Prendere di mira il genoma non metilato: un nuovo approccio alla profilazione epigenetica / Targeting the Unmethylated Genome: A New Approach to Epigenetic Profiling

Prendere di mira il genoma non metilato: un nuovo approccio alla profilazione epigenetica / Targeting the Unmethylated Genome: A New Approach to Epigenetic Profiling

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

È stata sviluppata una nuova piattaforma enzimatica per l'analisi epigenomica, che richiede solo una frazione della profondità di sequenziamento solitamente richiesta dagli approcci tradizionali.

I ricercatori di Tagomics, dell'Università di Birmingham e del Van Andel Institute hanno sviluppato "Active-Seq", una nuova piattaforma enzimatica per l'analisi epigenomica che richiede solo una frazione della profondità di sequenziamento degli approcci tradizionali. Pubblicato su Cell Reports Methods, lo studio dimostra la profilazione epigenomica dell'intero genoma con input di DNA nell'ordine dei (sub)nanogrammi. Lo studio multi-istituzionale, guidato da Tagomics, dimostra come l'attenzione al DNA non metilato potrebbe rivoluzionare l'analisi epigenetica, in particolare per i campioni di biopsia liquida.

Una storia in due parti: DNA metilato e non metilato

Non sorprende che le attuali tecnologie di metilazione del DNA si concentrino sulla rilevazione della metilazione del DNA. Questa modifica è tipicamente associata al silenziamento genico. Le regioni non metilate del genoma raccontano la storia opposta, ma altrettanto importante, del nostro DNA attivo ed accessibile. Ad esempio, gli enhancer non metilati definiscono l'identità del tipo cellulare e l'ipometilazione del DNA è una caratteristica dello sviluppo precoce del cancro.

Abbiamo sviluppato Active-Seq per analizzare in modo mirato queste caratteristiche genomiche poco studiate e per evitare i costi e la ridondanza del sequenziamento associati agli attuali approcci di conversione delle basi a livello del genoma per lo studio della metilazione del DNA.

Abbiamo adattato Active-Seq per l'applicazione nei test di biopsia liquida, concentrando gli sforzi su un flusso di lavoro semplice da implementare, non dannoso per il DNA e robusto e riproducibile con quantità di DNA in ingresso su scala nanometrica, tipiche dei campioni di biopsia liquida.

Un approccio enzimatico semplificato

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro a provetta singola che combina la marcatura enzimatica del DNA, l'arricchimento del DNA non metilato e la preparazione della libreria. Il metodo utilizza un enzima metiltransferasi batterica riutilizzato ed un analogo sintetico del cofattore per consentire la cattura e l'arricchimento di frammenti di DNA non metilato.

Lo studio ha dimostrato che il flusso di lavoro è altamente efficiente e compatibile con input di DNA fino a 1 ng, una soglia critica per l'analisi del DNA libero cellulare (cfDNA) da biopsie liquide. Abbiamo confrontato Active-Seq con il sequenziamento dell'intero genoma con bisolfito e abbiamo dimostrato una mappatura accurata dei livelli di metilazione genomica con Active-Seq utilizzando solo una frazione delle letture di sequenziamento.

Infine, abbiamo mostrato l'applicazione di Active-Seq per la scoperta di biomarcatori utilizzando campioni di tessuto di pazienti oncologici e per la profilazione epigenomica del cfDNA di pazienti oncologici.

I risultati principali del documento sono stati:

• Active-Seq consente di ottenere un arricchimento del DNA non metilato di circa 160 volte rispetto allo sfondo, con un'efficienza del flusso di lavoro pari al 60-80% di recupero del DNA.
• È possibile generare profili epigenomici a livello del genoma utilizzando circa 1/10 delle letture di sequenziamento richieste per tecnologie di conversione delle basi comparabili.
• Le regioni arricchite e non metilate del genoma si sovrappongono ai promotori, agli enhancer e ad altri elementi genomici trascrizionalmente attivi.
• Gli studi comparativi che utilizzano Active-Seq consentono la scoperta di biomarcatori a livello dell'intero genoma.
• La profilazione epigenomica del cfDNA dei pazienti oncologici suggerisce che Active-Seq troverà applicazione nella scoperta di biomarcatori clinici e nella diagnosi del cancro in futuro. 

Profilazione epigenomica robusta e completa del genoma

Abbiamo dimostrato che Active-Seq fornisce un profilo epigenetico ricco di informazioni, esteso all'intero genoma, unico tra le tecnologie di profilazione della metilazione per la sua capacità di colpire il 20-30% dei siti CpG non metilati nel genoma. Questa focalizzazione sulle regioni non metilate consente una profilazione epigenomica economicamente vantaggiosa con una lettura affidabile che anticorrela ai livelli di metilazione del gold standard, il sequenziamento dell'intero genoma con bisolfito.

Active-Seq è altamente riproducibile, con coefficienti di correlazione tra replicati tecnici compresi tra 0,91 e 0,96. Abbiamo dimostrato che può essere applicato a biopsie liquide, tessuti freschi congelati e campioni di tessuto FFPE.

Il genoma non metilato include enhancer che definiscono il tipo cellulare e domini parzialmente metilati che presentano una ridotta metilazione del DNA a seguito della rapida divisione cellulare tumorale. Queste caratteristiche biologiche, tra le altre, forniscono informazioni diagnostiche chiave che completano l'approccio degli attuali approcci basati sulla metilazione.

Abbiamo applicato con successo Active-Seq al tumore ed al tessuto normale adiacente di una piccola coorte di pazienti affetti da tumore del colon-retto e siamo stati in grado di identificare decine di migliaia di alterazioni della metilazione del DNA associate al tumore. Le regioni identificate erano correlate alla biologia tumorale nota.

Utilizzando il cfDNA di pazienti affetti da tumore del colon-retto, siamo stati in grado di identificare i casi di cancro utilizzando il segnale derivato dalle regioni del genoma identificate come ipometilate nei tumori solidi del colon-retto.

Il nostro studio si basa sullo sviluppo pionieristico di questo approccio da parte di Kriukienė et al., migliorando significativamente l'efficienza del processo di arricchimento. Ciò trasforma l'utilità della tecnologia da strumento di ricerca a strumento applicabile in ambito clinico su cfDNA estratto da campioni di pazienti.

Questo studio si concentra sullo sviluppo e sulla validazione tecnica della piattaforma Active-Seq. I primi risultati mostrano le potenzialità della piattaforma applicata ai campioni clinici, tuttavia il numero di campioni di pazienti analizzati nello studio attuale non è sufficiente a supportare la validazione clinica. Questo è l'obiettivo del nostro attuale lavoro.

Fornire un quadro completo dell'epigenoma su larga scala

Con un onere di sequenziamento significativamente ridotto rispetto alle tecnologie di profilazione della metilazione genomica gold standard, Active-Seq apre nuove strade all'epigenetica come strumento di ricerca e nelle applicazioni cliniche. I nostri prossimi passi immediati includono l'estensione della coorte del cancro del colon-retto a uno studio clinico pilota, per convalidare l'utilità della piattaforma per la diagnosi precoce della malattia.

La compatibilità del metodo con i campioni di biopsia liquida e la sua capacità di arricchire sia i promotori ipermetilati che i domini ipometilati lo rendono particolarmente adatto per una profilazione completa del cancro.

Attraverso la piattaforma ActiveAce di Tagomics, immaginiamo che Active-Seq diventi la base per una profilazione multiomica semplificata a partire da campioni di biopsia liquida. La tecnologia fornisce accesso a informazioni genetiche, epigenetiche e frammentarie nel cfDNA, consentendoci di costruire un quadro completo del benessere del paziente a partire da un semplice esame del sangue.

ENGLISH

A novel enzymatic platform for epigenomic analysis has been developed, requiring only a fraction of the sequencing depth typically required by traditional approaches.

Researchers from Tagomics, the University of Birmingham, and the Van Andel Institute have developed “Active-Seq”, a novel enzymatic platform for epigenomic analysis that requires just a fraction of the sequencing depth of traditional approaches. Published in Cell Reports Methods, the study demonstrates genome-wide epigenomic profiling with DNA inputs in the (sub)nanogram range. The multi-institutional study, led by Tagomics, demonstrates how a focus on unmethylated DNA could revolutionize epigenetic analysis, particularly for liquid biopsy samples.

A story of two parts: methylated and unmethylated DNA

Unsurprisingly, current DNA methylation technologies focus on detecting DNA methylation. This modification is typically associated with gene silencing. The unmethylated regions of the genome tell the opposite, equally important story of our active, accessible DNA. For example, unmethylated enhancers define cell-type identity, and DNA hypomethylation is a characteristic feature of early cancer development.

We developed Active-Seq to target the analysis of these understudied genomic features, and to avoid the expense and sequencing redundancy associated with existing genome-wide, base-converting approaches for studying DNA methylation.

We tailored Active-Seq for application in liquid biopsy testing, focusing efforts on a workflow that was simple to implement, non-damaging towards DNA, and robust and reproducible with DNA input amounts on the nanogram scale, typical of liquid biopsy samples.

A streamlined enzymatic approach

We developed a single-tube workflow that combines enzymatic DNA tagging, enrichment of unmethylated DNA, and library preparation. The method uses a repurposed bacterial methyltransferase enzyme and a synthetic cofactor analog to enable capture and enrichment of unmethylated DNA fragments.

The study showed that the workflow is highly efficient and compatible with DNA inputs as low as 1 ng, a critical threshold for analyzing cell-free DNA (cfDNA) from liquid biopsies. We benchmarked Active-Seq against whole genome bisulfite sequencing and showed accurate mapping of genomic methylation levels with Active-Seq using only a fraction of the sequencing reads.

Finally, we showed the application of Active-Seq for biomarker discovery using tissue samples from cancer patients, and for the epigenomic profiling of cfDNA from cancer patients.

The key findings of the paper were:

• Active-Seq achieves approximately 160-fold enrichment of unmethylated DNA over background, with workflow efficiency of 60–80% DNA recovery.
• Genome-wide, epigenomic profiles can be generated using around 1/10th of the sequencing reads required for comparable base-converting technologies.
• Enriched, unmethylated regions of the genome overlap with promoters, enhancers and other transcriptionally-active genomic elements.
• Comparative studies using Active-Seq enable genome-wide biomarker discovery.
• Epigenomic profiling of cancer patient cfDNA suggests Active-Seq will find application in clinical biomarker discovery and cancer diagnostics in the future. 

Robust, genome-wide epigenomic profiling

We showed that Active-Seq provides an information-rich, genome-wide epigenetic profile that is unique amongst methylation profiling technologies in its ability to target the 20–30% of CpG sites in the genome that are unmethylated. This focus on unmethylated regions allows cost-effective epigenomic profiling with a robust readout that anticorrelates to the methylation levels of the gold standard, whole genome bisulfite sequencing.

Active-Seq is highly reproducible, with correlation coefficients of 0.91–0.96 between technical replicates. We showed that it can be applied to liquid biopsy, fresh-frozen tissue and FFPE tissue samples.

The unmethylated genome includes cell-type-defining enhancers and partially methylated domains that see reduced DNA methylation as a result of rapid tumor cell division. These biological features, amongst others, provide key diagnostic information that complements the focus of existing methylation-based approaches.

We successfully applied Active-Seq to tumor and normal adjacent tissue from a small cohort of colorectal cancer patients and were able to identify tens-of-thousands of tumor-associated DNA methylation changes. The regions identified correlated with known tumor biology.

Using cfDNA from colorectal cancer patients, we were able to identify cancer cases using the signal derived from regions of the genome identified as hypomethylated in solid colorectal tumours.

Our study builds on the pioneering development of this approach by Kriukienė et al., by significantly improving the efficiency of the enrichment process. This transforms the utility of the technology from a research tool to one that can be applied in the clinic on cfDNA extracted from patient samples.

This study focuses on the development and technical validation of the Active-Seq platform. Early results show the promise of the platform applied to clinical samples, yet patient sample numbers in the current study are not sufficient to build the case for clinical validation. This is the objective of our current work.

Delivering a complete picture of the epigenome at scale

With a significantly reduced sequencing burden over the gold-standard genome-wide methylation profiling technologies, Active-Seq opens new avenues for epigenetics as a research tool, and in clinical applications. Our immediate next steps include expanding the colorectal cancer cohort to a pilot clinical study, to validate the platform's utility for early disease detection.

The method's compatibility with liquid biopsy samples and its ability to enrich both hypermethylated promoters and hypomethylated domains make it uniquely suited for comprehensive cancer profiling.

Through Tagomics’ ActiveAce platform, we envision Active-Seq becoming a foundation for streamlined, multiomic profiling from liquid biopsy samples. The technology provides access to genetic, epigenetic and fragmentomic information in cfDNA, allowing us to build a comprehensive picture of patient wellbeing from a simple blood test.

Da:

https://www.technologynetworks.com/genomics/blog/targeting-the-unmethylated-genome-a-new-approach-to-epigenetic-profiling-408254