Stimulation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells / Stimolazione delle cellule mononucleari del sangue periferico umano

 Stimulation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application./ Stimolazione delle cellule mononucleari del sangue periferico umano. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Schematic of signal cascade for stimulation of IL-2 and INF-γ secretion. / Schema della cascata di segnali per la stimolazione della secrezione di IL-2 e INF-γ.

Using the Agilent BioTek Cytation 7 cell imaging multimode reader to image and analyze ELISpot assays

Abstract 

Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are routinely isolated from blood samples, then used in several fields of research including autoimmune disorders, infectious diseases, vaccine development, and cancers. The ELISpot assay monitors ex vivo cellular immune responses to antigenic stimuli. This application note uses the Agilent BioTek Cytation 7 cell imaging multimode reader in conjunction with Agilent BioTek Gen5 microplate reader and imager software to quantitate changes in cytokine secretion in PBMCs using the colorimetric ELISpot assay format

Introduction 

PBMCs are differentially stimulated to secrete a number of cytokines as a result of a receptor-mediated cascade based on the cell type and the stimuli. The response of this diverse group of cells to different stimuli offers insights into their role in disease and the development of treatment modalities. PBMCs are peripheral blood cells that have a round nucleus. These cells consist of lymphocytes (T-, B-, and NK-cells) as well as monocytes. Other peripheral blood cells either have no nuclei (erythrocytes and platelets) or have multilobed nuclei (neutrophils, basophils, and eosinophils). In humans, lymphocytes make up the majority of the PBMC population, followed by monocytes, and only a small percentage of dendritic cells.

Cytokines are small molecular weight proteins or peptides secreted by many cell types (particularly immune system cells) that regulate the duration and intensity of the immune response. The cytokine interleukin 2 (IL-2) is a pleiotropic cellular regulatory molecule that is produced by lymphoid cells in response to several stimuli. It plays a role in preventing autoimmune diseases by promoting differentiation of immature T cells into regulatory T cells. In addition, IL-2 causes the differentiation of T cells into effector T cells and memory T cells when the original T cell was stimulated by an antigen. Interferon gamma (IFN-γ), is a cytokine critical for innate and adaptive immunity against infections. IFN-γ is produced predominantly by natural killer (NK) and natural killer T (NKT) cells as part of the innate immune response, and by cytotoxic T lymphocyte (CTL) effector T cells once antigen-specific immunity develops. The importance of IFN-γ in the immune system stems in part from its ability to inhibit viral replication directly, and from its immune-stimulatory and immunomodulatory effects. Aberrant IFN-γ expression is associated with a number of auto-inflammatory and autoimmune diseases.  

T cell activation is normally initiated by the interaction of a cell surface receptor to its specific ligand molecule along with a co-stimulatory molecule. This binding event triggers the rapid hydrolysis of inositol phospholipids to diacylglycerol and inositol phosphates by phospholipase C (PLC).

Diacylglycerol is an allosteric activator of protein kinase C (PKC). PKC activation and inositol phosphates, which trigger Ca2+ release and mobilization, result in a cascade of additional cellular responses mediating T cell activation (Figure 1). Two of these cellular responses are the production and secretion of IL-2 and INF-γ. Triptolide is a diterpene triepoxide that is a potent immunosuppressant and anti-inflammatory. Triptolide has been shown to inhibit the expression of IL-2 in activated T cells at the level of purine-box/nuclear factor and NF-κB mediated transcription activation. 

While some PBMCs are known to produce IL-2 and INF-γ, under normal growth conditions little is produced. Only after stimulation will substantial amounts of the cytokines be expressed.8 Phytohemagglutinin (PHA) is a lectin that binds to the sugars on glycosylated surface proteins, including the T cell receptor (TCR), and nonspecifically binds them. The result is the low level stimulation of the signal cascade required for IL-2 or INF-γ secretion. Likewise, phorbol myristate acetate (PMA) is a small organic compound, which has a structure analogous to diacylglycerol, that diffuses through the cell membrane into the cytoplasm where it directly activates protein kinase C (PKC). When used in combination with ionomycin, a calcium ionophore, which triggers calcium release, it results in a moderate level of cytokine release. However, when PMA and a co-stimulator, such as PHA, stimulate PBMC cells concurrently, cytokine production is strongly enhanced.

The ELISpot assay procedure is very similar to that of a conventional ELISA. The plates are first coated with the appropriate capture antibody. Cultured secreting cells are added to the wells along with any interested experimental mitogen or antigen. Cells are maintained for a period of time after which they are removed. The secreted analyte remains bound to the capture antibodies in close proximity to the location on the plate where the cell that produced the analyte was situated. After removal of the cells and any unbound materials, a detection antibody (usually biotinylated) is added followed by an enzyme conjugate with an incubation to allow binding and a wash to remove unbound materials after each step. As the substrate is converted by the conjugate enzyme to colored compounds, spots on the plate membrane bottom at the locations of the original analyte capture are formed. The resultant spots are then analyzed/counted using image analysis.

Materials and methods

 Human IL-2 ELISpot colorimetric kit was obtained from U-CyTech biosciences (Utrecht, The Netherlands) and a two color human IFN-γ/IL-2 ELISpot kit was from Cellular Technology Limited (Cleveland, OH). Phorbol 12-myristate (PMA), and Triptolide (part number T3652) were purchased from MilliporeSigma (Burlington, MA). Ionomycin (part number 407952) was from EMD Millipore (Chicago, IL). Human PBMCs were obtained from Astarte Biologicals (Bothell, WA). White PVDP membrane 96-well (part number MSIP4W10) were from MilliporeSigma.

Cell culture

 Purified human PBMCs were received and maintained frozen until needed. After rapid thawing cells were immediately diluted 1:10 in RPMI-1640 plus 10% FBS supplemented with 2 mM glutamine, penicillin, and streptomycin. Cells were centrifuged at 300 × g for 10 minutes and the supernatant removed. Cells were resuspended in 10 mL of fresh RPMI media, counted, and diluted as needed to provide a density of 5 × 104 cells/well.

Plate coating 

Either a human IL-2 ELISpot kit from U-CyTech Biosciences or a 2-color human INF-γ/IL-2 kit from CTL were used for these experiments. PVDF membrane plates are first coated with the appropriate concentration of capture antibody (anti-IL-2 or anti-FTN-γ) and allowed to absorb overnight at 4 °C. The unbound antibody is aspirated and the plate is manually washed 3x with PBS. The wells are then filled with a blocking solution (200 µL) and allowed to incubate for at least 1 hour at room temperature. Blocking buffer is aspirated without washing immediately before the addition of cells

Cell seeding

 Unless otherwise indicated, cells were plated in 96-well membrane plates previously coated with antibody at a density of 5 × 104 /well. PBMCs were stimulated to secrete IL-2 with a PMA (50 ng/mL), ionomycin (1 µg/mL) mixture. Typical experiments used a volume of 100 µL for cells followed by the addition of 100 µL of stimulant mixture at a 2x concentration.

Triptolide inhibition

 PBMCs were plated at 5 × 104 /well in 50 µL volume of complete RPMI media. After allowing cells to recover for 1 hour at 37 °C, in a humidified 5% CO2 environment, triptolide treatment was added in complete RPMI media at 4x of final concentration to each well in 50 µL. IL-2 stimuli mixture (2x) was then added in 100 µL for a final volume of 200 µL.

One-color ELISpot assay The assays were performed according to the U-Cytech BioSciences kit instructions. After seeding, cells were incubated for 24 hours, at 37 °C in a humidified 5% CO2 environment plates and then assayed using an ELISpot kit. Briefly, cells were removed by washing 5x with 250 µL of PBS-Tween 0.05% using an Agilent BioTek MultiFlo FX multimode dispenser. A biotinylated detection antibody (100 µL) was added to the well and allowed to incubate for 60 minutes at 37 °C or overnight at 5 °C, after which unbound detection antibody was removed by washing. A streptavidin-HRP conjugate was then added (100 µL) and incubated at 37 °C for 60 minutes. Again, unbound conjugate is removed by washing. Next a two-part AEC substrate was added that deposits dye onto the well membrane bottom. Reactions were halted after 30 minutes at RT by washing with deionized water (250 µL) 3x using the MultiFlo FX and allowed to dry in the dark. Entire wells were then imaged

Two-color ELISpot development 

The assays were performed according to the C.T. L. Immunospot 2-color ELISpot kit instructions. After seeding, cells were incubated for 24 hours at 37 °C in a humidified 5% CO2 environment plates were then assayed using an ELISpot kit. Briefly, cells removed by washing 5x with 250 µL PBS-Tween 0.05% using a MultiFlo FX. A detection antibody solution (80 µL/well) was added to the well and allowed to incubate at room temperature (RT) for 120 minutes, after which unbound detection antibody is removed by washing.

Tertiary solution (80 µL/well) was added and allowed to incubate for 60 minutes at RT. Unreacted reagents were removed by washing 2x with PBS-Tween, followed by 2 washes with dH2 O, then allowed to air dry in the dark. Blue developer solution was then added (80 µL/well) and incubated for 15 minutes at RT. The reaction was stopped by washing 3x with dH2 O. Red developer solution was then added (80 µL/well) and incubated at RT for 7 minutes. The plate was then washed 3x with dH2 O. The plate was air-dried in the dark for at least 2 hours prior to imaging.

Plate washing

 Plates were washed according to the assay kit instructions using a MultiFlo FX. Wash buffer consisted of PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 7.4 mM) supplemented with 0.05% Tween 20. Unless specifically indicated, plates were washed five times with 250 µL buffer per well.

Plate imaging 

Prepared microplates were imaged using a Cytation 7 configured with an upright color camera. The imager uses a white LED light source in conjunction with a color digital camera. A series of images were taken with the 2x lens to image the entire well in a single frame. Once the focal plane and camera exposure were determined manually, images were captured automatically using a fixed focal height routine using reflected light in Gen5.

Results and discussion

 Initial experiments demonstrate the specificity of the ELISpot reaction. PBMCs that have been stimulated with a combination of PMA/ionomycin produce numerous spots, while unstimulated cells produce few if any. Treatment alone without PBMCs does not produce any spots.

Correct sizing of the identified objects is necessary for accurate determinations. The intent of the ELIPOT assay is to identify and quantitate the number of cells responding to specific stimuli. The antibody-coated plate captures its specific target rather than the actual secretory cell. While most of the secreted analyte will be captured in the area immediately surrounding the position of the cell, some of the analyte will diffuse into the media and be captured elsewhere. The high concentration of analyte near the cell will result in a spot as large, or larger, than the physical size of the cell, while dispersed analyte will result in very small intense deposits. Figure 5 demonstrates the number of spots present in a typical ELISpot well. Only those spots exceeding 25 µm in size are designated as true spots.

The number of recorded spots produced from stimulated cells is proportional to the number of secreting cells. When a titration of PBMCs are exposed to a fixed concentration of stimulant the number of counted spots is proportional to the cell number. As demonstrated, increasing cell number in a well results in an increase in spots counted. Cell counts above 50,000 per well resulted in the spots coalescing together. Subsequent experiments used 5,000 cells per well.

Stimulation of IL-2 secretion by a mixture of PMA and ionomycin is dose dependent. As observed, increasing concentration of PMA produces more spots. Pretreating PBMCs with triptolide for 1 hour prior to stimulation reduces IL-2 secretion in a dose-dependent manner. Increasing concentrations of triptolide result in fewer spots indicative of an IL-2 secreting cell. In these experiments, a stimulatory dose that was 80% of maximal was employed. The IC50 under these conditions was determined to be 40 nM, which is similar to reports in the literature.

Multiplex ELISpot assays are available to quantitate a number of different analytes simultaneously. While there are several fluorescence-based assays that provide information for up to 4 analytes in a single well, colorimetric ELISpot assays are limited to two analytes per well. Initial experiments using a two-color ELISpot specific to human IL-2 and IFN-γ demonstrated the specificity of the assay to specifically identify IL-2 or IFN-γ secreting cells. In this assay, cells secreting IL-2 can be visualized by the formation of blue spots, while those secreting IFN-γ form red spots. As observed in the control experiment, wells coated with anti-IL-2 antibodies only form blue spots, while wells coated with only anti-IFN-γ antibodies only form red spots. Wells receiving both coating antibodies formed both red and blue spots, while cells lacking PBMCs or PMA stimulation failed to form any spots.

Discrimination between red and blue colored spots can be achieved using the differences in red and blue densities of the spots. The histogram plots in Figure demonstrate differences in the calculated red/blue density ratio between red-only and blue-only control wells. The mean of the red/blue ratio plus two times its standard deviation can be used as the upper limit for red-only spots. Likewise, the mean minus two standard deviations of the blue spot controls defines the lower limit of the red/blue ratio for blue spots. Spots with ratio values between these two thresholds are considered to be both blue and red. 

These threshold values can be used to quantitate single-color reactions where only IL-2 or IFN-γ reactions are developed. As shown, both IL-2 and IFN-γ cytokines are secreted when PBMCs are stimulated with PMA. The stimulation occurs in a concentration-dependent fashion with the EC50 values being very similar (EC50 = 0.05 ng/mL). Interestingly, twice as many PBMCs, as measured by the spot count, are likely to secrete IFN-γ as compared to IL-2.  

Multiplex, two-color analysis in the same well can be performed when both colors are developed using the same criteria. A frequency histogram of the data from several separate wells where both colors were developed in the wells is depicted. When the images are examined by eye, most wells have spots that are visibly either red or blue, with a smaller percentage that appear appear as a mixture. These observations are corroborated by the frequency histogram depicted that demonstrates that the identified spots have a spectrum of red/blue ratio values. There are two obvious peaks based on the red/blue ratio that correspond to the red and blue spots observed when only one color has been developed. Between their respective cutoff values is a significant number of spots that have an intermediate red/blue ratio.

These visibly correspond to spots that appear purple (i.e. a mixture of red and blue). The relative number of spots identified as red or blue is similar to the numbers identified when a single color was developed. When one analyzes the data with a scatter plot that compared the red/blue ratio to spot size, two loose clusters of spots that correspond to red or blue spots are observed along with a number of intermediate ratio spots. While all three subpopulations of spots have the same range in size, red spots tend to be more numerous and smaller in size than spots identified as blue.

This multiplex analysis can be used on individual wells with different experimental conditions. Figure demonstrates the response of PBMCs to PMA stimulation where both blue (IL-2) and red (IFN-γ) colors are developed in the same well. As with separate color development, PMA stimulated cytokine secretion on PBMCs in a concentration-dependent manner. Also, more PBMCs secreted IFN-γ than IL-2, with equivalent EC50 values. If one compares the total number of cells that secrete IFN-γ (red-only spots plus red and blue spots) or the total number of cells that secrete IL-2 (blue-only spots plus red and blue spots), the numbers are consistent with wells where only one color was developed.

Conclusion

These data demonstrate the utility of the Agilent BioTek Cytation 7 cell imaging multimode reader in conjunction with the Agilent BioTek Gen5 microplate reader and imager software to image and analyze colorimetric PVDF ELISpot assay plates. The combination of a PMA/ionomycin has been shown to markedly stimulate IL-2 secretion in PBMCs. Without stimulation, IL-2 is virtually absent. The ability of triptolide, a known transcription inhibitor, to prevent IL-2 secretion suggests that new protein synthesis is required after stimulation.

ELISpot is a sensitive assay to monitor the ex vivo cellular immune response at the single cell level by detecting secreted proteins released by cells. This technique has been derived from the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to accommodate the use of whole cells to identify the frequency of the secreting cells. As such, there are a number of critical parameters that need to be optimized in order for experiments to be successful. Depending on the degree of cellular secretion, developed spots can be quite large. The expected number of positive cells is of greater importance than the total number of cells used initially. The presence of too many secreting cells results in the individual spots coalescing making a numerical determination difficult. For example, an investigation of a relatively rare secreting event would require a greater number of cells to be seeded as compared to a more common event. Timing of the response relative to the stimulation and/or the inhibition is important. Receptor mediated events often will take longer to elicit a response than a stimulatory molecule that can interact within the cell directly. It is important that appropriate interval between stimulation and measurement be used. The testing of inhibitors still requires a stimulating agent to be present. In these experiments, it is important that a less than maximal concentration of the stimulatory agent be used, lest it mask any inhibitory affects.

The Cytation 7 is an ideal platform to interpret colorimetric PVDF membrane ELISpot assays. The imager supports digital top-down color imaging with 2x, 4x, and 8x microscope objectives that are factory installed. The 2x objective can capture the entire well in a single image, making it ideal for 96-well ELISpot determination. If desired, higher resolution can be obtained by using a higher magnification objective and a montage of the well. Using this camera both reflected or transmitted light can be used for optimal imaging. While this research only used the upright top-down camera with PVDF membrane plates, the imager also supports brightfield imaging using an inverted camera for silver stain ELISpot assays. In addition, the inverted microscope supports fluorescence-based microscopy with LED and filter cubes. Gen5 microplate reader and imager software, besides controlling reader function, can be used to automatically perform stitch of separate montage image tiles, perform background subtraction and mask off regions outside the well prior to analysis.

ITALIANO

Utilizzo del lettore multimodale di imaging cellulare Agilent BioTek Cytation 7 per visualizzare e analizzare i test ELISpot

Riassunto

Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) vengono regolarmente isolate da campioni di sangue, quindi utilizzate in diversi campi di ricerca, tra cui le malattie autoimmuni, le malattie infettive, lo sviluppo di vaccini ed i tumori. Il test ELISpot monitora le risposte immunitarie cellulari ex vivo agli stimoli antigenici. Questa nota applicativa utilizza il lettore multimodale per imaging cellulare Agilent BioTek Cytation 7 insieme al lettore di micropiastre Agilent BioTek Gen5 ed al software imager per quantificare i cambiamenti nella secrezione di citochine nei PBMC utilizzando il formato del test colorimetrico ELISpot

Introduzione

Le PBMC vengono stimolate in modo differenziale a secernere un numero di citochine come risultato di una cascata mediata dai recettori in base al tipo di cellula ed agli stimoli. La risposta di questo gruppo eterogeneo di cellule a stimoli diversi offre informazioni sul loro ruolo nella malattia e sullo sviluppo di modalità di trattamento. Le PBMC sono cellule del sangue periferico che hanno un nucleo rotondo. Queste cellule sono costituite da linfociti (cellule T, B e NK) e da monociti. Altre cellule del sangue periferico non hanno nuclei (eritrociti e piastrine) o hanno nuclei multilobati (neutrofili, basofili ed eosinofili). Negli esseri umani, i linfociti costituiscono la maggioranza della popolazione PBMC, seguiti dai monociti e solo da una piccola percentuale di cellule dendritiche.

Le citochine sono proteine ​​o peptidi di piccolo peso molecolare secreti da molti tipi di cellule (in particolare dalle cellule del sistema immunitario) che regolano la durata e l'intensità della risposta immunitaria. La citochina interleuchina 2 (IL-2) è una molecola regolatrice cellulare pleiotropica prodotta dalle cellule linfoidi in risposta a diversi stimoli. Svolge un ruolo nella prevenzione delle malattie autoimmuni promuovendo la differenziazione delle cellule T immature in cellule T regolatorie. Inoltre, IL-2 provoca la differenziazione delle cellule T in cellule T effettrici e cellule T di memoria quando la cellula T originale è stata stimolata da un antigene. L'interferone gamma (IFN-γ) è una citochina fondamentale per l'immunità innata e adattativa contro le infezioni. L'IFN-γ è prodotto prevalentemente dalle cellule natural killer (NK) e dalle cellule T natural killer (NKT) come parte della risposta immunitaria innata, e dalle cellule T effettrici dei linfociti T citotossici (CTL) una volta che si sviluppa l'immunità antigene-specifica. L’importanza dell’IFN-γ nel sistema immunitario deriva in parte dalla sua capacità di inibire direttamente la replicazione virale e dai suoi effetti immunostimolatori e immunomodulatori. L'espressione aberrante di IFN-γ è associata a una serie di malattie autoinfiammatorie e autoimmuni.

L'attivazione delle cellule T viene normalmente avviata dall'interazione di un recettore sulla superficie cellulare con la sua specifica molecola di ligando insieme a una molecola costimolatoria. Questo evento di legame innesca la rapida idrolisi dei fosfolipidi dell'inositolo in diacilglicerolo e inositolo fosfati da parte della fosfolipasi C (PLC).

Il diacilglicerolo è un attivatore allosterico della proteina chinasi C (PKC). L'attivazione della PKC e gli inositolo fosfati, che innescano il rilascio e la mobilitazione di Ca2+, determinano una cascata di risposte cellulari aggiuntive che mediano l'attivazione delle cellule T (Figura 1). Due di queste risposte cellulari sono la produzione e la secrezione di IL-2 e INF-γ. Il triptolide è un triepossido diterpenico che è un potente immunosoppressore e antinfiammatorio. È stato dimostrato che triptolide inibisce l'espressione di IL-2 nelle cellule T attivate a livello di purine-box/fattore nucleare e di attivazione della trascrizione mediata da NF-κB.

Sebbene sia noto che alcuni PBMC producono IL-2 e INF-γ, in condizioni di crescita normali ne viene prodotto poco. Solo dopo la stimolazione verranno espresse quantità sostanziali di citochine. La fitoemoagglutinina (PHA) è una lectina che si lega agli zuccheri sulle proteine ​​di superficie glicosilate, compreso il recettore delle cellule T (TCR), e li lega in modo aspecifico. Il risultato è la stimolazione di basso livello della cascata di segnali richiesta per la secrezione di IL-2 o INF-γ. Allo stesso modo, il forbolo miristato acetato (PMA) è un piccolo composto organico, che ha una struttura analoga al diacilglicerolo, che si diffonde attraverso la membrana cellulare nel citoplasma dove attiva direttamente la proteina chinasi C (PKC). Se utilizzato in combinazione con la ionomicina, uno ionoforo del calcio, che attiva il rilascio di calcio, determina un livello moderato di rilascio di citochine. Tuttavia, quando la PMA e un costimolatore, come il PHA, stimolano contemporaneamente le cellule PBMC, la produzione di citochine viene fortemente aumentata.

La procedura del test ELISpot è molto simile a quella di un ELISA convenzionale. Le piastre vengono prima rivestite con l'anticorpo di cattura appropriato. Le cellule secrete in coltura vengono aggiunte ai pozzetti insieme a qualsiasi mitogeno o antigene sperimentale interessato. Le cellule vengono mantenute per un periodo di tempo dopo il quale vengono rimosse. L'analita secreto rimane legato agli anticorpi di cattura in prossimità del punto della piastra in cui si trovava la cellula che ha prodotto l'analita. Dopo la rimozione delle cellule e di eventuali materiali non legati, viene aggiunto un anticorpo di rilevamento (solitamente biotinilato) seguito da un coniugato enzimatico con un'incubazione per consentire il legame e un lavaggio per rimuovere i materiali non legati dopo ogni passaggio. Quando il substrato viene convertito dall'enzima coniugato in composti colorati, si formano macchie sul fondo della membrana della piastra nei punti di cattura originale dell'analita. I punti risultanti vengono quindi analizzati/contati utilizzando l'analisi delle immagini.

Materiali e metodi

 Il kit colorimetrico ELISpot IL-2 umano è stato ottenuto da U-CyTech biosciences (Utrecht, Paesi Bassi) e un kit ELISpot IFN-γ/IL-2 umano a due colori proveniva da Cellular Technology Limited (Cleveland, OH). Phorbol 12-miristato (PMA) e Triptolide (codice articolo T3652) sono stati acquistati da MilliporeSigma (Burlington, MA). La ionomicina (codice articolo 407952) proveniva da EMD Millipore (Chicago, IL). I PBMC umani sono stati ottenuti da Astarte Biologicals (Bothell, WA). La membrana PVDP bianca a 96 pozzetti (codice articolo MSIP4W10) proveniva da MilliporeSigma.

Coltura cellulare

 Le PBMC umane purificate sono state ricevute e mantenute congelate fino al momento del bisogno. Dopo un rapido scongelamento, le cellule sono state immediatamente diluite 1:10 in RPMI-1640 più 10% FBS integrato con glutammina 2 mM, penicillina e streptomicina. Le cellule sono state centrifugate a 300 x g per 10 minuti e il surnatante è stato rimosso. Le cellule sono state risospese in 10 mL di terreno RPMI fresco, contate e diluite secondo necessità per fornire una densità di 5 × 104 cellule/pozzetto.

Rivestimento della piastra

 Per questi esperimenti è stato utilizzato un kit ELISpot IL-2 umano di U-CyTech Biosciences o un kit INF-γ/IL-2 umano a due colori di CTL. Le piastre di membrana in PVDF vengono prima rivestite con la concentrazione appropriata di anticorpo di cattura (anti-IL-2 o anti-FTN-γ) e lasciate assorbire durante la notte a 4 °C. L'anticorpo non legato viene aspirato e la piastra viene lavata manualmente 3 volte con PBS. I pozzetti vengono quindi riempiti con una soluzione bloccante (200 µL) e lasciati incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Il tampone di bloccaggio viene aspirato senza lavare immediatamente prima dell'aggiunta delle cellule

Semina cellulare

 Se non diversamente indicato, le cellule sono state piastrate in piastre di membrana da 96 pozzetti precedentemente rivestite con anticorpo ad una densità di 5 × 104/pozzetto. Le PBMC sono state stimolate a secernere IL-2 con una miscela di PMA (50 ng/mL) e ionomicina (1 µg/mL). Gli esperimenti tipici hanno utilizzato un volume di 100 µl per le cellule seguito dall'aggiunta di 100 µl di miscela stimolante ad una concentrazione 2x.

Inibizione del triptolide

 I PBMC sono stati piastrati a 5 × 104 /pozzetto in un volume di 50 µl di supporto RPMI completo. Dopo aver consentito il recupero delle cellule per 1 ora a 37 °C, in un ambiente umidificato al 5% di CO2, il trattamento con triptolide è stato aggiunto in un mezzo RPMI completo a 4 volte la concentrazione finale in ciascun pozzetto in 50 µL. La miscela di stimoli IL-2 (2x) è stata quindi aggiunta in 100 µL per un volume finale di 200 µL.

Saggio ELISpot monocolore

 I test sono stati eseguiti secondo le istruzioni del kit U-Cytech BioSciences. Dopo la semina, le cellule sono state incubate per 24 ore, a 37 °C in piastre ambientali umidificate al 5% di CO2 e quindi analizzate utilizzando un kit ELISpot. In breve, le cellule sono state rimosse lavando 5 volte con 250 µl di PBS-Tween allo 0,05% utilizzando un dispenser multimodale Agilent BioTek MultiFlo FX. Un anticorpo di rilevamento biotinilato (100 µl) è stato aggiunto al pozzetto e lasciato incubare per 60 minuti a 37°C o per tutta la notte a 5°C, dopodiché l'anticorpo di rilevamento non legato è stato rimosso mediante lavaggio. È stato quindi aggiunto un coniugato streptavidina-HRP (100 µL) e incubato a 37°C per 60 minuti. Anche in questo caso, il coniugato non legato viene rimosso mediante lavaggio. Successivamente è stato aggiunto un substrato AEC in due parti che deposita il colorante sul fondo della membrana del pozzetto. Le reazioni sono state interrotte dopo 30 minuti a temperatura ambiente lavando con acqua deionizzata (250 µl) 3 volte utilizzando MultiFlo FX e lasciate asciugare al buio. Sono stati quindi ripresi interi pozzi

Sviluppo ELISpot bicolore

 I saggi sono stati eseguiti secondo il metodo C.T. L. Istruzioni kit ELISpot Immunospot bicolore. Dopo la semina, le cellule sono state incubate per 24 ore a 37 °C in un ambiente umidificato al 5% di CO2, le piastre sono state quindi analizzate utilizzando un kit ELISpot. In breve, le cellule sono state rimosse lavando 5 volte con 250 µl di PBS-Tween allo 0,05% utilizzando un MultiFlo FX. Una soluzione di anticorpo di rilevamento (80 µl/pozzetto) è stata aggiunta al pozzetto e lasciata incubare a temperatura ambiente (RT) per 120 minuti, dopodiché l'anticorpo di rilevamento non legato viene rimosso mediante lavaggio.

È stata aggiunta una soluzione terziaria (80 µl/pozzetto) e lasciata incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. I reagenti non reagiti sono stati rimossi lavando 2 volte con PBS-Tween, seguiti da 2 lavaggi con dH2O, quindi lasciati asciugare all'aria al buio. È stata quindi aggiunta la soluzione di sviluppo blu (80 µl/pozzetto) e incubata per 15 minuti a temperatura ambiente. La reazione è stata interrotta lavando 3 volte con dH2O. È stata quindi aggiunta la soluzione di sviluppo rossa (80 µl/pozzetto) e incubata a temperatura ambiente per 7 minuti. La piastra è stata quindi lavata 3 volte con dH2O. La piastra è stata asciugata all'aria al buio per almeno 2 ore prima dell'imaging.

Lavaggio piastre

 Le piastre sono state lavate secondo le istruzioni del kit del test utilizzando un MultiFlo FX. Il tampone di lavaggio era costituito da PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 7,4 mM) integrato con Tween 20 allo 0,05%. Se non diversamente indicato, le piastre sono state lavate cinque volte con 250 µl di tampone per pozzetto.

Imaging della piastra

Le micropiastre preparate sono state esposte utilizzando un Cytation 7 configurato con una fotocamera a colori verticale. Il riproduttore d'immagini utilizza una sorgente luminosa a LED bianca insieme a una fotocamera digitale a colori. È stata scattata una serie di immagini con l'obiettivo 2x per riprendere l'intero pozzo in un unico fotogramma. Una volta determinati manualmente il piano focale e l'esposizione della fotocamera, le immagini sono state catturate automaticamente utilizzando una routine di altezza focale fissa utilizzando la luce riflessa in Gen5.

Risultati e discussione

 Gli esperimenti iniziali dimostrano la specificità della reazione ELISpot. Le PBMC che sono state stimolate con una combinazione di PMA/ionomicina producono numerose macchie, mentre le cellule non stimolate ne producono poche o nessuna. Il solo trattamento senza PBMC non produce macchie.

Taglia corretta degli oggetti identificati è necessaria per determinazioni accurate. Lo scopo del test ELIPOT è identificare e quantificare il numero di cellule che rispondono a stimoli specifici. La piastra rivestita di anticorpo cattura il suo bersaglio specifico piuttosto che la cellula secretoria vera e propria. Mentre la maggior parte dell'analita secreto verrà catturato nell'area immediatamente circostante la posizione della cellula, una parte dell'analita si diffonderà nel mezzo e verrà catturata altrove. L'elevata concentrazione di analita vicino alla cellula risulterà in una macchia grande, o più grande, della dimensione fisica della cellula, mentre l'analita disperso si tradurrà in depositi molto piccoli e intensi. La Figura mostra il numero di spot presenti in un tipico pozzetto ELISpot. Solo i punti che superano le dimensioni di 25 µm sono designati come punti veri.

Il numero di macchie registrate prodotte dalle cellule stimolate è proporzionale al numero di cellule secernenti. Quando una titolazione di PBMC viene esposta a una concentrazione fissa di stimolante, il numero di spot contati è proporzionale al numero di cellule. Come dimostrato, l'aumento del numero di cellule in un pozzetto determina un aumento degli spot contati. Il numero di cellule superiore a 50.000 per pozzetto ha provocato la fusione delle macchie. Gli esperimenti successivi hanno utilizzato 5.000 cellule per pozzetto.

La stimolazione della secrezione di IL-2 mediante una miscela di PMA e ionomicina è dose-dipendente. Come osservato, l'aumento della concentrazione di PMA produce più macchie. Il pretrattamento delle PBMC con triptolide per 1 ora prima della stimolazione riduce la secrezione di IL-2 in modo dose-dipendente. Concentrazioni crescenti di triptolide determinano un minor numero di punti indicativi di una cellula che secerne IL-2. In questi esperimenti è stata impiegata una dose di stimolazione pari all'80% della dose massima. L'IC50 in queste condizioni è stato determinato pari a 40 nM, un valore simile a quanto riportato in letteratura.

Sono disponibili test ELISpot multiplex per quantificare simultaneamente un numero di analiti diversi. Sebbene esistano diversi test basati sulla fluorescenza che forniscono informazioni per un massimo di 4 analiti in un singolo pozzetto, i test colorimetrici ELISpot sono limitati a due analiti per pozzetto. Gli esperimenti iniziali utilizzando un ELISpot bicolore specifico per IL-2 e IFN-γ umani hanno dimostrato la specificità del test per identificare specificamente le cellule secernenti IL-2 o IFN-γ. In questo test, le cellule che secernono IL-2 possono essere visualizzate mediante la formazione di macchie blu, mentre quelle che secernono IFN-γ formano macchie rosse. Come osservato nell'esperimento di controllo, i pozzetti rivestiti con anticorpi anti-IL-2 formano solo macchie blu, mentre i pozzetti rivestiti solo con anticorpi anti-IFN-γ formano solo macchie rosse. I pozzetti che ricevevano entrambi gli anticorpi di rivestimento formavano macchie rosse e blu, mentre le cellule prive di stimolazione PBMC o PMA non riuscivano a formare macchie.

La discriminazione tra macchie rosse e blu può essere ottenuta utilizzando le differenze nella densità delle macchie rosse e blu. I grafici dell'istogramma nella Figura mostrano le differenze nel rapporto di densità rosso/blu calcolato tra i pozzetti di controllo solo rosso e solo blu. La media del rapporto rosso/blu più due volte la sua deviazione standard può essere utilizzata come limite superiore per i punti solo rossi. Allo stesso modo, la media meno due deviazioni standard dei controlli dei punti blu definisce il limite inferiore del rapporto rosso/blu per i punti blu. I punti con valori di rapporto compresi tra queste due soglie sono considerati sia blu che rossi.

Questi valori soglia possono essere utilizzati per quantificare le reazioni monocolore in cui si sviluppano solo reazioni IL-2 o IFN-γ. Come mostrato nella Figura, sia le citochine IL-2 che quelle IFN-γ vengono secrete quando le PBMC vengono stimolate con PMA. La stimolazione avviene in modo dipendente dalla concentrazione e i valori EC50 sono molto simili (EC50 = 0,05 ng/mL). È interessante notare che è probabile che il doppio delle PBMC, misurate dal conteggio degli spot, secernano IFN-γ rispetto a IL-2.

È possibile eseguire analisi multiplex a due colori nello stesso pozzetto quando entrambi i colori vengono sviluppati utilizzando gli stessi criteri. Nella Figura è illustrato un istogramma di frequenza dei dati provenienti da diversi pozzetti separati in cui entrambi i colori sono stati sviluppati nei pozzetti. Quando le immagini vengono esaminate a occhio, la maggior parte dei pozzetti presenta macchie visibilmente rosse o blu, con una percentuale minore che appare appaiono come una miscela. Queste osservazioni sono corroborate dall'istogramma di frequenza rappresentato nella Figura che dimostra che i punti identificati hanno uno spettro di valori di rapporto rosso/blu. Ci sono due picchi evidenti basati sul rapporto rosso/blu che corrispondono alle macchie rosse e blu osservate quando è stato sviluppato un solo colore. Tra i rispettivi valori limite c'è un numero significativo di punti che hanno un rapporto rosso/blu intermedio.

Questi corrispondono visibilmente a macchie che appaiono viola (cioè una miscela di rosso e blu). Il numero relativo di punti identificati come rossi o blu è simile ai numeri identificati quando è stato sviluppato un singolo colore. Quando si analizzano i dati con un grafico a dispersione che confronta il rapporto rosso/blu con la dimensione del punto, si osservano due gruppi sciolti di punti che corrispondono a punti rossi o blu insieme a un numero di punti con rapporto intermedio. Sebbene tutte e tre le sottopopolazioni di macchie abbiano la stessa gamma di dimensioni, le macchie rosse tendono ad essere più numerose e di dimensioni più piccole rispetto alle macchie identificate come blu.

Questa analisi multiplex può essere utilizzata su singoli pozzi con diverse condizioni sperimentali. La Figura mostra la risposta delle PBMC alla stimolazione PMA in cui nello stesso pozzetto si sviluppano sia i colori blu (IL-2) che quelli rossi (IFN-γ). Come con lo sviluppo del colore separato, la PMA ha stimolato la secrezione di citochine sulle PBMC in modo dipendente dalla concentrazione. Inoltre, più PBMC secernono IFN-γ rispetto a IL-2, con valori EC50 equivalenti. Se si confronta il numero totale di cellule che secernono IFN-γ (macchie solo rosse più macchie rosse e blu) o il numero totale di cellule che secernono IL-2 (macchie solo blu più macchie rosse e blu), i numeri sono coerente con i pozzetti in cui è stato sviluppato un solo colore.

Conclusione

Questi dati dimostrano l'utilità del lettore multimodale per imaging cellulare Agilent BioTek Cytation 7 in combinazione con il lettore di micropiastre Agilent BioTek Gen5 e il software imager per visualizzare e analizzare piastre per test colorimetrici PVDF ELISpot. È stato dimostrato che la combinazione di PMA/ionomicina stimola notevolmente la secrezione di IL-2 nelle PBMC. Senza stimolazione, IL-2 è praticamente assente. La capacità del triptolide, un noto inibitore della trascrizione, di prevenire la secrezione di IL-2 suggerisce che dopo la stimolazione è necessaria una nuova sintesi proteica.

ELISpot è un test sensibile per monitorare la risposta immunitaria cellulare ex vivo a livello di singola cellula rilevando le proteine ​​secrete rilasciate dalle cellule. Questa tecnica è stata derivata dal test ELISA (sandwich) per consentire l'uso di cellule intere per identificare la frequenza delle cellule secernenti. Pertanto, affinché gli esperimenti abbiano successo, è necessario ottimizzare una serie di parametri critici. A seconda del grado di secrezione cellulare, le macchie sviluppate possono essere piuttosto grandi. Il numero previsto di cellule positive è di maggiore importanza rispetto al numero totale di cellule utilizzate inizialmente. La presenza di troppe cellule secernenti fa sì che i singoli punti si coalestino rendendo difficile la determinazione numerica. Ad esempio, l'indagine su un evento di secrezione relativamente raro richiederebbe la semina di un numero maggiore di cellule rispetto a un evento più comune. La tempistica della risposta relativa alla stimolazione e/o all'inibizione è importante. Gli eventi mediati dai recettori spesso impiegano più tempo per suscitare una risposta rispetto a una molecola stimolatrice che può interagire direttamente all'interno della cellula. È importante utilizzare un intervallo appropriato tra la stimolazione e la misurazione. La sperimentazione degli inibitori richiede ancora la presenza di un agente stimolante. In questi esperimenti, è importante che venga utilizzata una concentrazione inferiore alla massima dell'agente stimolatore, per evitare di mascherare eventuali effetti inibitori.

Cytation 7 è una piattaforma ideale per interpretare i test ELISpot colorimetrici su membrana PVDF. Il riproduttore d'immagini supporta l'imaging digitale a colori dall'alto verso il basso con obiettivi per microscopio 2x, 4x e 8x installati in fabbrica. L'obiettivo 2x può catturare l'intero pozzetto in un'unica immagine, rendendolo ideale per la determinazione ELISpot a 96 pozzetti. Se lo si desidera, è possibile ottenere una risoluzione più elevata utilizzando un obiettivo con ingrandimento maggiore e un montaggio del pozzetto. Utilizzando questa fotocamera è possibile utilizzare sia la luce riflessa che quella trasmessa per ottenere immagini ottimali. Sebbene questa ricerca abbia utilizzato solo la fotocamera verticale top-down con piastre di membrana in PVDF, l'imager supporta anche l'imaging in campo chiaro utilizzando una fotocamera invertita per i test ELISpot con colorazione dell'argento. Inoltre, il microscopio invertito supporta la microscopia basata sulla fluorescenza con LED e cubi filtro. Il software del lettore di micropiastre e dell'imager Gen5, oltre a controllare la funzione del lettore, può essere utilizzato per eseguire automaticamente l'unione di riquadri di immagini di montaggio separati, eseguire la sottrazione dello sfondo e mascherare le regioni esterne al pozzetto prima dell'analisi.

Da:

 https://www.agilent.com/cs/library/brochures/ebook-labx-cell-gene-therapy-5994-7421en-agilent.pdf