3D Spheroid-Based Tumor Invasion Assay / Saggio di invasione tumorale basato su sferoidi 3D

 3D Spheroid-Based Tumor Invasion Assay.  The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application. / Saggio di invasione tumorale basato su sferoidi 3D. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 10. Invading and main tumoroid area object masking. Zoomed 4x brightfield 2 × 3 montage, 20-plane z-stack images of (A) uninhibited U-87/fibroblast tumoroids; or (B) uninhibited LN-229/fibroblast tumoroids. Exterior primary masks around cells and invadopodia, and interior secondary masks around noninvading cellular structure only. / Mascheramento dell'oggetto invasivo e dell'area tumoroide principale. Montaggio ingrandito 4x in campo chiaro 2 × 3, immagini z-stack a 20 piani di (A) tumoreidi U-87 / fibroblasti disinibiti; o (B) tumoreidi LN-229/fibroblasti non inibiti. Maschere primarie esterne attorno alle cellule e agli invadopodi e maschere secondarie interne solo attorno alla struttura cellulare non invasiva.

Abstract

Establishment of in vitro models that mimic tumor invasion as part of the metastatic process are a critical part of oncology research. The need to incorporate multiple cell types, long-term kinetic analysis, methods to allow 3D invasion into the surrounding matrix, and appropriate detection and analysis, has made it difficult to create new models. The procedure described in this application note meets these needs through inclusion of advanced imaging capabilities allowing for capture of multiple images throughout a range of z-heights, using brightfield and fluorescence channels in a kinetic fashion. Final processed images, following stitching and z-projection, enable accurate cellular analysis to discern the invasive capabilities of 3D cellular structures over time.

Introduction

Oncology drug discovery has been met with multiple challenges over the years. As cancers develop multiple mutations during carcinogenesis, targeted approaches to individual gene mutations common to many drug discovery campaigns have mostly limited efficacy. Conversely, the advancement of novel methods that focus on the inhibition of the invasive phenotype of metastasis offers greater potential for meaningful intervention, particularly due to the fact that most cancer patients die only after metastasis has occurred. For this approach to work, in vitro cell models used in early drug discovery should mimic as close as possible the complex metastatic process. Tumors in vivo exist as a three-dimensional (3D) mass of multiple cell types, including cancer and stromal cells. Therefore, incorporating a 3D spheroid-type cellular structure that includes co-cultured cell types forming a tumoroid provides a more predictive model than the use of individual cancer cells seeded in microplates. A further constraint is the need for long-term kinetic experiments to capture the invasion process which typically require multiple days. Thus, environment control of the assay is needed such that the cell viability of the spheroid is maintained over this long period and putative drug effects properly assessed. Finally, the only suitable readout for monitoring tumor invasion is microscopy due to the small size of the spheroid. To be effective in drug discovery, the microscope must have automated image capture, processing, and analysis to be able to cope with the multiple assay conditions, compounds tested, and kinetic images taken.

This work will demonstrate a procedure for the generation of 3D spheroidal tumoroid structures, creation of a suitable invasion matrix, automated kinetic image-based monitoring, and cellular analysis of captured z-stacked images of tumor invasion

U-87 and LN-229 glioblastoma multiforme (GBM) cell lines were used in this study as they have demonstrated phenotypic differences and metastatic ability. Notably, the growth suppressing PTEN gene is mutated in U-87 cells, yet functions normally in LN-229 cells. Additionally, the human cytomegalovirus phosphotransferase protein UL-97 inhibits DNA elongation and replication and is absent from U-87 cells, but present in LN-229 cells.2 This supports a more aggressive growth and invasion pattern for U-87 cells. Both cell types were co-cultured with fibroblasts to create 3D tumoroids more closely representing in vivo tumor conditions and allowed to invade through a protein matrix.

17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), known to inhibit the function of heat shock protein 90 (Hsp90), a chaperone protein that stabilizes proteins required for tumor growth, was used here to inhibit potential tumor invasion.3 Quantification of kinetic captured images was used to characterize the invading potential of inhibited and uninhibited tumoroid cultures.

Materials and methods

Materials

Cells

U-87 GBM cells expressing GFP were generously donated by Dr. Sachin Katyal (University of Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada). LN-229 GBM cells (part number CRL-2611) were obtained from ATCC (Manassas, VA). Human neonatal dermal fibroblasts expressing RFP (part number cAP-0008RFP) were purchased from Angio-Proteomie (Boston, MA).

Experimental components

Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free (part number 356237) was purchased from Corning Life Sciences (Corning, NY). The selective Hsp90 inhibitor 17-AAG (part number 1515) was sourced from Tocris Bioscience (Avonmouth, Bristol, UK). CellTracker Deep Red dye (part number C34565) was purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). 96-well, cell-repellent, polystyrene, round bottom, clear, sterile, microplates with lid (part number 650979) were generously donated by Greiner Bio-One North America, Inc. (Monroe, NC)

Agilent BioTek Cytation 5 cell imaging multimode reader

Cytation 5 is a modular multimode microplate reader combined with an automated digital microscope. Filter- and monochromator-based microplate reading are available, and the microscopy module provides up to 60x magnification in fluorescence, brightfield, color brightfield, and phase contrast. The instrument can perform fluorescence imaging in up to four channels in a single step. With special emphasis on live cell assays, Cytation 5 features shaking, temperature control to 65 °C, CO2/O2 gas control and dual injectors for kinetic assays and is controlled by integrated Agilent BioTek Gen5 microplate reader and imager software, which also automates image capture, analysis, and processing. The instrument was used to kinetically monitor 3D tumoroid activity over the incubation period.

Agilent BioTek BioSpa 8 automated incubator

The BioSpa 8 automated incubator links Agilent BioTek readers or imagers together with Agilent BioTek washers and dispensers for full workflow automation of up to eight microplates. Temperature, CO2/O2 and humidity levels are controlled and monitored through the Agilent BioTek BioSpa software to maintain an ideal environment for cell cultures during all experimental stages. Test plates were incubated in the BioSpa to maintain proper atmospheric conditions for a period of seven days and automatically transferred to the Cytation 5 every twelve hours for brightfield and fluorescence imaging.

Agilent BioTek MultiFlo FX multimode dispenser

The MultiFlo FX is a modular, upgradable reagent dispenser that can have as many as two peri-pump (8 tube dispensers), two syringe pump dispensers, and a strip washer. The syringe and washer manifolds can be configured for plate densities from 6- to 384-well.

Methods

Cell preparation and tumoroid formation

Prepared U-87 and fibroblast cells were each harvested and combined in a final concentration of 2.5 × 104 cells/mL for each cell type in complete medium. After dispensing 100 μL of cell suspension into appropriate microplate wells, the microplate was incubated at 37 °C/5% CO2 for 48 hours to allow cells to aggregate into tumoroids. This process was repeated using LN-229 cells stained with CellTracker Deep Red dye and fibroblast cells at the same concentrations and volumes.

Invasion matrix preparation

Upon completion of tumoroid formation, 70 μL of complete medium was robotically removed from each well, and the tumoroid plate placed on ice in a refrigerator for five minutes to cool the cells. Matrigel matrix was then thawed on ice. 17-AAG was diluted to a 2x concentration of 20,000 nM in invasion media and used to create an eight-point titration from 20,000 nM to 0 nM using serial 1:4 dilutions. The inhibitor titrations were further diluted to a 1x concentration by combining with either invasion media or Matrigel matrix. With the plate still on ice, 70 μL of Matrigel matrix plus titrated compound were added to each well containing tumoroids, then overlaid with 100 μL invasion media containing titrated compound. The microplate was centrifuged at 300 × g for five minutes in a swinging bucket centrifuge that was previously set to 4 °C for tumoroid positioning, then transferred to a 37 °C/5% CO 2 incubator for one hour to initiate gel formation.

Tumor invasion assay performance

After gel formation was complete, the microplate was transferred to BioSpa 8, where the software was programmed such that the microplate was automatically transferred to Cytation 5 for brightfield and fluorescent imaging of the wells every twelve hours over the seven-day incubation period. Table 1 lists the settings used to perform automated image capture of each sample well.

Image processing

Individual image tiles from each z-plane captured using the three by two montage were then stitched together.

A single image projection was then created from the 20-slice stitched z-stack. The focus stacking method was chosen, which automatically selects the most in focus pixel from each image in the stack for inclusion in the final projection. This allows the most accurate analysis to be carried out on each invading tumoroid at each time point

Tumoroid invasion analysis

Primary mask cellular analysis criteria were applied using the brightfield channel to automatically place object masks around the entire invading structure in each final image. Secondary mask cellular analysis criteria were also applied to place an additional mask around noninvasive cells remaining within the original spherical tumoroid structure.

Results and discussion

Raw image processing prior to cellular analysis

During the seven-day incubation period, uninhibited

U-87/fibroblast tumoroids continued to increase in size, as well as invade into the protein matrix. To ensure that the entire invading structure, including invadopodia, was captured in the X- and Y-axes, regardless of size, multiple images were taken on a single z-plane in a montage format. Figure  illustrates four of the six images that were captured containing portions of the invading structure.

As invasion proceeds, proteins and cells invade on multiple planes within the Z-axis. Therefore, images were automatically taken across a range of z-heights so that all portions of the overall structure were in focus in the final z-projected images.

By viewing the fluorescent signal emitted by each co-cultured cell type, in comparison to the brightfield signal from the entire structure, individual cell migration can be observed. In the case of the U-87/fibroblast model, the brightfield image demonstrates extensive invadopodia extending out from the original propagating tumoroid. From the GFP image in Figure 4B, it is evident that GFP-expressing U-87 cells follow invadopodia invasion into the matrix. This contrasts to the RFP image in Figure confirming that RFP-expressing fibroblasts exhibit little to no migratory ability within this experimental model.

Kinetic image capture

Finally, z-projected images are captured kinetically every 12 hours to observe phenotypic changes in the

U-87/fibroblast co-cultured tumoroids following treatment with varying concentrations of 17-AAG. Uninhibited tumoroids, as expected, demonstrate a highly invasive nature, exhibiting an increase in the size of the tumoroid body as well as a dramatic increase in invadopodia.

LN-229/Fibroblast tumoroid analysis

LN-229/fibroblast tumoroid imaging was also conducted in the same manner as that for the U-87/fibroblast tumoroids. This was done to compare differences in growth and invadopodia production between GBM cell types known to be highly invasive (U-87) and those with less invasive ability (LN-229).5 Changes in the complete 3D structure were observed using the overlaid brightfield and fluorescent images, while individual LN-229 or fibroblast invasion was monitored by signal captured with the individual CY5 or RFP channels, respectively.

When comparing kinetic brightfield images from the two co-cultured cell types, it is evident that LN-229/fibroblast tumoroids propagate over time, as seen by the increase in spheroid size, but do not exhibit the invasive properties clearly demonstrated by U-87/fibroblast tumoroids over the same incubation period.

Agilent BioTek Gen5 Image+-based cellular analysis of tumoroid invasion

In addition to qualitative assessments of tumoroid phenotypic changes, quantification of the extent of invasion was also carried out using the stitched, z-projected brightfield images. Two separate cellular analyses were performed following treatment with the 17-AAG titration. In the first, the primary cellular analysis capabilities available in Gen5 Image+, and the criteria listed used changes in brightfield signal within the image between cellular containing pixels and background to place detailed object masks around the complete invading 3D structure, despite the level of compound treatment.

The area covered by the entire tumoroid for each captured image over time was then calculated. Values from subsequent time points were then divided by the area value calculated at time 0 for the specific tumoroid to normalize results and account for variability in tumoroid size following cell dispensing and aggregation. Area ratios were then plotted (Y-axis) with regards to time (X-axis).

From the results seen in Figure, it is apparent that both U-87/fibroblast and LN-229/fibroblast tumoroids propagate within the Matrigel matrix when unimpeded over the sevenday incubation period. It can also be seen that the compound 17-AAG is able to limit, or even completely stop, tumoroid growth in a dose-dependent manner, as expected.3 What is also clear from the total area ratio graphs is the increased rate of growth for the complete 3D structure exhibited by U-87/fibroblast tumoroids compared to those where LN-229 cells are co-cultured with fibroblasts. Increases in the area covered by the entire tumoroid are approximately 2x over time for tumoroids cultured with U-87 cells (ratio: 4.4) compared to those cultured with LN-229 cells (ratio: 2.4).

Agilent BioTek Gen5 Image Prime-based cellular analysis of tumoroid invasion

A second cellular analysis was also performed using the primary and secondary cellular analysis capabilities available in Gen5 Image Prime, and the criteria listed, to measure the area solely covered by noninvading cells within the tumoroid. To determine the metastatic ability of 3D in vitro models, both uninhibited, or following treatment, it is important to distinguish between area covered by cells within the original tumoroid and that covered by invadopodia. As the more densely packed noninvasive, propagating cells appear darker compared to invadopodia in a brightfield image (Figure 1A), this additional change in signal within the original mask allows placement of a secondary mask to exclude the invading areas of each tumoroid and separate the area covered by the two portions of the entire 3D structure (Figure 1).

By applying the secondary mask around noninvading portions of the tumoroid, differences in the invasive qualities of the two GBM cell types then becomes clear.

The area covered by invadopodia for U-87/fibroblast tumoroids increases dramatically over the seven day incubation period. LN-229/fibroblast tumoroids, by comparison, show little increase in invadopodia over the same time. This dual analysis, therefore, has the potential to determine not only how rapidly tumoroid cells are propagating, but also the invasive nature of the cell model

Conclusion

Application of advanced cellular imaging capabilities, such as taking multiple images on a single z-plane as well as in a z-stack, allows all portions of an invading 3D cellular tumoroid structure to be captured in focus. When stitched and projected to a final image, accurate analysis can then be performed. The ability to view entire tumoroids via brightfield imaging, as well as individual cell types through fluorescent imaging, also allows for determination of the invasive properties of each co-cultured cell type within the included cell model. Inclusion of label-free cellular analysis, carried out on brightfield images, can then quantify not only propagative qualities, but also the specific invasive nature of in vitro 3D cell models when uninhibited and in response to test molecules.

ITALIANO

Riassunto

La creazione di modelli in vitro che imitano l'invasione tumorale come parte del processo metastatico è una parte fondamentale della ricerca oncologica. La necessità di incorporare più tipi di cellule, analisi cinetiche a lungo termine, metodi per consentire l’invasione 3D nella matrice circostante e rilevamento ed analisi appropriati, ha reso difficile la creazione di nuovi modelli. La procedura descritta in questa nota applicativa soddisfa queste esigenze includendo funzionalità di imaging avanzate che consentono l'acquisizione di più immagini in un intervallo di altezze z, utilizzando canali di campo chiaro e fluorescenza in modo cinetico. Le immagini finali elaborate, dopo la cucitura e la proiezione z, consentono un'analisi cellulare accurata per discernere le capacità invasive delle strutture cellulari 3D nel tempo.

Introduzione

La scoperta di farmaci oncologici ha dovuto affrontare molteplici sfide nel corso degli anni. Poiché i tumori sviluppano molteplici mutazioni durante la carcinogenesi, gli approcci mirati alle singole mutazioni genetiche comuni a molte campagne di scoperta di farmaci hanno per lo più un’efficacia limitata. Al contrario, il progresso di nuovi metodi che si concentrano sull’inibizione del fenotipo invasivo delle metastasi offre un maggiore potenziale per interventi significativi, in particolare perché la maggior parte dei pazienti affetti da cancro muore solo dopo che si sono verificate le metastasi. Affinché questo approccio funzioni, i modelli cellulari in vitro utilizzati nella scoperta precoce dei farmaci dovrebbero imitare il più fedelmente possibile il complesso processo metastatico. I tumori in vivo esistono come una massa tridimensionale (3D) di più tipi cellulari, comprese le cellule tumorali e stromali. Pertanto, l'incorporazione di una struttura cellulare di tipo sferoide 3D che include tipi di cellule co-coltivate che formano un tumoreide fornisce un modello più predittivo rispetto all'uso di singole cellule tumorali seminate in micropiastre. Un ulteriore vincolo è la necessità di esperimenti cinetici a lungo termine per catturare il processo di invasione che in genere richiede più giorni. Pertanto, è necessario il controllo ambientale del test in modo tale che la vitalità cellulare dello sferoide venga mantenuta per questo lungo periodo e gli effetti putativi del farmaco siano adeguatamente valutati. Infine, l'unica lettura adatta per monitorare l'invasione tumorale è la microscopia a causa delle piccole dimensioni dello sferoide. Per essere efficace nella scoperta di farmaci, il microscopio deve disporre di acquisizione, elaborazione ed analisi automatizzate delle immagini per essere in grado di far fronte alle molteplici condizioni di analisi, ai composti testati ed alle immagini cinetiche acquisite.

Questo lavoro dimostrerà una procedura per la generazione di strutture tumoreidi sferoidali 3D, la creazione di una matrice di invasione adeguata, il monitoraggio automatizzato basato su immagini cinetiche e l'analisi cellulare delle immagini z-stacked catturate dell'invasione tumorale

In questo studio sono state utilizzate le linee cellulari di glioblastoma multiforme (GBM) U-87 e LN-229 poiché hanno dimostrato differenze fenotipiche e capacità metastatica. In particolare, il gene PTEN che sopprime la crescita è mutato nelle cellule U-87, ma funziona normalmente in LN -229 celle. Inoltre, la proteina UL-97 della fosfotransferasi del citomegalovirus umano inibisce l'allungamento e la replicazione del DNA ed è assente nelle cellule U-87, ma presente nelle cellule LN-229.2 Ciò supporta un modello di crescita e invasione più aggressivo per le cellule U-87. Entrambi i tipi di cellule sono stati coltivati ​​in co-coltura con fibroblasti per creare tumoreidi 3D che rappresentassero più da vicino le condizioni tumorali in vivo e hanno permesso l'invasione attraverso una matrice proteica.

La 17-allilammino-17-demetossigeldanamicina (17-AAG), nota per inibire la funzione della proteina da shock termico 90 (Hsp90), una proteina chaperone che stabilizza le proteine ​​necessarie per la crescita del tumore, è stata utilizzata in questo caso per inibire la potenziale invasione tumorale. Quantificazione di le immagini cinetiche catturate sono state utilizzate per caratterizzare il potenziale di invasione delle colture tumoroidi inibite e non inibite.

Materiali e metodi

Materiali

Cellule

Le cellule GBM U-87 che esprimono GFP sono state generosamente donate dal Dr. Sachin Katyal (Università di Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada). Le cellule LN-229 GBM (numero di parte CRL-2611) sono state ottenute da ATCC (Manassas, VA). Fibroblasti dermici neonatali umani che esprimono RFP (codice articolo cAP-0008RFP) sono stati acquistati da Angio-Proteomie (Boston, MA).

Componenti sperimentali

La matrice della membrana basale Matrigel, priva di rosso fenolo (numero parte 356237) è stata acquistata da Corning Life Sciences (Corning, NY). L'inibitore selettivo Hsp90 17-AAG (codice articolo 1515) è stato fornito da Tocris Bioscience (Avonmouth, Bristol, Regno Unito). Il colorante CellTracker Deep Red (codice articolo C34565) è stato acquistato da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Micropiastre da 96 pozzetti, repellenti per cellule, in polistirolo, a fondo rotondo, trasparenti, sterili, con coperchio (codice articolo 650979) sono state generosamente donate da Greiner Bio-One North America, Inc. (Monroe, NC)

Lettore multimodale per imaging cellulare Agilent BioTek Cytation 5

Cytation 5 è un lettore di micropiastre multimodale modulare combinato con un microscopio digitale automatizzato. È disponibile la lettura di micropiastre basata su filtro e monocromatore e il modulo di microscopia fornisce un ingrandimento fino a 60x in fluorescenza, campo chiaro, campo chiaro a colori e contrasto di fase. Lo strumento può eseguire l'imaging in fluorescenza fino a quattro canali in un unico passaggio. Con particolare attenzione ai test su cellule vive, Cytation 5 è dotato di agitazione, controllo della temperatura fino a 65 °C, controllo del gas CO2/O2 e doppi iniettori per test cinetici ed è controllato dal lettore di micropiastre Agilent BioTek Gen5 integrato e dal software imager, che automatizza anche l'acquisizione delle immagini, analisi ed elaborazione. Lo strumento è stato utilizzato per monitorare cineticamente l'attività tumoreide 3D durante il periodo di incubazione.

Incubatore automatizzato Agilent BioTek BioSpa 8

L'incubatore automatizzato BioSpa 8 collega i lettori o gli imager Agilent BioTek con i lavatori ed i dispensatori Agilent BioTek per l'automazione completa del flusso di lavoro fino a otto micropiastre. I livelli di temperatura, CO2/O2 e umidità sono controllati e monitorati tramite il software Agilent BioTek BioSpa per mantenere un ambiente ideale per le colture cellulari durante tutte le fasi sperimentali. Le piastre di prova sono state incubate nella BioSpa per mantenere condizioni atmosferiche adeguate per un periodo di sette giorni e trasferite automaticamente al Cytation 5 ogni dodici ore per l'imaging in campo chiaro e in fluorescenza.

Erogatore multimodale Agilent BioTek MultiFlo FX

MultiFlo FX è un erogatore di reagenti modulare e aggiornabile che può avere fino a due peri-pompe (distributori da 8 tubi), due erogatori con pompa a siringa e un lavastrisce. I collettori della siringa e del dispositivo di lavaggio possono essere configurati per densità di piastre da 6 a 384 pozzetti.

Metodi

Preparazione cellulare e formazione del tumoreide

Le cellule U-87 e fibroblastiche preparate sono state raccolte e combinate in una concentrazione finale di 2,5 × 104 cellule/mL per ciascun tipo di cellula in mezzo completo. Dopo aver dispensato 100 μL di sospensione cellulare nei pozzetti appropriati della micropiastra, la micropiastra è stata incubata a 37°C/5% CO2 per 48 ore per consentire alle cellule di aggregarsi in tumoreidi. Questo processo è stato ripetuto utilizzando cellule LN-229 colorate con il colorante CellTracker Deep Red e cellule di fibroblasti alle stesse concentrazioni e volumi.

Preparazione della matrice di invasione

Una volta completata la formazione del tumoreide, 70 μL di mezzo completo sono stati rimossi roboticamente da ciascun pozzetto e la piastra tumoreide è stata posta sul ghiaccio in un frigorifero per cinque minuti per raffreddare le cellule. La matrice Matrigel è stata quindi scongelata su ghiaccio. Il 17-AAG è stato diluito a una concentrazione 2x di 20.000 nM in mezzi di invasione e utilizzato per creare una titolazione in otto punti da 20.000 nM a 0 nM utilizzando diluizioni seriali 1:4. Le titolazioni degli inibitori sono state ulteriormente diluite a una concentrazione 1x combinandole con mezzi di invasione o matrice Matrigel. Con la piastra ancora sul ghiaccio, sono stati aggiunti 70 μL di matrice Matrigel più composto titolato a ciascun pozzetto contenente tumoreidi, quindi sovrapposti con 100 μL di terreno di invasione contenente il composto titolato. La micropiastra è stata centrifugata a 300 x g per cinque minuti in una centrifuga a secchio oscillante precedentemente impostata a 4°C per il posizionamento del tumoreide, quindi trasferita in un incubatore a 37°C/5% CO2 per un'ora per avviare la formazione del gel.

Prestazioni del test di invasione tumorale

Una volta completata la formazione del gel, la micropiastra è stata trasferita a BioSpa 8, dove il software è stato programmato in modo tale che la micropiastra fosse automaticamente trasferita a Cytation 5 per l'imaging in campo chiaro e fluorescente dei pozzetti ogni dodici ore durante il periodo di incubazione di sette giorni. La tabella elenca le impostazioni utilizzate per eseguire l'acquisizione automatizzata delle immagini di ciascun pozzetto del campione.

Elaborazione delle immagini

Le singole tessere di immagine di ciascun piano z catturate utilizzando il montaggio tre per due sono state quindi unite insieme.

È stata quindi creata una singola proiezione di immagine dallo z-stack cucito a 20 sezioni. È stato scelto il metodo focus stacking, che seleziona automaticamente il pixel più a fuoco da ciascuna immagine nello stack per includerlo nella proiezione finale. Ciò consente di eseguire l'analisi più accurata su ciascun tumoreide invasore in ogni momento

Analisi dell'invasione tumorale

I criteri di analisi cellulare della maschera primaria  sono stati applicati utilizzando il canale in campo chiaro per posizionare automaticamente le maschere degli oggetti attorno all'intera struttura invasiva in ciascuna immagine finale. Sono stati applicati anche criteri di analisi cellulare della maschera secondaria per posizionare una maschera aggiuntiva attorno alle cellule non invasive rimanenti all'interno della struttura tumoroide sferica originale.

Risultati e discussione

Elaborazione delle immagini grezze prima dell'analisi cellulare

Durante il periodo di incubazione di sette giorni, disinibito, i tumoreidi U-87/fibroblasti hanno continuato ad aumentare di dimensioni, oltre a invadere la matrice proteica. Per garantire che l'intera struttura invasiva, inclusa l'invadopodia, fosse catturata negli assi X e Y, indipendentemente dalle dimensioni, sono state scattate più immagini su un singolo piano z in un formato di montaggio. La figura illustra quattro delle sei immagini catturate contenenti porzioni della struttura invasore.

Man mano che l’invasione procede, le proteine ​​e le cellule invadono su più piani all’interno dell’asse Z. Pertanto, le immagini sono state scattate automaticamente su una gamma di altezze z in modo che tutte le parti della struttura complessiva fossero a fuoco nelle immagini proiettate z finali.

Osservando il segnale fluorescente emesso da ciascun tipo di cellula in co-coltura, rispetto al segnale in campo chiaro dell'intera struttura, è possibile osservare la migrazione delle singole cellule. Nel caso del modello U-87/fibroblasto, l'immagine in campo chiaro dimostra un'estesa invadopodia che si estende dal tumoreide propagante originale. Dall'immagine GFP, è evidente che le cellule U-87 che esprimono GFP seguono l'invasione dell'invadopodia nella matrice. Ciò contrasta con l'immagine RFP, confermando che i fibroblasti che esprimono RFP mostrano poca o nessuna capacità migratoria all'interno di questo modello sperimentale.

Acquisizione di immagini cinetiche

Infine, le immagini proiettate su z vengono catturate cineticamente ogni 12 ore per osservare i cambiamenti fenotipici nei

Tumorioidi co-coltivati ​​U-87/fibroblasti dopo il trattamento con concentrazioni variabili di 17-AAG. I tumoreidi disinibiti, come previsto, dimostrano una natura altamente invasiva, esibendo un aumento delle dimensioni del corpo tumoroide e un drammatico aumento dell'invadopodia.

Analisi tumoreide LN-229/fibroblasti

Anche l'imaging tumoreide LN-229/fibroblasto è stato condotto nello stesso modo di quello per i tumoreidi U-87/fibroblasto. Ciò è stato fatto per confrontare le differenze nella crescita e nella produzione di invadopodia tra i tipi di cellule GBM noti per essere altamente invasivi (U-87) e quelli con capacità meno invasiva (LN-229).5 I cambiamenti nella struttura 3D completa sono stati osservati utilizzando il campo chiaro sovrapposto e immagini fluorescenti, mentre l'invasione individuale di LN-229 o fibroblasti è stata monitorata dal segnale catturato rispettivamente con i singoli canali CY5 o RFP.

Confrontando le immagini cinetiche in campo chiaro dei due tipi di cellule in co-coltura, è evidente che i tumoreidi LN-229/fibroblasti si propagano nel tempo, come si vede dall'aumento delle dimensioni dello sferoide, ma non mostrano le proprietà invasive chiaramente dimostrate dall'U-87 /tumoreidi fibroblasti nello stesso periodo di incubazione.

Analisi cellulare Agilent BioTek Gen5 basata su Image+ dell'invasione tumorale

Oltre alle valutazioni qualitative dei cambiamenti fenotipici tumoroidi, è stata effettuata anche la quantificazione dell'entità dell'invasione utilizzando le immagini in campo chiaro proiettate su z. Sono state eseguite due analisi cellulari separate dopo il trattamento con la titolazione 17-AAG. Nel primo, le funzionalità di analisi cellulare primaria disponibili in Gen5 Image+ ed i criteri elencati hanno utilizzato i cambiamenti nel segnale in campo chiaro all'interno dell'immagine tra i pixel contenenti il ​​cellulare e lo sfondo per posizionare maschere di oggetti dettagliate attorno all'intera struttura 3D invasiva, nonostante il livello del trattamento composto.

È stata quindi calcolata l'area coperta dall'intero tumoreide per ciascuna immagine catturata nel tempo. I valori dei punti temporali successivi sono stati quindi divisi per il valore dell'area calcolato al tempo 0 per il tumoreide specifico per normalizzare i risultati e tenere conto della variabilità nella dimensione del tumoreide in seguito alla dispensazione e all'aggregazione delle cellule. Sono stati quindi tracciati i rapporti delle aree (asse Y) rispetto al tempo (asse X).

Dai risultati visualizzati, è evidente che sia i tumoreidi U-87/fibroblasto che quelli LN-229/fibroblasto si propagano all'interno della matrice Matrigel quando senza ostacoli durante il periodo di incubazione di sette giorni. Si può anche vedere che il composto 17-AAG è in grado di limitare, o addirittura arrestare completamente, la crescita del tumoreide in modo dose-dipendente, come previsto. Ciò che risulta chiaro anche dai grafici del rapporto dell'area totale è l'aumento del tasso di crescita per la struttura 3D completa esibita dai tumoreidi U-87/fibroblasti rispetto a quelli in cui le cellule LN-229 sono co-coltivate con fibroblasti. Gli aumenti nell'area coperta dall'intero tumoreide sono circa 2 volte nel tempo per i tumoreidi coltivati ​​con cellule U-87 (rapporto: 4,4) rispetto a quelli coltivati ​​con cellule LN-229 (rapporto: 2,4).

Analisi cellulare basata su Agilent BioTek Gen5

 Image Prime dell'invasione tumorale

È stata eseguita anche una seconda analisi cellulare utilizzando le funzionalità di analisi cellulare primaria e secondaria disponibili in Gen5 Image Prime ed i criteri elencati, per misurare l'area coperta esclusivamente da cellule non invasive all'interno del tumoreide. Per determinare la capacità metastatica dei modelli 3D in vitro, sia non inibiti, sia dopo trattamento, è importante distinguere tra l'area coperta dalle cellule all'interno del tumoreide originale e quella coperta dagli invadopodi. Poiché le cellule non invasive più densamente concentrate ed in propagazione appaiono più scure rispetto all'invadopodia in un'immagine in campo chiaro (Figura 1A), questo ulteriore cambiamento nel segnale all'interno della maschera originale consente il posizionamento di una maschera secondaria per escludere le aree invasori di ciascun tumoreide e separare l'area coperti dalle due porzioni dell'intera struttura 3D (Figura 1).

Applicando la maschera secondaria attorno alle porzioni non invasive del tumoreide, le differenze nelle qualità invasive dei due tipi di cellule GBM diventano quindi chiare.

L'area coperta da invadopodia per i tumoreidi U-87/fibroblasti aumenta notevolmente durante il periodo di incubazione di sette giorni. I tumoreidi LN-229/fibroblasti, in confronto, mostrano un piccolo aumento dell'invadopodia nello stesso tempo. Questa doppia analisi, quindi, ha il potenziale per determinare non solo la rapidità con cui le cellule tumoroidi si stanno propagando, ma anche la natura invasiva del modello cellulare

Conclusione

L'applicazione di funzionalità avanzate di imaging cellulare, come l'acquisizione di più immagini su un singolo piano z così come in uno stack z, consente di catturare a fuoco tutte le porzioni di una struttura tumoroide cellulare 3D invasore. Una volta cuciti e proiettati su un'immagine finale, è possibile eseguire un'analisi accurata. La capacità di visualizzare interi tumoreidi tramite imaging in campo chiaro, nonché singoli tipi di cellule tramite imaging fluorescente, consente inoltre di determinare le proprietà invasive di ciascun tipo di cellula co-coltivata all'interno del modello cellulare incluso. L'inclusione dell'analisi cellulare senza etichetta, effettuata su immagini in campo chiaro, può quindi quantificare non solo le qualità propagative, ma anche la specifica natura invasiva dei modelli cellulari 3D in vitro quando non inibiti ed in risposta alle molecole test.

Da:

https://www.agilent.com/cs/library/brochures/ebook-labx-cell-gene-therapy-5994-7421en-agilent.pdf