prova mirati contro specifici marcatori CD espressi in diverse linee cellulari (Figura 5). L'anti-CD20 è stato interiorizzato nella linea di cellule B Raji, ma non in Jurkat, una linea di cellule T. Al contrario, l'anti-CD3 è stato interiorizzato in Jurkat ma non in Raji. Gli anticorpi contro CD71 e CD45, marcatori generali dei linfociti, sono stati internalizzati in entrambi i tipi di cellule. È importante sottolineare che le IgG non sono state interiorizzate in nessuno dei due. Questi dati sono in linea con la nota espressione del marcatore di superficie CD di queste linee cellulari e forniscono una forte fiducia nella specificità del segnale e nell'utilità generica del metodo.
Analisi Farmacologica Quantitativa Farmacologica,
Quantificazione cinetica dell'internalizzazione anticorpale
Per illustrare la natura quantitativa del metodo e l'idoneità per l'analisi degli anticorpi terapeutici, abbiamo cercato di determinare i valori EC50 per l'internalizzazione di Herceptin (Trastuzumab) e Rituxan (Rituximab), due anticorpi monoclonali utilizzati clinicamente. Dopo l'etichettatura di ciascun anticorpo con il reagente Fabfluor-pH, l'anticorpo è stato diluito in serie (1:2) prima dell'aggiunta alle cellule per consentire la costruzione di una curva concentrazione-risposta. La manipolazione dell'anticorpo marcato in questo modo è una buona pratica per eliminare qualsiasi variazione nell'efficienza dell'etichettatura Fab che potrebbe verificarsi nell'intervallo di concentrazione. Nelle cellule di carcinoma mammario BT-474 Her2-positive, è stata osservata un'internalizzazione di Herceptin dipendente dal tempo e dalla concentrazione per 48 ore. Da un'area sotto l'analisi del corso temporale (AUC), il valore EC50 per l'internalizzazione era 323 ng/mL = 2,1 nM, Figura 6). Nelle cellule Raji, il valore EC = 50 per Rituxan era 426 ng/mL = 2,6 nM, Figura 7). Questi valori = EC50 sono simili ai valori KD noti per Herceptin e Rituxan per i loro recettori target (entrambi circa 5 nM).
Confronto di più anticorpi di prova per lo screening ad alto rendimento
Le caratteristiche dell'Incucyte® Antibody Internalization Assay sono tali che dovrebbe essere facile etichettare in parallelo molti anticorpi e confrontare la loro internalizzazione. Per convalidare ciò, abbiamo preso 6 diversi anticorpi anti-CD71 disponibili in commercio e confrontato le loro proprietà di internalizzazione testa a testa. Gli anticorpi sono stati piastrati in piastre da 96 pozzetti ed etichettati in terreno pieno con il colorante Incucyte® Fabfluor-pH. Le diluizioni seriali sono state eseguite in full media (8 punti, 1:2). Solo IgG marcate e Fabfluor-pH sono state aggiunte ai pozzetti di controllo. Gli anticorpi marcati sono stati quindi aggiunti alle cellule HT-1080 pre-placcate e monitorati per l'internalizzazione per 12 ore.
Dei 6 anticorpi, 3 (Ab 1a, Ab2 e Ab 1b) hanno prodotto ampi segnali di internalizzazione e sono stati rilevati a basse concentrazioni (< 0,05 µg mL-1). In modo rassicurante, Ab 1a e Ab 1b erano lo stesso clone anticorpale di fornitori diversi e fornivano risposte di internalizzazione simili. Gli addominali 3, 4 e 5 sono stati interiorizzati più debolmente e solo a concentrazioni più elevate (Figura 8). Dalle risposte di controllo, è stato determinato un valore Z medio di 0,82 (2 piastre 0,75, 0,87) che indica un test su micropiastra con elevata robustezza. Questi dati confermano l'idoneità del metodo per confrontare l'internalizzazione di più anticorpi su un singolo bersaglio ed illustrano che il profilo di internalizzazione è una proprietà dell'anticorpo di per sé. In effetti, la precisione del test ed i flussi di lavoro sono tali da poter confrontare contemporaneamente centinaia di anticorpi diversi ed ottenere un ulteriore throughput attraverso la miniaturizzazione al formato a 384 pozzetti.
Conclusioni
Le caratteristiche principali dell'approccio descritto in questa nota applicativa sono:
• Un protocollo di etichettatura in un'unica fase per contrassegnare facilmente gli anticorpi di interesse con un colorante sensibile al pH accoppiato Fab mirato a Fc (Incucyte® Fabfluor-pH). Il metodo di etichettatura è condotto in piena media ed è adatto per anticorpi purificati e surnatanti di anticorpi.
• Un metodo di analisi automatizzato, basato su immagini ed in tempo reale (imaging ed analisi di cellule vive Incucyte®) per monitorare l'internalizzazione in più micropiastre a 96 pozzetti contemporaneamente. Il formato è suscettibile sia alle cellule aderenti che a quelle non aderenti.
• Un sistema di analisi che segue l'andamento a tempo pieno della biologia e riporta l'internalizzazione con elevata specificità, sensibilità e informazioni morfologiche.
L'uso di un colorante sensibile al pH fornisce un segnale di fondo basso ed elimina la necessità di separare la fluorescenza derivante dall'anticorpo sulla superficie cellulare o nella soluzione di massa.
Presi insieme, questi attributi forniscono una soluzione semplice, integrata e quantitativa per studiare direttamente l'interiorizzazione degli anticorpi nelle cellule che può essere facilmente ridimensionata per confrontare molti anticorpi (10-100) in parallelo. Questo metodo consente di implementare le misurazioni dell'internalizzazione degli anticorpi nelle fasi precedenti del processo di scoperta dei prodotti biologici e si dimostrerà prezioso in termini di efficacia, sicurezza e ottimizzazione farmacocinetica di nuovi anticorpi terapeutici. Inoltre, il metodo è adatto alla comprensione dei meccanismi di base dell'endocitosi, della pinocitosi e del turnover del recettore in cui possono essere impiegati gli anticorpi.
Da:
https://www.sartorius.com/resource/blob/1405446/2cc3865f26eb34abcfcece3e0b95f39b/empowering-antibody-discovery-incucyte-ebook-en-l-sartorius-1--data.pdf
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