A Novel Real-Time Co-Culture Assay Using xCelligence RTCA eSight for Immune Cell Invasion and Cytotoxicity / Un nuovo test di co-coltura in tempo reale utilizzando xCelligence RTCA eSight per l'invasione delle cellule immunitarie e la citotossicità
A Novel Real-Time Co-Culture Assay Using xCelligence RTCA eSight for Immune Cell Invasion and Cytotoxicity / Un nuovo test di co-coltura in tempo reale utilizzando xCelligence RTCA eSight per l'invasione delle cellule immunitarie e la citotossicità
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Advantages of RTCA eSight
- Biology: Tumor targets and immune
cells remain in contact with ECM
throughout the assay.
- Data collection: RTCA eSight
instrument collects impedance and
imaging readouts in real time and
in situ for 96 wells of xCELLigence
E-Plate View 96.
Limitation of Boyden chamber
- Biology: Immune cells migrate
through an ECM in the inner chamber
to perform target cell killing in the
outer chamber devoid of ECM that
could modulate cytotoxicity.
- Data collection: Cells must be
collected at predetermined intervals
and processed for flow cytometry
(Annexin V/propidium iodide
staining), colorimetric, or fluorimetric
quantification of cell death.
/ Configurazione del test di invasione-citotossicità. (A) Lo strumento RTCA eSight, E-plate View 96 e confronto della configurazione in uno dei 96 pozzi con una camera Boyden. I vantaggi di questa configurazione e i limiti nella raccolta dati degli approcci classici sono descritti nel riquadro. (B) Schema dei passaggi del test
Vantaggi di RTCA eSight - Biologia: i bersagli tumorali e le cellule immunitarie rimangono in contatto con l'ECM durante tutto il test. - Raccolta dati: lo strumento RTCA eSight raccoglie letture di impedenza e imaging in tempo reale e in situ per 96 pozzetti di xCELLigence E-Plate View 96.
Limitazione della camera di Boyden - Biologia: le cellule immunitarie migrano attraverso una ECM nella camera interna per eseguire l'uccisione delle cellule bersaglio nella camera esterna priva di ECM che potrebbe modulare la citotossicità. - Raccolta dati: le cellule devono essere raccolte a intervalli predeterminati e trattate per la citometria a flusso (colorazione con annessina V/ioduro di propidio), quantificazione colorimetrica o fluorimetrica della morte cellulare.
Introduction
Immune cells extravasate from blood vessels to infiltrate the tissues and perform
effector functions that play a crucial role in tumor immune surveillance. These
abilities are also harnessed by engineered cytotoxic natural killer (NKs) and Chimeric
Antigen Receptor (CAR)-T cells used for cancer immunotherapy.
Although cellular immunotherapy has demonstrated effectiveness in hematological
cancers, clinical responses in solid tumors need to be improved. The complex tumor
microenvironment (TME) in solid tumors regulates lymphocyte recruitment and
function. An important challenge faced by lymphocytes in solid tumors is to navigate
the acellular space filled with structural scaffolding of the extracellular matrix
(ECM) during migration/invasion. This ECM is heterogenous, and its components
can modulate a wide array of cellular responses in both resident tumor cells and
infiltrating lymphocytes.
Traditionally, invasion, migration and cytotoxicity are evaluated in different endpoint
assays using transwell assay systems to predict the in vivo function. The Boyden
Chamber is a classical transwell arrangement that is widely used to evaluate
migration and invasion. It consists of a cylindrical cell culture insert with a porous
membrane nested inside the well of a standard cell culture plate. Cell suspensions
are added to the inner chamber of the insert and induced to migrate out through
the pores of variable sizes (typically, 3 to 12 µm) using chemo-attractants in the
outer chamber. The inner wells can be coated with ECM to evaluate invasion.
The invaded/migrated cells are imaged and/or collected for quantification at
predetermined time points. The Boyden Chamber can be modified for evaluating
migration and cytotoxicity of effector cells in end-point assays.
This application note describes a novel real-time co-culture assay using RTCA eSight
for interrogating immune cell invasion and cytotoxicity that does not require the
collection of embedded cells for end-point readouts (Figure 1). In this setup, the
ECM layer is in direct contact with target tumor cells and can modulate response of
both tumor targets and infiltrating lymphocytes, especially as the latter executes its
cytotoxicity function. In the transwell-based approaches, cytotoxicity of the migrated
immune cells is carried out in an outer chamber devoid of ECM.
The invasion and killing of target tumor cells by the NKs has
been evaluated as proof of concept for the assay system.
NKs are innate lymphocytes that kill infected, stressed,
or transformed cells by identifying and distinguishing the
"altered" cells from healthy cells using an array of activating
and inhibiting receptors. The NK92 cells were used as a
model for studying invasion and cytotoxicity. The allogenic
NKs derived from NK92 cell line are the first NK-based cellular
immunotherapy to be granted the Investigational New Drug
status by the US Food and Drug Administration.
It is hypothesized that the Matrigel layer presents a
challenge for the NK92 cells and increasing the distance
for invasion would delay the killing of tumor cells. Also, NKs
rely on proteases of the matrix-metalloproteinases (MMP)
family to degrade various components in the ECM during
invasion stage.
This application note demonstrates that the 96-well format of
eSight can be easily used to systematically study the effects
of different ECM constituents on tumor and immune cell
interactions in the TME depending on user requirements.
Materials and methods
Cells
MCF7 human breast adenocarcinoma cell line (ATCC,
part number HTB-22) was transduced with eLenti Red
(Agilent Technologies, part number 8711011) at a
multiplicity of infection of 1 and cultured in the presence
of 2 µg/mL Puromycin (InvivoGen, part number ant-pr-1)
for 14 days to select for MCF7-red cells stably expressing
nuclear-localized red fluorescent protein (RFP). MCF7
and MCF7-red cells were cultured in EMEM media (ATCC,
30-2003) supplemented with 10% heat inactivated FBS
(Sigma, part number 12106C-500ML) and 1% Pen/Strep
(Hyclone, part number SV30010).
NK92 cells (Creative Bioarray, CSC-C0499) were grown
in MyeloCult H5100 media (Stemcell Technologies,
part number 05150) supplemented with 30 mL of horse
serum (Gibco, part number 16050-122), 600 IU/mL of
rhIL-2 (Stemcell Technologies, part number 78036) and 1%
Pen/Strep (Hyclone, part number SV30010).
eGFP-NK92 cells (BPS Bioscience, part number 78399)
were grown in X-VIVO 15 (Lonza Ltd, part number 04-418Q)
supplemented with 5% human serum (Sigma, H4522),
500 IU/mL of rhIL-2 (Stemcell Technologies,
part number 78036) and 0.5 µg/mL Puromycin.
ECM invasion and cytotoxicity assay
The ability of NK92 cells to invade the Matrigel and kill
the MCF7-red target cells was evaluated by concurrent
impedance and imaging readouts on an xCELLigence
RTCA eSight (Agilent Technologies) as outlined in Figure 1.
Background impedance signal was measured with 50 µL
of EMEM media in the wells of E-plate VIEW microplate
(Agilent Technologies, part number 0030060101030).
MCF7-red target cells (30,000 in 100 µL) were added to
the wells and the plate was placed at room temperature
for 30 min to facilitate an even distribution at the bottom.
The plate was returned to its cradle in the eSight to acquire
data. Impedance was read every 15 minutes and images
were taken every 60 minutes. Images from four fields of
view were acquired in each well in brightfield, red, and green
fluorescence channels. Exposure time was set at default
in brightfield, 150 ms in red, and 300 ms in green channels.
Matrigel (Corning, part number 356234, 354234) was thawed
overnight at 4 °C, diluted with DMEM and supplemented with
10% FBS to a final total protein concentration of 6 mg/mL.
After 24 hours the data collection was paused. Media in the
wells were aspirated and varying volumes of Matrigel (50, 75,
and 100 µL, data shown here) was layered over the MCF7-red
cells and incubated for 30 minutes at room temperature,
followed by 30 minutes at 37 °C/5% CO2
for polymerization
of the Matrigel. Impedance and imaging data were collected
for an hour during which the NK92 cells were suspended in
EMEM media and the cell numbers were adjusted to achieve
E:T of 3:1 in 100 µL. NK92 cell suspension (100 µL) was
layered over the Matrigel and the total volume in all wells was
adjusted to 200 µL. The plate was loaded back into the eSight
cradle and data acquisition was resumed. Percent cytolysis
was calculated from normalized cell impedance readings
using the formula [(1 – (treated/untreated) × 100].
MMP inhibition and kinetics of NK invasion
Ilomastat (GM6001, Selleck Chemicals, part number S7157), a
broad spectrum MMP inhibitor, was dissolved in the Matrigel
and media at a final concentration of 2 and 10 µM to assess
the role of MMP-dependent NK92 invasion. Percent cytolysis
was calculated from normalized cell impedance readings
and red object count data using the formula [(1 – (NK92 +
MMPi/MMPi treated) × 100].
Results and discussion
Target cell killing is delayed with increasing invasion
distance for NK cells
Impedance increases with time and stabilizes as the
MCF7-red target cells adhere and proliferate to reach
confluence. The addition of Matrigel (50 µL)
modulates the impedance signature of MCF7 cells and
importantly, delays the cytolysis by NK92 cells added at
24 hours. The drop in impedance due to cytolysis is further
delayed with increasing volumes of Matrigel (representative data for 50, 75 and 100 µL). The KT60 was 67, 76, and 89 hours, respectively
MMP inhibition delays target cell killing by NK cells
As cytolysis was delayed with increasing invasion distance
for the NKs, it is hypothesized that MMPs would play an
important role in lymphocyte invasion. Consistent with the
function of MMPs in invasion, percent cytolysis computed
from normalized impedance readings and live cell
imaging confirmed both delayed
and reduced target cell killing by GFP-NK92 cells in the
presence of Ilomastat (2 and 10 µM). Image analysis concurs
with impedance measurements, confirming the kinetics of
cell killing.
Image analysis corroborates delayed invasion and killing
with increasing invasion distance
Representative images of MCF7 clusters reveal increased
clumping and cell death in response to GFP-NK92.
Although there is increased tumor cell death, only a few
GFP-NK92 were detected in the imaging fields. Interestingly,
highly active NK cells were detected that made multiple
contacts with different MCF7 red targets in clusters
suggesting serial killing activity.
Conclusion
Recapitulating the features of the tumor microenvironment
in solid tumors could play a pivotal part in formulating and
refining the strategies for cellular immunotherapy. The
dysregulation of ECM in tumor microenvironment of solid
tumors has been widely investigated for its ability to modulate
diverse cellular responses. In this regard, there is a need for
efficient in vitro assays that evaluate the responses of tumor
and immune cells in the presence of ECM.
The ability of NKs and other immune cells to invade the
extracellular space to reach the target cells could depend on
the ability to degrade ECM. Various constituents of ECM can
regulate the function of NK cells. In this application note,
the ability of NK92 cells to invade a Matrigel layer and kill the
target cells has been evaluated. The cytotoxicity outcome
measured by loss in impedance and live cell imaging serves
as a surrogate for the migratory/invasion potential of the
NK92 cells. As a proof of concept, it was established that
this assay format allows simultaneous evaluation of invasion
and cytotoxicity in the presence of an ECM by demonstrating
that the killing of target cells can be delayed by varying the
invasion distance through the Matrigel.
NKs can express multiple MMPs and transmigration assays
have shown that NK92 invasion in Matrigel is reduced in
the presence of MMP inhibitor GM6001.
Typically, studies
evaluate invasion/migration potential and cytotoxicity
functions separately in complex workflows as is the case
with the study that evaluated the effect of MMP inhibitor.
Alternatively, some studies have evaluated both migration
and cytotoxicity using complex cumbersome experimental
setups.
Live cell imaging and real-time impedance readouts
have been used to demonstrate the contribution of MMPs in
invasion-cytotoxicity assays with NK92. Consistent with the
role of MMPs in facilitating invasion, the killing of target cells
is delayed by the broad spectrum MMP inhibitor.
Although imaging and impedance data were consistent in the
invasion-cytotoxicity assay, relying on imaging data can be
challenging. Tumor cells respond differently to the Matrigel
and as highlighted in the representative images the MCF7
target cells form irregular and messy clumps as they undergo
cell death. Surprisingly, rather than finding a swarm of
invading NK cells, only a few NK cells in and around the MCF
clusters were detected. Nonetheless, images and videos were
generated of highly active GFP-NK92 cells that made multiple
contacts with different targets in the clusters, leading to cell
death of the contacted targets during the course of the assay.
The novel real-time co-culture assay described in this
application note demonstrates the utility of eSight for
the simultaneous evaluation of invasion and cytotoxicity
functions of lymphocytes that are critical for immunlating and
refining the strategies for cellular immunotherapy. The
dysregulation of ECM in tumor microenvironment of solid
tumors has been widely investigated for its ability to modulate
diverse cellular responses.
ITALIANO
Introduzione
Le cellule immunitarie fuoriescono dai vasi sanguigni per infiltrarsi nei tessuti e svolgere funzioni effettrici che svolgono un ruolo cruciale nella sorveglianza immunitaria del tumore. Queste capacità sono sfruttate anche dalle cellule T citotossiche naturali killer (NK) e dal recettore dell'antigene chimerico (CAR) utilizzate per l'immunoterapia antitumorale. Sebbene l’immunoterapia cellulare abbia dimostrato efficacia nei tumori ematologici, le risposte cliniche nei tumori solidi devono essere migliorate. Il complesso microambiente tumorale (TME) nei tumori solidi regola il reclutamento e la funzione dei linfociti. Una sfida importante affrontata dai linfociti nei tumori solidi è quella di navigare nello spazio acellulare pieno di impalcature strutturali della matrice extracellulare (ECM) durante la migrazione/invasione. Questa ECM è eterogenea ed i suoi componenti possono modulare un'ampia gamma di risposte cellulari sia nelle cellule tumorali residenti che nei linfociti infiltranti.
Tradizionalmente, l'invasione, la migrazione e la citotossicità vengono valutate in diversi test finalizzati utilizzando sistemi di test transwell per prevedere la funzione in vivo. La camera di Boyden è una classica disposizione transwell ampiamente utilizzata per valutare la migrazione e l'invasione. È costituita da un inserto di coltura cellulare cilindrico con una membrana porosa annidata all'interno del pozzetto di una piastra di coltura cellulare standard. Le sospensioni cellulari vengono aggiunte alla camera interna dell'inserto e indotte a migrare attraverso i pori di dimensioni variabili (tipicamente da 3 a 12 µm) utilizzando chemioattrattivi nella camera esterna. I pozzetti interni possono essere rivestiti con ECM per valutare l'invasione. Le cellule invase/migrate vengono sottoposte a imaging e/o raccolte per la quantificazione in momenti predeterminati. La Camera Boyden può essere modificata per valutare la migrazione e la citotossicità delle cellule effettrici nei test end-point.
Questa nota applicativa descrive un nuovo test di co-coltura in tempo reale che utilizza RTCA eSight per interrogare l'invasione e la citotossicità delle cellule immunitarie che non richiede la raccolta di cellule incorporate per le letture dei punti finali (Figura 1). In questa configurazione, lo strato ECM è in contatto diretto con le cellule tumorali bersaglio e può modulare la risposta sia dei bersagli tumorali che dei linfociti infiltranti, soprattutto perché questi ultimi svolgono la sua funzione di citotossicità. Negli approcci basati sui transwell, la citotossicità delle cellule immunitarie migranti viene effettuata in una camera esterna priva di ECM.
L'invasione e l'uccisione delle cellule tumorali bersaglio da parte delle NK è stata valutata come prova di concetto per il sistema di analisi. Le NK sono linfociti innati che uccidono le cellule infette, stressate o trasformate identificando e distinguendo le cellule "alterate" dalle cellule sane utilizzando una serie di recettori attivatori ed inibitori. Le cellule NK92 sono state utilizzate come modello per studiare l'invasione e la citotossicità. Le NK allogeniche derivate dalla linea cellulare NK92 sono la prima immunoterapia cellulare basata su NK ad aver ottenuto lo status di nuovo farmaco sperimentale dalla Food and Drug Administration statunitense.
Si ipotizza che lo strato di Matrigel rappresenti una sfida per le cellule NK92 e che l'aumento della distanza di invasione ritarderebbe l'uccisione delle cellule tumorali. Inoltre, le NK si affidano alle proteasi della famiglia delle metalloproteinasi della matrice (MMP) per degradare vari componenti dell'ECM durante la fase di invasione.
Questa nota applicativa dimostra che il formato a 96 pozzetti di eSight può essere facilmente utilizzato per studiare sistematicamente gli effetti dei diversi costituenti dell'ECM sulle interazioni tra cellule tumorali e immunitarie nella TME a seconda delle esigenze dell'utente.
Materiali e metodi
Cellule La linea cellulare di adenocarcinoma mammario umano MCF7 (ATCC, codice articolo HTB-22) è stata trasdotta con eLenti Red (Agilent Technologies, codice articolo 8711011) con una molteplicità di infezione pari a 1 e coltivata in presenza di 2 µg/ml di Puromicina (InvivoGen, codice articolo ant-pr-1) per 14 giorni per selezionare i globuli rossi MCF7 che esprimono stabilmente la proteina fluorescente rossa localizzata nel nucleo (RFP). I globuli rossi MCF7 e MCF7 sono stati coltivati in terreni EMEM (ATCC, 30-2003) integrati con FBS inattivato al calore al 10% (Sigma, codice articolo 12106C-500ML) e Pen/Strep all'1% (Hyclone, codice articolo SV30010). Le cellule NK92 (Creative Bioarray, CSC-C0499) sono state coltivate in terreno MyeloCult H5100 (Stemcell Technologies, codice articolo 05150) integrato con 30 ml di siero di cavallo (Gibco, codice articolo 16050-122), 600 UI/ml di rhIL-2 ( Stemcell Technologies, codice articolo 78036) e 1% Pen/Strep (Hyclone, codice articolo SV30010).
Le cellule eGFP-NK92 (BPS Bioscience, codice articolo 78399) sono state coltivate in X-VIVO 15 (Lonza Ltd, codice articolo 04-418Q) integrato con siero umano al 5% (Sigma, H4522), 500 UI/mL di rhIL-2 ( Stemcell Technologies, codice articolo 78036) e 0,5 µg/mL di puromicina.
Saggio di invasione e citotossicità dell'ECM
La capacità delle cellule NK92 di invadere il Matrigel e uccidere le cellule bersaglio rosse MCF7 è stata valutata mediante letture simultanee di impedenza e imaging su xCELLigence RTCA eSight (Agilent Technologies) come illustrato nella Figura 1. Il segnale di impedenza di fondo è stato misurato con 50 µl di EMEM terreni nei pozzetti della micropiastra E-plate VIEW (Agilent Technologies, codice prodotto 0030060101030). Cellule bersaglio rosse MCF7 (30.000 in 100 µL) sono state aggiunte ai pozzetti e la piastra è stata posta a temperatura ambiente per 30 minuti per facilitare una distribuzione uniforme sul fondo. La piastra è stata rimessa nella sua base nell'eSight per acquisire i dati. L'impedenza veniva letta ogni 15 minuti e le immagini venivano scattate ogni 60 minuti. In ciascun pozzetto sono state acquisite immagini da quattro campi visivi nei canali di fluorescenza in campo chiaro, rosso e verde. Il tempo di esposizione è stato impostato di default in campo chiaro, 150 ms in rosso e 300 ms in canali verdi. Matrigel (Corning, codice articolo 356234, 354234) è stato scongelato durante la notte a 4 °C, diluito con DMEM e integrato con FBS al 10% fino ad una concentrazione proteica totale finale di 6 mg/mL.
Dopo 24 ore la raccolta dei dati è stata sospesa. I terreni nei pozzetti sono stati aspirati e volumi variabili di Matrigel (50, 75 e 100 µL, dati mostrati qui) sono stati stratificati sui globuli rossi MCF7 e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da 30 minuti a 37 °C/ 5% CO2 per la polimerizzazione del Matrigel. I dati di impedenza ed imaging sono stati raccolti per un'ora durante la quale le cellule NK92 sono state sospese in mezzi EMEM e i numeri di cellule sono stati regolati per raggiungere un E:T di 3:1 in 100 µL. La sospensione cellulare NK92 (100 µl) è stata stratificata sul Matrigel e il volume totale in tutti i pozzetti è stato regolato a 200 µl. La piastra è stata ricaricata nella base eSight e l'acquisizione dei dati è stata ripresa. La percentuale di citolisi è stata calcolata dalle letture dell'impedenza cellulare normalizzate utilizzando la formula [(1 – (trattato/non trattato) × 100].
Inibizione delle MMP e cinetica dell'invasione NK
Ilomastat (GM6001, Selleck Chemicals, codice prodotto S7157), un inibitore delle MMP ad ampio spettro, è stato disciolto nel Matrigel e nel terreno a una concentrazione finale di 2 e 10 µM per valutare il ruolo dell'invasione NK92 dipendente da MMP. La percentuale di citolisi è stata calcolata dalle letture dell'impedenza cellulare normalizzate e dai dati del conteggio degli oggetti rossi utilizzando la formula [(1 – (NK92 + MMPi/MMPi trattati) × 100].
Risultati e discussione
L'uccisione delle cellule bersaglio viene ritardata con l'aumentare della distanza di invasione delle cellule NK. L'impedenza aumenta con il tempo e si stabilizza man mano che le cellule bersaglio rosse MCF7 aderiscono e proliferano per raggiungere la confluenza. L'aggiunta di Matrigel (50 µL) modula la firma di impedenza delle cellule MCF7 e, cosa importante, ritarda la citolisi da parte delle cellule NK92 aggiunte a 24 ore. Il calo dell'impedenza dovuto alla citolisi viene ulteriormente ritardato con l'aumento dei volumi di Matrigel. Il KT60 è stato rispettivamente di 67, 76 e 89 ore
L'inibizione delle MMP ritarda l'uccisione delle cellule bersaglio da parte delle cellule NK Poiché la citolisi veniva ritardata con l'aumento della distanza di invasione delle NK, si ipotizza che le MMP svolgano un ruolo importante nell'invasione dei linfociti. Coerentemente con la funzione delle MMP nell'invasione, la percentuale di citolisi calcolata da letture di impedenza normalizzate e imaging di cellule vive ha confermato l'uccisione ritardata e ridotta delle cellule bersaglio da parte delle cellule GFP-NK92 in presenza di Ilomastat (2 e 10 µM). L'analisi delle immagini concorda con le misurazioni dell'impedenza, confermando la cinetica dell'uccisione cellulare.
L'analisi delle immagini conferma l'invasione ritardata e l'uccisione con l'aumento della distanza di invasione
Immagini rappresentative dei cluster MCF7 rivelano un aumento dell'aggregazione e della morte cellulare in risposta a GFP-NK92. Sebbene vi sia un aumento della morte delle cellule tumorali, solo pochi GFP-NK92 sono stati rilevati nei campi di imaging. È interessante notare che sono state rilevate cellule NK altamente attive che hanno stabilito contatti multipli con diversi bersagli rossi MCF7 in cluster suggerendo un'attività di uccisione seriale.
Conclusione
Ricapitolare le caratteristiche del microambiente tumorale nei tumori solidi potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella formulazione e nel perfezionamento delle strategie per l’immunoterapia cellulare. La disregolazione dell'ECM nel microambiente tumorale dei tumori solidi è stata ampiamente studiata per la sua capacità di modulare diverse risposte cellulari. A questo proposito, sono necessari test in vitro efficienti che valutino le risposte delle cellule tumorali e immunitarie in presenza di ECM. La capacità delle cellule NK e di altre cellule immunitarie di invadere lo spazio extracellulare per raggiungere le cellule bersaglio potrebbe dipendere dalla capacità di degradare l'ECM. Vari costituenti dell'ECM possono regolare la funzione delle cellule NK. In questa nota applicativa è stata valutata la capacità delle cellule NK92 di invadere uno strato di Matrigel e uccidere le cellule bersaglio. L'esito della citotossicità misurato dalla perdita di impedenza e dall'imaging di cellule vive funge da surrogato del potenziale migratorio/di invasione delle cellule NK92. Come prova di concetto, è stato stabilito che questo formato di analisi consente la valutazione simultanea dell'invasione e della citotossicità in presenza di una ECM, dimostrando che l'uccisione delle cellule bersaglio può essere ritardata variando la distanza di invasione attraverso il Matrigel. Le NK possono esprimere più MMP ed i test di trasmigrazione hanno dimostrato che l'invasione di NK92 in Matrigel è ridotta in presenza dell'inibitore delle MMP GM6001.
In genere, gli studi valutano separatamente il potenziale di invasione/migrazione e le funzioni di citotossicità in flussi di lavoro complessi, come nel caso dello studio che ha valutato l’effetto dell’inibitore delle MMP. In alternativa, alcuni studi hanno valutato sia la migrazione che la citotossicità utilizzando configurazioni sperimentali complesse ed ingombranti.
L'imaging di cellule vive e le letture dell'impedenza in tempo reale sono stati utilizzati per dimostrare il contributo delle MMP nei test di citotossicità di invasione con NK92. Coerentemente con il ruolo delle MMP nel facilitare l’invasione, l’uccisione delle cellule bersaglio è ritardata dall’inibitore delle MMP ad ampio spettro. Sebbene i dati di imaging ed impedenza fossero coerenti nel test di citotossicità di invasione, fare affidamento sui dati di imaging può essere difficile. Le cellule tumorali rispondono in modo diverso al Matrigel e, come evidenziato nelle immagini rappresentative, le cellule bersaglio MCF7 formano grumi irregolari e disordinati mentre vanno incontro alla morte cellulare. Sorprendentemente, invece di trovare uno sciame di cellule NK invasive, sono state rilevate solo poche cellule NK all'interno ed attorno ai cluster MCF. Ciononostante, sono state generate immagini e video di cellule GFP-NK92 altamente attive che hanno stabilito contatti multipli con diversi bersagli nei cluster, portando alla morte cellulare dei bersagli contattati nel corso del test. Il nuovo test di co-coltura in tempo reale descritto in questa nota applicativa dimostra l'utilità di eSight per la valutazione simultanea delle funzioni di invasione e citotossicità dei linfociti che sono fondamentali per l'immunizzazione ed il perfezionamento delle strategie per l'immunoterapia cellulare. La disregolazione dell'ECM nel microambiente tumorale dei tumori solidi è stata ampiamente studiata per la sua capacità di modulare diverse risposte cellulari.
Da:
https://www.agilent.com/cs/library/brochures/ebook-labx-cell-gene-therapy-5994-7421en-agilent.pdf
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