Superare le complessità della produzione AAV: progressi in termini di efficienza, scalabilità e conformità / Conquering the Complexities of AAV Manufacturing: Advances in Efficiency, Scalability, Compliance

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Le CDMO/CRO stanno facendo progressi nell'eliminazione dei tradizionali colli di bottiglia nella produzione delle terapie geniche basate su AAV.

I virus adeno-associati (AAV) si sono affermati come veicoli di somministrazione fondamentali per la terapia genica grazie alla loro sicurezza complessiva (meno immunogenicità), efficienza (ampio tropismo) ed espressione genica a lungo termine. Questi piccoli virus non patogeni trasportano un genoma di DNA a singolo filamento (~ 4,7 kb) racchiuso in un capside proteico. Diverse terapie geniche mediate da AAV hanno già ricevuto l'approvazione normativa o sono in fase avanzata di sperimentazione clinica, e molte altre sono all'orizzonte (una ricerca su clinicaltrials.gov ha rivelato almeno 114 studi che impiegano terapie mediate da AAV per una serie di malattie).

Tuttavia, gli AAV sono incompetenti a replicarsi, privi dei geni appropriati per geniche mediate da AAV per una serie di malattie). riprodursi. Questa carenza rende la produzione di AAV terapeutici un processo complesso, multifase e costoso, che richiede la preparazione non solo del plasmide AAV, ma anche di plasmidi helper o virus che esprimono le proteine ​​critiche necessarie per l'assemblaggio e la replicazione degli AAV.

GEN ha parlato con diverse organizzazioni di sviluppo e produzione a contratto (CDMO) e/o organizzazioni di ricerca a contratto (CRO) sui nuovi modi in cui stanno affrontando le sfide della produzione di AAV.

Nuove sfide del capside

"Una delle maggiori sfide nella produzione di AAV oggi riguarda i nuovi capsidi", osserva Ify Iwuchukwu, PhD, responsabile dello sviluppo di processo e analitico presso OXB. "Molte aziende, inclusa la nostra, hanno sviluppato processi di piattaforma che funzionano molto bene con una varietà di sierotipi di AAV, ma potrebbero non rivelarsi 'plug-and-play' quando si tratta di nuovi capsidi. È necessaria una certa messa a punto per ottenere risultati di processo ottimali sia in termini di titolo che di qualità del prodotto".

L'azienda ha sviluppato un ampio set di strumenti per gestire questi nuovi capsidi, che consente di adattare i processi dei clienti senza la necessità di un lungo sviluppo. Per la produzione, l'azienda utilizza colture in sospensione di cellule HEK293. Iwuchukwu spiega: "Queste cellule vengono trasfettate con sistemi di trasfezione a triplo o doppio plasmide, producendo il vettore desiderato. Le cellule HEK293 vengono quindi lisate ed il materiale raccolto viene chiarificato per la purificazione. La purificazione include una cromatografia in due fasi per isolare innanzitutto il vettore prodotto dal resto dei materiali di coltura cellulare, tra cui proteine ​​della cellula ospite, DNA residuo, ecc. Segue un processo completo di arricchimento del capside. Infine, il vettore arricchito viene trasferito in tampone nella soluzione di formulazione finale".

Il sistema di doppia trasfezione proprietario dell'azienda contiene una disposizione ottimizzata di sequenze critiche per la produzione di AAV, con un conseguente aumento significativo della produttività. Secondo Iwuchukwu, "Raggiungiamo costantemente titoli elevati ed utilizziamo un processo di cromatografia a scambio anionico e cattura di affinità robusto e scalabile che rimuove efficacemente le impurità della cellula ospite/processo. Possiamo anche ottenere un'elevata percentuale di capside completo (>90%)".

Iwuchukwu osserva che l'aumento di scala della trasfezione è piuttosto unico nel campo della produzione di vettori virali. "All'inizio del nostro sviluppo, abbiamo investito nell'acquisizione di una comprensione della cinetica fondamentale della generazione della miscela di trasfezione, tra cui la formazione di dimensioni complesse, la miscelazione, il tempo di equilibratura e le attrezzature necessarie per aumentare la scala dell'operazione di trasfezione. Questa comprensione ci ha portato a portare su scala il nostro processo upstream a 2000 L".

Aumentare l'efficienza produttiva

Un'altra grande sfida del settore sono gli elevati costi di produzione, secondo Xin Swanson, PhD, responsabile della strategia di PackGene Biotech. "La produzione tradizionale di AAV è costosa, il che rende difficile la diffusione delle terapie", osserva.

Secondo Swanson, l'azienda sta affrontando queste sfide creando approcci di produzione più innovativi e convenienti, inclusi plasmidi per la replicazione degli AAV e la formazione del capside (plasmidi RC). "A differenza dei tradizionali processi batch, la piattaforma di produzione proprietaria di AAV Π-Alpha 293 di PackGene include una produzione basata su sospensioni, progetti esclusivi di plasmidi RC e helper modificati e fasi di lavorazione a valle efficienti basate su colonne per consentire una produzione di AAV ad alta resa ed economica con opzioni di scalabilità flessibili", afferma Swanson. "Di conseguenza, abbiamo aumentato con successo le rese di produzione di AAV fino a dieci volte. Inoltre, integrando attivamente analisi avanzate durante lo sviluppo ed ottimizzando i parametri di processo critici, la piattaforma migliora la sicurezza del prodotto riducendo notevolmente le impurità specifiche legate al processo, come i capsidi vuoti e il DNA incapsulato".

Swanson aggiunge che fornire alle aziende servizi di supporto end-to-end in ogni fase contribuisce anche a ridurre i costi. "Ottimizzare i flussi di lavoro di produzione sfruttando la tecnologia della piattaforma consente sia di ridurre i costi di produzione che di scalare la produzione in modo flessibile", afferma. "Inoltre, combinando la nostra piattaforma di produzione di plasmidi π-Omega ad alto rendimento e la produzione di AAV sotto lo stesso tetto, possiamo ridurre efficacemente i costi complessivi di produzione di AAV, riducendo il costo di queste materie prime chiave, semplificando al contempo le catene di approvvigionamento e riducendo le tempistiche complessive del programma. Inoltre, ci concentriamo rigorosamente sulla qualità e sulla conformità alle cGMP per garantire che la produzione soddisfi i requisiti normativi, riducendo i rischi dello sviluppo clinico ed evitando costosi contrattempi per i nostri clienti".

Per le aziende che stanno valutando la produzione interna di AAV rispetto all'outsourcing ad un CDMO, Swanson offre alcuni consigli. "Costruire una struttura interna richiede investimenti significativi in ​​infrastrutture, attrezzature e personale con una profonda competenza tecnica. Sono inoltre necessari solidi sistemi di qualità e innovazioni nelle tecnologie di produzione. Tali investimenti spesso competono con le risorse necessarie per accelerare la ricerca, lo sviluppo di organizzazioni ed il progresso clinico. L'outsourcing ad un CDMO specializzato per le attività di produzione può accelerare notevolmente i tempi e ridurre i costi complessivi".

Anticipi pronti all'uso

La produzione ed il rilascio del DNA plasmidico AAV, sottoposto a controllo di qualità (QC), possono richiedere diversi mesi di lavoro scrupoloso prima e dopo la produzione. Charles River Laboratories (CRL) ha deciso di pre-produrre e sottoporre a controllo di qualità una varietà di plasmidi AAV, nonché vettori lentivirali, in modo che siano pronti per l'uso da parte dei clienti. "Ora forniamo i plasmidi AAV necessari come offerta standard, poiché abbiamo deciso di produrli in grandi quantità come prodotti pronti all'uso", afferma Matthew Hewitt, PhD, Vicepresidente aziendale e CTO della divisione Manufacturing dell'azienda.

Hewitt paragona il processo all'ordinazione su Amazon per la rapida disponibilità di articoli di qualità critica. "Utilizzare plasmidi già pronti consente di risparmiare molto tempo e denaro, che possono essere dedicati al lavoro di scoperta e sviluppo".

In qualità di CDMO, CRL vanta un "portafoglio verticalmente integrato" ed offre servizi di produzione AAV per aziende di piccole e grandi dimensioni. Hewitt osserva: "Controlliamo tutti gli aspetti del processo, dalle materie prime ai prodotti finiti. Inoltre, identifichiamo costantemente nuove tecnologie promettenti da integrare nel nostro portafoglio".

Un altro aspetto importante da considerare per la produzione di AAV è l'affidabilità della conformità normativa dei prodotti finiti. Hewitt afferma: "Questo è un settore in cui nessuno vuole essere il primo, ma tutti vogliono essere secondi! Tuttavia, vantiamo già una notevole esperienza normativa che consente ad un cliente di entrare nelle nostre strutture come, ad esempio, un cliente clinico e poi procedere fino alla commercializzazione del prodotto senza la preoccupazione di averlo già fatto in precedenza. Disponiamo già dell'infrastruttura necessaria per gestire l'esame normativo commerciale".

Hewitt prevede numerose innovazioni future per la produzione di AAV e per il settore in generale. Prevede: "Se si guarda alla scienza odierna, l'innovazione ha subito una notevole accelerazione. Le tecnologie possono evolversi molto più rapidamente rispetto al passato. Quindi, in sostanza, le tecnologie stanno raggiungendo le nostre idee. Ritengo che nel complesso ci stiamo muovendo per essere in grado di produrre vettori virali in modo molto più efficiente in futuro. L'obiettivo è quello di rendere disponibili le terapie ad un maggior numero di pazienti ad un costo inferiore".

Industrializzazione della produzione

Lonza punta ad industrializzare la produzione di AAV per soddisfare le diverse esigenze dei clienti. L'azienda ha creato due piattaforme AAV Xcite® che impiegano tecnologie di trasfezione transitoria o di produzione di linee cellulari stabili (PCL).

Bingnan Gu, PhD, direttore di R&S, cellule e geni dell'azienda, spiega: "La piattaforma di trasfezione transitoria, che sfrutta la linea cellulare clonale HEK293 in sospensione proprietaria di Lonza ed i plasmidi Helper e RepCap progettati razionalmente, produce AAV con un titolo di genoma virale fino a 1E+12 vg/mL (genoma virale per millilitro) con il 50% di capside completo al momento della raccolta, su diversi sierotipi in bioreattori monouso da 3L a 250L. La piattaforma consente una rapida produzione di AAV ricombinante con un'ottimizzazione minima del processo di piattaforma consolidato".

Per superare alcuni dei problemi delle trasfezioni transitorie, Lonza ha anche sviluppato una tecnologia PCL stabile di nuova generazione, priva di virus helper. Gu riassume: "Questa tecnologia offre soluzioni innovative alle sfide della produzione di AAV transitori, consentendo una produzione di AAV semplice, robusta e su larga scala per indicazioni comuni, tra cui malattie neurologiche e metaboliche. La tecnologia elimina la trasfezione plasmidica integrando stabilmente cassette di DNA di Helper, RepCap e gene terapeutico nel genoma delle cellule HEK293. La piattaforma PCL Lonza fornisce costantemente un titolo di oltre 1012 vg/mL ed il 30% di capside completo nel raccolto grezzo in 30 passaggi cellulari. L'elevata produttività e scalabilità hanno il potenziale per ridurre il costo dei beni di oltre l'80% rispetto al processo di trasfezione transitoria".

I sistemi di produzione di AAV di Lonza si sono inoltre concentrati sulla garanzia della qualità e della sicurezza dei prodotti AAV, sviluppando una serie di test che misurano accuratamente il titolo, il confezionamento e l'integrità del genoma. Gu spiega: "Ad esempio, i test PCR standard per il titolo non distinguono tra genomi completi e parziali, il che rappresenta un problema poiché il genoma parziale non può esprimere un prodotto terapeutico funzionale e compromette l'efficacia e la sicurezza degli AAV. Per risolvere la sfida analitica, Lonza ha recentemente sviluppato un'analisi di linkage matematica tridimensionale avanzata con PCR digitale per fornire un'analisi completa del titolo, dell'identità e dell'integrità del genoma degli AAV". 

Gu sottolinea inoltre che il nuovo metodo analitico dell'azienda consente la rapida rilevazione del titolo e della qualità dell'AAV nella fase iniziale dello sviluppo del processo, consentendo una produzione ed una consegna accelerate di farmaci AAV con elevata resa e qualità ai pazienti.

Processo di tripla trasfezione

L'approccio di ProBio alla produzione di AAV si concentra inizialmente sul suo sistema di sospensione a tripla trasfezione, che consente di ottenere elevate rese di vettori virali con riproducibilità e scalabilità. Secondo l'azienda, questo metodo è particolarmente vantaggioso per la produzione di vettori AAV omogenei e di alta qualità, fondamentali per le applicazioni di terapia genica.

"Questo sistema utilizza la linea cellulare PowerS-293™ insieme a plasmidi Rep/Cap e helper appositamente sviluppati (AAssistV™) ed al gene di interesse fornito dal cliente", afferma Whitney Winters, PhD, SVP, US Business Development. Prosegue: "Pertanto, il plasmide 1 contiene il gene di interesse affiancato da ripetizioni terminali invertite di AAV. Il plasmide 2 trasporta i geni rep e cap di AAV, responsabili rispettivamente della replicazione e della formazione del capside. Il plasmide 3 fornisce le necessarie funzioni helper dell'adenovirus, come l'RNA E2A, E4 e VA, che sono fondamentali per la replicazione ed il confezionamento di AAV, ma non contengono il DNA completo dell'adenovirus per garantirne la sicurezza. Questi tre plasmidi vengono co-trasfettati nelle cellule PowerS-293, fornendo i componenti essenziali per l'assemblaggio del vettore AAV con la coltura cellulare".

Wilson afferma che l'azienda punta inoltre sull'approvvigionamento negli Stati Uniti per garantire che le materie prime essenziali, compresi i plasmidi prodotti internamente, rimangano convenienti e facilmente reperibili.

Come per altri fornitori, anche la scalabilità è un aspetto fondamentale. Wilson spiega: "Utilizziamo bioreattori monouso da 10 a 200 litri (scalabili fino a 50-400 litri). Questo riduce al minimo il rischio di contaminazione ed accelera i tempi di risposta, mentre i flussi di lavoro avanzati di purificazione a valle producono costantemente vettori virali di alta qualità".

Poiché le esigenze dei clienti possono includere anche le fasi di sviluppo, l'azienda produce AAV per l'uso nelle fasi precliniche e IND fino alle fasi GMP. Wilson ha inoltre sottolineato che "Integrando tecnologie proprietarie, sviluppo di processi avanzati e sistemi di bioreattori monouso, possiamo offrire un percorso efficiente e scalabile dalla progettazione del DNA plasmidico al riempimento ed alla finitura del prodotto farmaceutico finale, tutto sotto lo stesso tetto".

ENGLISH

CDMOs/CROs are making progress in removing traditional production bottlenecks to AAV-based gene therapies

Adeno-associated viruses (AAV) have emerged as pivotal delivery vehicles for gene therapy due to their overall safety (less immunogenic), efficiency (broad tropism), and long-term gene expression. These small non-pathogenic viruses carry a single-stranded DNA genome (~ 4.7 kb) encased in a protein capsid. Several AAV-mediated gene therapies have already received regulatory approval or are in late stages of clinical trials, and many more are on the horizon (a search of clinicaltrials.gov disclosed at least 114 studies employing AAV-mediated gene therapies for a host of diseases).

However, AAVs are replication-incompetent, lacking the appropriate genes to reproduce. This deficiency makes the manufacturing of therapeutic AAVs a complex, multi-step, and costly process that involves the preparation not only of the AAV plasmid but also helper plasmids or viruses that express the critical proteins necessary for AAV assembly and replication.

GEN talked with several contract development and manufacturing organizations (CDMOs) and/or contract research organizations (CROs) about new ways they are addressing AAV manufacturing challenges.

Novel capsid challenges

“One of the biggest challenges in AAV manufacturing today revolves around novel capsids,” remarks Ify Iwuchukwu, PhD, head of process and analytical development at OXB. “Many companies, including our own, have developed platform processes that perform very well across a variety of AAV serotypes, but may not prove to be ‘plug-and-play’ when it comes to novel capsids. A bit of tuning is required to achieve the optimum process outputs for both titer and product quality.”

The company has built an extensive toolbox to deal with such novel capsids, which allows them to adapt client processes without the need for extensive development. For manufacturing, the company utilizes suspension cultures of HEK293 cells. Iwuchukwu elaborates, “These cells are transfected with either triple or dual plasmid transfection systems, producing the vector of choice. The HEK293 cells are then lysed, and the harvest material is clarified for purification. Purification includes a two-step chromatography to first isolate the vector produced from the rest of the cell culture materials, including host cell proteins, residual DNA, etc. This is followed by a full capsid enrichment process. Finally, the enriched vector product is buffer exchanged into the final formulation solution.”

The company’s proprietary dual transfection system contains an optimized arrangement of sequences that are critical for AAV production, leading to a significant increase in productivity. According to Iwuchukwu, “We consistently achieve high titers and employ a robust and scalable affinity capture and anion exchange chromatography process that efficiently removes host cell/process impurities. We also can achieve a high percentage of full capsid (>90%).”

Iwuchukwu notes that transfection scale-up is rather unique to the field of viral vector manufacturing. “Earlier during our development, we invested in gaining an understanding of the fundamental kinetics of transfection mixture generation, including complex size formation, mixing, equilibration time, and equipment required to scale up the transfection operation. This understanding has led us to successfully scale up our upstream process to 2000L.”

Increasing production efficiency

Another major challenge of the industry is high production costs, according to Xin Swanson, PhD, chief strategy officer at PackGene Biotech. “Traditional AAV manufacturing is expensive, making it difficult for therapies to be widely available,” she remarks.

According to Swanson, the company is addressing these challenges by creating more innovative and cost-saving approaches for manufacturing, including plasmids for AAV replication and capsid formation (RC plasmids). “Unlike traditional batch processes, PackGene’s proprietary Π-Alpha 293 AAV production platform includes suspension-based production, unique designs of modified RC and helper plasmids, and efficient column-based downstream processing steps to enable high-yield, cost-effective AAV production with flexible scaling options,” Swanson says. “As a result, we have successfully increased AAV production yields by up to tenfold. Further, through actively incorporating advanced analytics during development and optimizing critical process parameters, the platform improves product safety by greatly reducing unique process-related impurities, such as empty capsids and encapsulated DNA.”

Swanson adds that providing companies with end-to-end supporting services at every step also helps reduce costs. “Optimizing manufacturing workflows by leveraging platform technology allows both reduced production costs and flexible production scaling,” he indicates. “Further, by combining our high-yield π-Omega plasmid production platform and AAV production under one roof, we can effectively lower the overall AAV production costs by decreasing the cost of these key raw materials while simplifying supply chains and reducing overall program timelines. Additionally, we are razor-focused on quality and cGMP compliance to ensure production meets regulatory requirements, de-risking clinical development and avoiding costly setbacks for our clients.”

For companies considering in-house AAV manufacturing versus outsourcing to a CDMO, Swanson offers some advice. “Building an in-house facility requires significant investment in infrastructure, equipment, and personnel with deep technical expertise. You also need robust quality systems and manufacturing technology innovations. Such investments often compete with resources required to accelerate discovery research, pipeline development, and clinical progress. Outsourcing to a specialized CDMO for production activities can greatly accelerate timelines and reduce overall costs.”

Off-the-shelf advances

Production and full quality-controlled (QC) release of AAV plasmid DNA can require several months of painstaking work prior to and after manufacture. Charles River Laboratories (CRL) decided to premanufacture and QC a variety of AAV, as well as lentiviral vector, plasmids so that they are ready to use by clients. “We now provide the needed AAV plasmids as standard offerings since we decided to make them in bulk as off-the-shelf products,” reports Matthew Hewitt, PhD, Corporate VP and CTO Manufacturing at the company.

Hewitt likens the process to ordering from Amazon for quick availability of critical quality items. “Utilizing off-the-shelf plasmids saves a lot of time and money that can be devoted to discovery and development work.”

As a CDMO, CRL has a “vertically integrated portfolio” and offers AAV manufacturing services for small to very large companies. Hewitt notes, “We control all aspects of the process from raw materials to finished products. We also continually identify promising new technologies to bring into our portfolio.”

Another important consideration for AAV manufacturing is the reliable regulatory compliance of finished products. Hewitt philosophizes, “This is an industry where no one wants to be first, but everyone wants to be second! However, we already have a considerable breadth of regulatory experience that allows a client to come into our facilities as, for example, a clinical customer and then progress all the way through product commercialization without the worry of whether we have done this before. We already have the infrastructure set up to deal with commercial regulatory scrutiny.”

Hewitt sees many future innovations for AAV manufacturing and the field in general. He projects, “If you look at science today, the case of innovation has sped up considerably. Technologies can evolve much quicker than in the past. So basically, technologies are catching up to our ideas. I feel that we are moving overall to be able to make viral vectors much more efficiently in the future. The intent is to bring therapies to more patients at a lower cost.”

Industrializing manufacturing

Lonza is aiming to industrialize AAV manufacturing for a variety of client demands. The company has created two Xcite® AAV platforms that employ either transient transfection or stable producer cell-line (PCL) technologies.

Bingnan Gu, PhD, director of R&D, cell & gene at the company elaborates. “The transient transfection platform, leveraging Lonza’s proprietary, suspension clonal HEK293 cell line and rationally designed Helper and RepCap plasmids, produces AAV with up to 1E+12 vg/mL (viral genome per milliliter) titer with 50% full capsid at harvest across multiple serotypes in 3L to 250L single-use bioreactors. The platform allows rapid manufacturing of recombinant AAV with minimal optimization of the established platform process.”

To help overcome some of the issues of transient transfections, Lonza has also developed a next-generation, helper virus-free stable PCL technology. Gu summarizes, “This offers innovative solutions to the challenges of transient AAV manufacturing, enabling simple, robust, large-scale AAV production for common indications, including neurological and metabolic diseases. The technology removes plasmid transfection by stably integrating DNA cassettes of Helper, RepCap, and therapeutic gene into the genome of HEK293 cells. The Lonza PCL platform consistently delivers over 1012vg/mL titer and 30% full capsid in crude harvest across 30 cell passages. The high productivity and scalability have the potential to reduce the cost of goods by over 80% compared to the transient transfection process.”

Lonza’s AAV manufacturing systems also have homed in on ensuring AAV product quality and safety by developing a suite of assays that accurately measure genome titer, packaging, and integrity. Gu details, “For example, standard PCR titer assays do not distinguish between full-length and partial genomes, which is a problem since the partial genome cannot express a functional therapeutic product and impedes AAV efficacy and safety. To solve the analytical challenge, Lonza recently developed an advanced three-dimensional mathematical linkage analysis with digital PCR to provide a comprehensive analysis on the AAV genome titer, identity, and integrity.”

Gu also points out that the company’s novel analytical method provides the quick detection of AAV titer and quality in the early stage of process development, enabling accelerated manufacturing and delivery of AAV drug products with high yield and quality to patients.

Triple transfection process

ProBio’s approach to AAV manufacturing initially centers around their triple transfection suspension system that provides the ability to achieve high viral vector yields with reproducibility and scalability. According to the company, this method is particularly beneficial for producing consistent and high-quality AAV vectors, which are critical for gene therapy applications.

“This system utilizes the PowerS-293™ cell line alongside purpose-built Rep/Cap and helper plasmids (AAssistV™) and client-provided gene of interest,” indicates Whitney Winters, PhD, SVP, U.S. Business Development. She continues, “Thus, plasmid 1 contains the gene of interest flanked by AAV inverted terminal repeats. Plasmid 2 carries the AAV rep and cap genes that are responsible for replication and capsid formation, respectively. Plasmid 3 provides needed adenovirus helper functions, such as E2A, E4 and VA RNA, which are critical for AAV replication and packaging yet lack the full adenovirus DNA in order to ensure safety. These three plasmids are co-transfected into the PowerS-293 cells, providing the critical components for AAV vector assembly with the cell culture.”

Wilson says that the company also emphasizes US-based sourcing to ensure that critical raw materials, including plasmids manufactured in-house, remain both cost-effective and readily available.

As with other vendors, scalability is also a key concern. Wilson explains, “We use single-use bioreactors ranging from 10 L to 200 L (scalable to 50-400 L). This minimizes contamination risk and accelerates turnaround, while advanced downstream purification workflows consistently produce high-quality viral vectors.”

Because clients’ needs can also include developmental stages, the company manufactures AAVs for use in the preclinical as well as IND through GMP phases Wilson also emphasized that “By integrating proprietary technologies, advanced process development, and single-use bioreactor systems, we can offer an efficient and scalable path from plasmid DNA design to final drug product fill-finish, all under one roof.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/bioprocessing/conquering-the-complexities-of-aav-manufacturing-advances-in-efficiency-scalability-compliance/?_hsenc=p2ANqtz--_VKpQBxR8LaQK6h2p0aQpoeaXyewKcu-4SfKLkt7AZA0bEIHa6IRjA-1kM5pJmE8WK0Inj2h_QnNbngVPWDxLEjGav_nAnppm6--XIlxluUbRxdc&_hsmi=395678544