Reverse Transcription / Trascrizione inversa

Reverse Transcription / Trascrizione inversa

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Reverse transcription is the process of transcribing RNA molecules into complementary DNA. This cDNA synthesis reaction is mediated by enzymes called reverse transcriptases, or RTs. Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase is one of the RTs used in molecular biology workflows. However, novel engineered RTs are often preferred for enhanced efficiency, improved thermostability, and higher cDNA yields.

How do reverse transcriptases work?

Reverse transcription reactions involve multiple steps to synthesize cDNA. Reverse transcriptases exhibit several distinct biochemical activities, predominantly RNA-dependent DNA polymerase activity and RNase H activity. Firstly, reverse transcriptase binds to an RNA template in the presence of an annealed primer. Next, the RNA-dependent DNA polymerase activity of the enzyme synthesizes cDNA by incorporating dNTPs from the reaction mix. This generates a cDNA:RNA hybrid and is referred to as first-strand cDNA synthesis. If reverse transcriptase exhibits RNase H activity (as in wild-type M-MLV RT), the RNA of the cDNA:RNA hybrid is cleaved during first-strand synthesis. In engineered enzymes, RNase H activity is often reduced to prevent premature RNA degradation.

RT enzymes and cDNA synthesis kits

Choose from a variety of reverse transcriptase stand-alone enzymes, master mixes, cDNA synthesis kits, primers, and dNTP solutions to suit your application. Invitrogen SuperScript IV products aid in exceptional cDNA synthesis from any type of template RNA.

Reverse transcription is the synthesis of complementary DNA (cDNA) using single-stranded RNA as a template and reverse transcriptase enzyme. The cDNA can be used as a template for PCR amplification, cDNA library construction, RNA sequencing, and more. Selecting the right reverse transcriptase is critical to detecting low-abundance RNAs in a sample and obtaining high yields of full-length cDNA.

Considerations for selecting the right reverse transcriptase

Sensitivity, thermostability, processivity, and inhibitor tolerance of reverse transcriptases all affect the quantity and length of cDNA synthesized.

Sensitivity

The ability of a reverse transcriptase to generate cDNA from the lowest amount of input RNA is an important attribute when working with low-copy genes or difficult sample sources where RNA may have already degraded.

Thermostability

Thermostable reverse transcriptases allow reactions to occur at higher temperatures, which help denature RNA with strong secondary structure or high GC content, for generation of longer cDNA, higher cDNA yields, and better coverage of RNA populations in the cDNA.

Processivity 

Processivity is the enzyme's ability to add consecutive nucleotides without releasing the template. Highly processive reverse transcriptases allow synthesis of longer cDNA strands in a shorter reaction time, and overall better efficiency in making full-length cDNA.

Inhibitor tolerance 

Compounds that have inhibitory effects on reverse transcriptases are common in RNA samples even after purification. Their sources include reagents used for RNA isolation and contaminants carried over from biological samples. Reverse transcriptases resistant to common inhibitors help minimize inconsistent or suboptimal results in cDNA-based assays.

Genomic DNA removal

RNA purification methods, including protocols with DNase digestion on-column, often fail to remove gDNA completely. Amplification of contaminating gDNA can cause inaccurate results. Traditional gDNA decontamination protocols with DNase I include time-consuming DNase inactivation or removal steps under conditions that can damage RNA and affect results.

Both the SuperScript IV One-Step RT-PCR System and SuperScript IV VILO Master Mix are available in a format with the novel dsDNA-specific Invitrogen™ ezDNase™ enzyme, which enables efficient, fast, and gentle (<5 min at 37°C) gDNA removal from RNA samples to help ensure high confidence in RT-PCR and RT-qPCR results.

Reverse transcription primers

The priming strategy you choose for reverse transcription is important for cDNA synthesis efficiency, consistency, and yield. Each primer type has its benefits and drawbacks, depending on the individual target RNA. For full-length first-strand cDNA synthesis, oligo(dT) primers are recommended because of their specificity for eukaryotic mRNA, and they allow many different targets to be studied from the same cDNA pool. Oligo(dT) primers typically are strings of 12–20 deoxythymidines. We offer oligo(dT) in different lengths and formats for flexibility in your reverse transcription experiments.

For target mRNA containing strong transcriptional pauses, random primers are better suited because they anneal throughout the target molecules. They are also ideal for nonpolyadenylated RNA, such as bacterial RNA

Helpful tip

 To avoid poly(A) slippage during priming, anchored oligo(dT) primers can be used to anneal to the 5´ end of the poly(A) tail of mRNA and prevent priming within the poly(A) tail.

ITALIANO

La trascrizione inversa è il processo di trascrizione di molecole di RNA in DNA complementare. Questa reazione di sintesi del cDNA è mediata da enzimi chiamati trascrittasi inversa o RT. La trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney (M-MLV) è uno degli RT utilizzati nei flussi di lavoro di biologia molecolare. Tuttavia, i nuovi RT ingegnerizzati sono spesso preferiti per una maggiore efficienza, una migliore termostabilità e maggiori rese di cDNA.

Come funzionano le trascrittasi inverse?

Le reazioni di trascrizione inversa comportano più passaggi per sintetizzare il cDNA. Le trascrittasi inverse mostrano diverse attività biochimiche distinte, prevalentemente attività della DNA polimerasi RNA-dipendente e attività dell'RNasi H. In primo luogo, la trascrittasi inversa si lega a un modello di RNA in presenza di un primer ricotto. Successivamente, l'attività della DNA polimerasi RNA-dipendente dell'enzima sintetizza il cDNA incorporando i dNTP dalla miscela di reazione. Questo genera un ibrido cDNA:RNA ed è indicato come sintesi di cDNA di primo filamento. Se la trascrittasi inversa mostra attività RNasi H (come in M-MLV RT wild-type), l'RNA dell'ibrido cDNA:RNA viene scisso durante la sintesi del primo filamento. Negli enzimi ingegnerizzati, l'attività dell'RNasi H è spesso ridotta per prevenire la degradazione prematura dell'RNA.

Enzimi RT e kit di sintesi del cDNA

Scegli tra una vasta gamma di enzimi autonomi di trascrittasi inversa, master mix, kit di sintesi di cDNA, primer e soluzioni dNTP per soddisfare la tua applicazione. I prodotti Invitrogen SuperScript IV contribuiscono a un'eccezionale sintesi di cDNA da qualsiasi tipo di RNA stampo.

La trascrizione inversa è la sintesi del DNA complementare (cDNA) utilizzando l'RNA a filamento singolo come stampo e l'enzima trascrittasi inversa. Il cDNA può essere utilizzato come modello per l'amplificazione PCR, la costruzione di librerie di cDNA, il sequenziamento dell'RNA e altro ancora. La selezione della giusta trascrittasi inversa è fondamentale per rilevare RNA a bassa abbondanza in un campione e ottenere rese elevate di cDNA a lunghezza intera.

Considerazioni per la selezione della giusta trascrittasi inversa

La sensibilità, la termostabilità, la processività e la tolleranza agli inibitori delle trascrittasi inverse influenzano tutte la quantità e la lunghezza del cDNA sintetizzato.

Sensibilità

La capacità di una trascrittasi inversa di generare cDNA dalla quantità minima di RNA di input è un attributo importante quando si lavora con geni a bassa copia o fonti di campioni difficili in cui l'RNA potrebbe essersi già degradato.

Termostabilità

Le trascrittasi inverse termostabili consentono il verificarsi di reazioni a temperature più elevate, che aiutano a denaturare l'RNA con una forte struttura secondaria o un alto contenuto di GC, per la generazione di cDNA più lungo, rese di cDNA più elevate e una migliore copertura delle popolazioni di RNA nel cDNA.

Processività

La processività è la capacità dell'enzima di aggiungere nucleotidi consecutivi senza rilasciare il modello. Le trascrittasi inverse altamente processive consentono la sintesi di filamenti di cDNA più lunghi in un tempo di reazione più breve e una migliore efficienza complessiva nella produzione di cDNA a lunghezza intera.

Tolleranza agli inibitori

I composti che hanno effetti inibitori sulla trascrittasi inversa sono comuni nei campioni di RNA anche dopo la purificazione. Le loro fonti includono reagenti utilizzati per l'isolamento dell'RNA e contaminanti riportati da campioni biologici. Le trascrittasi inverse resistenti ai comuni inibitori aiutano a ridurre al minimo i risultati incoerenti o non ottimali nei test basati sul cDNA.

Rimozione del DNA genomico

I metodi di purificazione dell'RNA, compresi i protocolli con digestione con DNasi in colonna, spesso non riescono a rimuovere completamente il gDNA. L'amplificazione del gDNA contaminante può causare risultati imprecisi. I tradizionali protocolli di decontaminazione del gDNA con DNasi I includono lunghe fasi di inattivazione o rimozione della DNasi in condizioni che possono danneggiare l'RNA e influire sui risultati.

Sia il SuperScript IV One-Step RT-PCR System che il SuperScript IV VILO Master Mix sono disponibili in un formato con il nuovo enzima Invitrogen™ ezDNase™ specifico per dsDNA, che consente un'analisi efficiente, rapida e delicata (<5 min a 37°C ) rimozione del gDNA dai campioni di RNA per contribuire a garantire un'elevata affidabilità nei risultati RT-PCR e RT-qPCR.

Primer di trascrizione inversa

La strategia di priming scelta per la trascrizione inversa è importante per l'efficienza, la consistenza e la resa della sintesi del cDNA. Ogni tipo di primer ha i suoi vantaggi e svantaggi, a seconda del singolo RNA bersaglio. Per la sintesi di cDNA a lunghezza intera del primo filamento, i primer oligo(dT) sono raccomandati a causa della loro specificità per l'mRNA eucariotico e consentono di studiare molti bersagli diversi dallo stesso pool di cDNA. I primer Oligo(dT) sono tipicamente stringhe di 12-20 deossitimidine. Offriamo oligo(dT) in diverse lunghezze e formati per flessibilità nei tuoi esperimenti di trascrizione inversa.

Per l'mRNA bersaglio contenente forti pause trascrizionali, i primer casuali sono più adatti perché si ricottono attraverso le molecole bersaglio. Sono anche ideali per l'RNA non poliadenilato, come l'RNA batterico

Suggerimento utile

 Per evitare lo slittamento del poli(A) durante l'adescamento, è possibile utilizzare primer oligo(dT) ancorati per la ricottura all'estremità 5' della coda del poli(A) dell'mRNA e impedire l'adescamento all'interno della coda del poli(A).

Da:

http://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/molecular-biology-workflow-solutions-brochure.pdf