L'interruzione della trasmissione meccanica da parte della proteina titina precipita le malattie muscolari / Disrupting Mechanical Transmission by Titin Protein Precipitates Muscle Diseases

L'interruzione della trasmissione meccanica da parte della proteina titina precipita le malattie muscolari / Disrupting Mechanical Transmission by Titin Protein Precipitates Muscle Diseases

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

TEVs-TTN è uno strumento che consente il clivaggio controllato della titina nei topi. Le immagini di microscopia confocale ed elettronica mostrano che il clivaggio della titina nel muscolo innesca lo smontaggio dei sarcomeri, e la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e succinato deidrogenasi (mitocondri) rivela atrofia delle miofibrille, internalizzazione nucleare ed aggregazione mitocondriale /  TEVs-TTN is a tool that permits the controlled cleavage of titin in mice. The confocal and electron microscopy images show that titin cleavage in muscle triggers disassembly of sarcomeres, and the staining with hematoxylin and eosin (H&E) and succinate dehydrogenase (Mitochondria) reveal myofibril atrophy, nuclear internalization, and mitochondrial aggregation

Un gruppo del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) ha sviluppato un metodo innovativo, noto come TEV-TTN, per studiare le specifiche funzioni meccaniche delle proteine ​​attraverso la loro scissione controllata. Questo processo rende le proteine ​​incapaci di percepire e trasmettere la forza meccanica. Lo studio, guidato dal Dott. Jorge Alegre-Cebollada, dimostra che l'interruzione della trasmissione meccanica da parte della proteina titina scatena patologie muscolari. Questa scoperta apre nuove strade alla comprensione delle distrofie muscolari e di altre patologie associate a questa proteina.

Alegre-Cebollada e colleghi hanno riportato i loro risultati su Nature Biomedical Engineering , in un articolo intitolato " Mechanically knocking out titin reveals protein tension loss as a trigger of muscle disease" (L'eliminazione meccanica della titina rivela la perdita di tensione proteica come fattore scatenante della malattia muscolare). Nel loro articolo, gli autori affermavano: "Qui dimostriamo che l'interruzione della trasmissione della forza attraverso la titina provoca grave atrofia muscolare e disfunzione correlata alla graduale deplezione del sarcomero... I nostri risultati suggeriscono che le molecole di titina inattive siano alla base della malattia muscolare, potenzialmente attraverso meccanismi condivisi con altre proteine ​​meccaniche".

La titina, che prende il nome dai titani della mitologia greca, è la proteina più grande presente negli animali e svolge un ruolo fondamentale come perno strutturale dei sarcomeri, le unità contrattili delle cellule muscolari. "La titina, l'impalcatura proteica elastica dei sarcomeri muscolari, svolge ruoli multifunzionali nella meccanosegnalazione ed è implicata nelle patologie muscolari", hanno osservato gli autori. Le mutazioni nel gene della titina (TTN) sono una delle principali cause di malattie muscolari congenite e cardiomiopatie, ha aggiunto il primo autore Roberto Silva-Rojas, PhD. "Molte di queste mutazioni generano una forma prematuramente troncata della proteina, impedendone il corretto ancoraggio nei sarcomeri e compromettendo la funzione muscolare". Il gruppo ha inoltre osservato: "In linea con le funzioni fondamentali della proteina, le varianti troncanti nel gene della titina (TTN) sono responsabili di molte malattie gravi, tra cui la cardiomiopatia dilatativa e le miopatie congenite".

Il termine "titinopatie" è ora utilizzato per riferirsi a numerose forme di malattie muscolari causate da mutazioni della titina. "Insieme ai diversi tipi di cardiopatie scatenate da varianti della titina, l'esistenza delle titinopatie rende la TTN un importante gene responsabile di una malattia umana", hanno affermato gli scienziati. Tuttavia, hanno commentato, "... i meccanismi molecolari alla base di queste patologie rimangono in gran parte sconosciuti".

Per analizzare il ruolo funzionale della meccanica della titina, il gruppo ha effettuato il clivaggio sito-specifico della proteina mediante l'espressione eterologa della proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEVp) in topi viventi. "Questa strategia, che chiamiamo KO meccanico della titina (mKO), comporta la perdita di trasduzione della forza attraverso lo scheletro polipeptidico della titina, preservando al contempo i livelli totali della proteina e quindi le sue funzioni non meccaniche", hanno spiegato.

Utilizzando questo sistema, il gruppo del CNIC è stato in grado di replicare la disorganizzazione del sarcomero tipica dei pazienti con mutazioni della titina. Come ha spiegato Silva-Rojas, i muscoli con titina scissa mostravano difetti simili a quelli osservati nei pazienti, tra cui riduzione del volume cellulare, internalizzazione nucleare, aggregazione mitocondriale e fibrosi interstiziale. "I nostri risultati rivelano che i muscoli con titina mKO sviluppano una grave forma di miopatia che ricapitola una serie di fenotipi strutturali, istologici e funzionali presenti nei pazienti umani portatori di varianti patogene di TTN", hanno osservato i ricercatori.

In assenza di modelli sperimentali animali con mutazioni del clivaggio della titina, il nostro approccio consente un'analisi strutturata e mirata dell'impatto di questo tipo di alterazioni. Questo rende TEV-TTN uno strumento ideale per testare terapie progettate per mitigare gli effetti della compromissione dell'integrità del sarcomero.

Una scoperta interessante dello studio è stata che il clivaggio della titina ha causato la completa disintegrazione dei sarcomeri nel giro di pochi giorni, lasciando le cellule muscolari prive della loro unità funzionale di base entro sette giorni dall'infezione (dpi). "Nel complesso, l'immunofluorescenza e la caratterizzazione ultrastrutturale confermano che il clivaggio della titina da parte della proteasi TEV determina lo scarico meccanico della proteina che precede lo smontaggio del sarcomero", hanno riferito i ricercatori. "Di conseguenza, molte miofibre nei muscoli titina mKO sono completamente prive di sarcomeri a partire da 7 dpi". Ciononostante, queste cellule sono sopravvissute, suggerendo che processi simili potrebbero verificarsi in altre situazioni, come strappi muscolari, insufficienza cardiaca o cardiotossicità associata alla chemioterapia.

La metodologia sviluppata al CNIC segna una pietra miliare nello studio di come la meccanica proteica contribuisca alla fisiologia di tessuti e organi. "Il nostro lavoro dimostra l'uso di TEVp per ottenere mKO proteici in vivo, ovvero la cessazione della trasduzione di forza attraverso la proteina bersaglio senza alterarne i livelli proteici", hanno sottolineato.

Proprio come la titina è fondamentale per la trasmissione della forza nei sarcomeri, altre proteine, come la distrofina, i complessi di distroglicano, le integrine e le lamine, svolgono ruoli cruciali nella regolazione della matrice extracellulare e nell'integrità della membrana cellulare. "Tenendo conto delle interessanti osservazioni che utilizzano l'optogenetica per eliminare meccanicamente le proteine ​​in vitro, la strategia basata sulle proteasi che descriviamo qui potrebbe essere sfruttata per analizzare le complesse funzioni di altre proteine ​​meccaniche, inclusi i patomeccanismi di proteine ​​mutanti rilevanti per le patologie umane come distrofina, nebulina, integrine, lamine e caderine."

Il nuovo strumento consentirà al gruppo di ricerca di confermare o confutare le ipotesi sul funzionamento di queste proteine. Questi progressi, a loro volta, potrebbero aprire la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per molte patologie, oltre a quelle che colpiscono i muscoli.

ENGLISH

A team at the Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) has developed an innovative method known as TEVs-TTN, for studying the specific mechanical functions of proteins through their controlled cleavage. This process renders the proteins unable to sense and transmit mechanical force. The study, headed by Jorge Alegre-Cebollada, PhD, demonstrates that interrupting mechanical transmission by the protein titin precipitates muscular diseases. This finding opens new routes to understanding muscular dystrophies and other diseases associated with this protein.

Alegre-Cebollada and colleagues reported on their findings in Nature Biomedical Engineering, in a paper titled “Mechanically knocking out titin reveals protein tension loss as a trigger of muscle disease.” In their paper the authors stated, “Here we demonstrate that cessation of force transmission across titin results in severe muscle atrophy and dysfunction correlating with gradual sarcomere depletion…Our findings suggest that slack titin molecules drive muscle disease, potentially through mechanisms shared with other mechanical proteins.”

Titin, named after the titans of Greek mythology, is the largest protein in animals and plays a critical role as the structural linchpin of sarcomeres, the contractile units of muscle cells. “Titin, the elastic protein scaffold of muscle sarcomeres, has multifunctional roles in mechanosignaling and is implicated in muscle disease,” the authors noted. Mutations in the titin gene (TTN) are a leading cause of congenital muscular diseases and cardiomyopathies, added first author Roberto Silva-Rojas, PhD. “Many of these mutations generate a prematurely truncated form of the protein, impeding its correct anchoring in the sarcomeres and disrupting muscle function.” The team further noted, “Consistent with the fundamental functions of the protein, truncating variants in the titin gene (TTN) are responsible for many severe diseases, including dilated cardiomyopathy and congenital myopathies.”

The term titinopathies is now used to refer to many forms of muscle disease when they are caused by titin mutations. “Together with the different types of heart disease triggered by titin variants, the existence of titinopathies makes TTN an important human disease gene,” the scientists stated. However, they commented, “… the underlying molecular mechanisms of these pathologies remain largely unknown.”

To dissect the functional role of titin mechanics, the team carried out site-directed cleavage of the protein by heterologous expression of tobacco etch virus protease (TEVp) in living mice. “This strategy, which we name titin mechanical KO (mKO), results in loss of force transduction across titin’s polypeptide backbone while preserving the total levels of the protein and therefore its non-mechanical functions,” they explained.

Using this system the CNIC team was able to replicate the sarcomere disorganization typical of patients with titin mutations. As Silva-Rojas explained, muscles with cleaved titin showed similar defects to those observed in patients, including cell-volume reduction, nuclear internalization, mitochondrial aggregation, and interstitial fibrosis.  “Our results reveal that titin mKO muscles develop a severe form of myopathy recapitulating a number of structural, histological and functional phenotypes in human patients who carry pathogenic TTN variants,” the investigators noted.

“In the absence of experimental animal models with titin-cleavage mutations, our approach allows a structured and targeted analysis of the impact of these types of alterations. This makes TEVs-TTN an ideal tool for testing therapies designed to mitigate the effects of impaired sarcomere integrity.”

One intriguing finding of the study was that titin cleavage caused complete disintegration of sarcomeres over the course of a few days, leaving muscle cells devoid of their basic functional unit within seven days post infection (dpi). “Altogether, immunofluorescence and ultrastructural characterization confirm that titin cleavage by TEV protease results in mechanical unloading of the protein preceding sarcomere disassembly,” the investigators reported. “As a result, many myofibers in titin mKO muscles are fully devoid of sarcomeres from 7 dpi.” Nevertheless, these cells survived, suggesting that similar processes might operate in other situations, such as muscle tears, heart failure, or cardiotoxicity associated with chemotherapy.

The methodology developed at the CNIC marks a milestone in the study of how protein mechanics contribute to tissue and organ physiology. “Our work demonstrates the use of TEVp to achieve protein mKOs in vivo, that is, ceased force transduction across the targeted protein with no alteration of protein levels,” they pointed out.

Just as titin is critical for force transmission in sarcomeres, other proteins, such as dystrophin, dystroglycan complexes, integrins, and lamins, play critical roles in extracellular matrix regulation and cell membrane integrity. “Taking into account enticing observations using optogenetics to mechanically knock out proteins in vitro, the protease-based strategy that we describe here could be exploited to dissect the complex functions of other mechanical proteins, including pathomechanisms of mutant proteins relevant for human disease such as dystrophin, nebulin, integrins, lamins and cadherins.”

The new tool will enable the research team to confirm or refute hypotheses about the functioning of these proteins. These advances, in turn, could pave the way to the development of new therapeutic strategies for many diseases beyond those affecting muscle.

Da:

https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/technology-demonstrates-how-disrupting-mechanical-transmission-by-muscle-protein-precipitates-muscular-diseases/