Come utilizzare la separazione cellulare per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) / How to Use Cell Sorting for Single-Cell RNA Sequencing (scRNA-seq)

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figura 1. Confronto tra sequenziamento dell'RNA in massa e sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) / Comparison of bulk RNA sequencing vs. single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivoluzionato il modo in cui i ricercatori studiano l'eterogeneità cellulare nei tessuti complessi. Tuttavia, la qualità di un esperimento su singola cellula dipende fortemente dalla preparazione del campione e dall'isolamento cellulare, soprattutto quando si lavora con tessuti eterogenei o popolazioni cellulari rare. In questa guida, esaminiamo come i metodi di selezione cellulare, come la citometria a flusso (FACS), possano migliorare la qualità dei dati nei flussi di lavoro di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Che cos'è il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)?

Il sequenziamento a singola cellula è un metodo utilizzato per analizzare le informazioni molecolari delle singole cellule, come RNA, DNA ed espressione proteica. Isolando ciascuna cellula in goccioline o pozzetti di una piastra, gli scienziati possono utilizzare tecniche di sequenziamento di nuova generazione per collegare questi dati molecolari a cellule specifiche. Ciò avviene mediante l'aggiunta di codici a barre molecolari a ciascun trascritto (nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula, o scRNA-seq), che identificano il trascritto come una molecola unica e ne indicano la provenienza. Prima di questo approccio, gli scienziati si basavano su misurazioni di massa, estraendo e analizzando DNA o RNA da un gruppo di cellule. Questo forniva un profilo generale del DNA o dell'RNA in molte cellule, ma mascherava le differenze tra le singole cellule. L'analogia tra frullato e macedonia di frutta viene spesso utilizzata per visualizzare questo concetto. Se si beve un frullato a base di banane, mele e mirtilli, si potrebbe riconoscere ogni sapore, ma non sapere in che misura ciascun frutto contribuisca al gusto complessivo. Questo è simile al sequenziamento di massa. D'altra parte, mangiare una macedonia di frutta, in cui ogni frutto è chiaramente distinguibile, è simile al sequenziamento di singole cellule.

Il metodo più comune per la scRNA-seq è quello basato su goccioline, in cui le cellule vengono incapsulate in una goccia d'olio che contiene anche una microsfera di gel. La microsfera di gel, a sua volta, trasporta numerosi oligonucleotidi utilizzati per codificare le trascrizioni di RNA.

Per ottenere dati più chiari, dobbiamo mantenere la maggior quantità possibile del segnale desiderato (trascritti di RNA) all'interno della cellula e ridurre al minimo la fuoriuscita all'esterno. In altre parole, le cellule devono essere sane, integre e integre. Qualsiasi danno alla membrana cellulare causerà la fuoriuscita di RNA nella sospensione. Questo RNA fuoriuscito può essere considerato una contaminazione da RNA ambientale, spesso definita "rumore". Questa è una sfida comune nei flussi di lavoro di sequenziamento dell'RNA di singole cellule basati su goccioline. Vogliamo rilevare l'RNA associato alla cellula (segnale) e distinguerlo dall'RNA presente nell'ambiente (rumore). Analogamente alla citometria a flusso, il nostro obiettivo è massimizzare il rapporto segnale/rumore.

Isolamento cellulare per scRNA-seq

Per eseguire un esperimento di scRNA-seq, il primo passo consiste nell'ottenere il campione cellulare. Se il campione è un frammento di tessuto proveniente da un organo, deve essere dissociato in una sospensione cellulare utilizzando gli stessi passaggi impiegati per l'analisi mediante citometria a flusso. I metodi di dissociazione possono includere la digestione enzimatica, la lisi meccanica o l'estrazione nucleare.

Procedure ottimali per la preparazione delle cellule per il sequenziamento di singole cellule

Ecco alcuni consigli per la preparazione delle cellule per il sequenziamento di singole cellule.

Ridurre al minimo la manipolazione e il tempo di dissociazione cellulare. Una manipolazione delicata è fondamentale per ridurre lo stress cellulare, che può alterare i profili trascrizionali.
Utilizzare puntali per pipetta a foro largo per ridurre la pressione.
Quando possibile, mantieni le celle a bassa temperatura.
Aggiungi inibitori di RNasi, BSA ed EDTA ai tamponi per la sospensione cellulare, nelle quantità raccomandate dal produttore di ciascun kit per scRNA-seq. La degradazione dell'RNA è una delle principali cause di dati di scarsa qualità.
- È buona norma seguire il protocollo e le ricette dei tamponi raccomandati da ciascun produttore, che possono variare da un produttore all'altro. I reagenti compatibili con un kit scRNA potrebbero non funzionare con un altro. In caso di dubbi, consultare il team di supporto tecnico.

Una volta generata una sospensione di cellule singole, queste possono essere isolate utilizzando diversi metodi di cattura per il sequenziamento di singole cellule, tra cui:

Citometria a flusso mediante separazione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)
Separazione cellulare mediante attivazione magnetica (MACS)
Microfluidica a gocce (ad esempio 10x Genomics Chromium)
Sistemi di cattura a micro o nanopozzetti (ad es. BD Rhapsody, Takara iCELL)
Indicizzazione combinatoria (ad esempio Parse Biosciences)
Gocce generate da vortici (ad esempio Illumina PIPseq)

La separazione cellulare è il metodo più frequentemente utilizzato per migliorare la qualità degli esperimenti su singole cellule. Permette di arricchire specifiche popolazioni cellulari, eliminare cellule morte o detriti e collegare l'espressione proteica con la trascrittomica. Inoltre, viene spesso utilizzata per depositare singole cellule nei pozzetti di una piastra, come avviene nei protocolli Smart-seq.

I sistemi basati su goccioline in genere non richiedono la selezione delle cellule prima della cattura. Tuttavia, quando le cellule di interesse sono rare o i campioni sono altamente eterogenei, l'arricchimento delle popolazioni di interesse contribuirà a migliorare l'efficienza del sequenziamento e a ridurre le letture "sprecate".

A volte, ottenere cellule vitali di alta qualità da un campione di tessuto non è possibile. Ad esempio, i tessuti congelati o quelli provenienti dal cervello o dal fegato richiedono in genere l'isolamento dei nuclei. Questo può essere fatto mediante la separazione di campioni colorati con un colorante per il DNA come DAPI o AO / PI . In alternativa, le cellule possono essere fissate utilizzando paraformaldeide o fissazione con DSP-metanolo. Sebbene questo metodo preservi le cellule, non tutte le piattaforme per l'analisi di singole cellule sono compatibili con campioni fissati. Inoltre, non tutti gli anticorpi per la citometria a flusso funzionano con ogni fissativo, quindi è importante verificare la compatibilità sia per il test di singola cellula che per la strategia di separazione.

Procedure ottimali per la selezione delle cellule a monte del sequenziamento a singola cellula.

Un'attenta ottimizzazione e una pianificazione accurata sono fondamentali per il successo del vostro esperimento. Oltre a seguire le migliori pratiche per la manipolazione cellulare sopra elencate, è altrettanto importante selezionare il metodo di smistamento appropriato e regolare le impostazioni del separatore in base al tipo di cellula o di campione.

Impostazioni dell'ordinamento da regolare:

Quando si tratta di dimensioni dell'ugello, più grande è meglio, soprattutto per le cellule fragili.
Utilizzare le impostazioni di pressione e velocità di flusso della guaina più basse per ridurre al minimo lo stress cellulare.
Eseguire la calibrazione del ritardo di eliminazione prima di ogni ordinamento.

Alcuni separatori cellulari sono più adatti ai flussi di lavoro di genomica a singola cellula grazie alla loro bassa pressione e alle basse velocità di flusso. Tra questi figurano il MACSQuant® Tyto® di Miltenyi e l'SH800S di Sony Biotechnology . I separatori tradizionali basati su gocce consentono un gating multiparametrico ad alta velocità, permettendo agli utenti di separare rapidamente un gran numero di cellule. Tuttavia, le cellule possono essere danneggiate e presentare una qualità dell'RNA inferiore a causa dello stress cellulare indotto dal separatore 1, 2 .

Controllo di qualità per esperimenti di sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Si dice spesso che se si introducono dati scadenti negli esperimenti di scRNA-seq, si otterranno risultati scadenti. Ma come si possono misurare la salute cellulare e l'integrità della membrana? Esistono diversi controlli di qualità che possono essere eseguiti prima della cattura cellulare, tra cui:

Monitorare la vitalità cellulare durante e dopo la selezione utilizzando una colorazione per cellule vive/morte.
Controllo delle singole magliette utilizzando FSC-A rispetto a FSC-H
Rimuovere i detriti
Verificare le dimensioni e la granularità delle celle
Determinare la qualità dell'RNA controllando il punteggio RIN 3
Dopo la separazione, esaminare le cellule al microscopio e con un colorante cellulare (ad esempio blu di tripano o AO/PI). La membrana cellulare o nucleare deve essere intatta e priva di vescicole.

Considerazioni chiave nella pianificazione di un esperimento di separazione cellulare

Come si determina quando utilizzare la separazione cellulare prima della sequenziatura dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)? Tenete presente quanto segue durante la pianificazione dell'esperimento:

Domanda biologica
- Stai cercando un tipo di cellula nuovo o raro?
- Stai creando un atlante cellulare?
- La selezione delle cellule creerebbe un campione distorto?
Popolazioni di interesse
- Qual è la frequenza della popolazione cellulare di interesse nel materiale di partenza?
Dimensione del campione e complessità
- Con quante cellule parti?
- Partirai da un campione di tessuto che conterrà un'elevata quantità di detriti associati alla dissociazione?
- Sono presenti numerose popolazioni cellulari nel campione iniziale?
- Le tue cellule sono grandi, fragili o hanno una forma non sferica?
  - Le cellule con dendriti o quelle lunghe e sottili possono ostruire i sistemi microfluidici.
  - Le cellule fragili potrebbero non sopravvivere alla separazione ad alta pressione.
- Piattaforma di scRNA-seq a valle
  - I metodi basati su piastre richiedono la separazione di una cellula in ciascun pozzetto.
  - I metodi basati sulle goccioline incapsulano le singole cellule dalla sospensione cellulare. In questi flussi di lavoro, la separazione cellulare viene in genere utilizzata per arricchire la popolazione cellulare di interesse o per rimuovere i detriti prima della cattura delle cellule.

In definitiva, la scelta di separare le cellule dipende dal fatto che si tratti di risolvere un problema di qualità del campione o di rispondere a una domanda di natura biologica, come ad esempio arricchire la popolazione di cellule rare o rimuovere detriti e cellule morte o morenti. Prima di iniziare la fase di cattura cellulare, è utile eseguire un piccolo test preliminare per confrontare campioni separati e non separati o per esercitarsi nelle procedure di manipolazione e dissociazione cellulare.

Supporto alla tua ricerca: integrazione della citometria a flusso con il sequenziamento di singole cellule.

La selezione e la fenotipizzazione cellulare basate sulla fluorescenza sono spesso fasi cruciali nei flussi di lavoro di sequenziamento di singole cellule, soprattutto quando si tratta di arricchire popolazioni rare, rimuovere detriti o cellule morte o convalidare marcatori identificati da dati di scRNA-seq. FluoroFinder aiuta i ricercatori a progettare pannelli di citometria a flusso ottimizzati , identificando anticorpi e fluorofori compatibili con specifici strumenti e obiettivi sperimentali. Semplificando la scoperta di anticorpi e la progettazione dei pannelli, FluoroFinder consente agli scienziati di integrare in modo efficiente la citometria a flusso, la selezione FACS e approcci multiomici come CITE-seq nei loro flussi di lavoro di sequenziamento di singole cellule, migliorando al contempo la qualità e la riproducibilità dei dati.

ENGLISH

Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) has transformed how researchers study cellular heterogeneity in complex tissues. However, the quality of a single-cell experiment depends heavily on sample preparation and cell isolation, particularly when working with heterogeneous tissues or rare cell populations. In this guide, we review how cell sorting methods such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) can improve data quality in single-cell RNA sequencing workflows.

What is Single-Cell RNA Sequencing (scRNA-seq)?

Single-cell sequencing is a method used to analyze the molecular information of individual cells, such as RNA, DNA, and protein expression. By isolating each cell into droplets or wells of a plate, scientists can use next-generation sequencing techniques to link this molecular data to specific cells. This is done by attaching molecular barcodes to each transcript (in single-cell RNA sequencing, or scRNA-seq), which identify the transcript as a unique molecule and show where it came from. Before this approach, scientists depended on bulk measurements by extracting and analyzing DNA or RNA from a group of cells. This gave an overall profile of DNA or RNA across many cells but masked differences between individual cells. The smoothie-versus-fruit-salad analogy is often used to help visualize this. If you drink a smoothie made of bananas, apples, and blueberries, you might recognize each flavor but not know how much of each fruit contributes to the taste. This is similar to bulk sequencing. On the other hand, eating a fruit salad, where each fruit is clearly distinguishable, is similar to single-cell sequencing.

What is Single-Cell RNA Sequencing (scRNA-seq)?

The most common method for scRNA-seq is droplet-based, where cells are encapsulated in an oil droplet that also contains a gel bead. The gel bead, in turn, carries many oligonucleotides used to barcode RNA transcripts.

To obtain the clearest data, we need to keep as much of the desired signal (RNA transcripts) inside the cell and minimize what escapes outside. In other words, the cells should be healthy, happy, and intact. Any damage to the cell membrane will cause RNA to leak into the suspension. This leaked RNA can be considered ambient RNA contamination—often referred to as “noise”. This is a common challenge in droplet-based single-cell RNA sequencing workflows. We want to detect cell-associated RNA (signal) and distinguish it from the RNA in the environment (noise). Similar to flow cytometry, our goal is to maximize the signal-to-noise ratio.

Cell Isolation for scRNA-seq

To perform a scRNA-seq experiment, the first step is to obtain your cell sample. If the sample is a piece of tissue from an organ, it should be dissociated into a cell suspension using the same steps as for flow cytometry analysis. Dissociation methods can include enzymatic digestion, mechanical lysis, or nuclear extraction.

Best Practices for Preparing Cells for Single-Cell Sequencing

Here are some recommendations for preparing cells for single-cell sequencing.

Minimize cell handling and dissociation time. Gentle handling is crucial to reduce cell stress, which can change transcriptional profiles.
Use wide-bore pipette tips to reduce pressure.
Keep cells at a low temperature whenever possible.
Include RNase inhibitors, BSA, and EDTA in cell suspension buffers, at amounts recommended by each scRNA-seq kit manufacturer. RNA degradation is a major contributor to poor data.
- It is good practice to follow each manufacturer’s recommended protocol and buffer recipes, which may vary between manufacturers. Reagents that are compatible with one scRNA kit might not work with another. When in doubt, consult the technical support team.

Once a single-cell suspension has been generated, cells can be isolated using several single-cell sequencing capture methods, including:

Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
Magnetic-activated cell sorting (MACS)
Droplet microfluidics (i.e. 10x Genomics Chromium)
Micro- or nanowell capture systems (i.e. BD Rhapsody, Takara iCELL)
Combinatorial indexing (i.e. Parse Biosciences)
Vortex-generated droplets (i.e. Illumina PIPseq)

Cell sorting is the most frequently used method to enhance the quality of single-cell experiments. It can enrich for specific cell populations, eliminate dead cells or debris, and connect protein expression with transcriptomics. Additionally, it is often used to deposit individual cells into wells of a plate, as seen in Smart-seq protocols.

Droplet-based systems typically do not require sorting cells before capture. However, when the cells of interest are rare or the samples are highly heterogeneous, enrichment of populations of interest will help improve sequencing efficiency and reduce “wasted” reads.

Sometimes, obtaining high-quality, viable cells from a tissue sample is not possible. For example, tissues that have been frozen or those from the brain or liver typically require nuclei isolation. This can be done by sorting samples stained with a DNA dye such as DAPI or AO/PI. Alternatively, cells can be fixed using paraformaldehyde or DSP-methanol fixation. While this method preserves cells, not all single-cell platforms are compatible with fixed samples. Moreover, not all flow cytometry antibodies work with every fixative, so it is important to check compatibility for both the single-cell assay and the sorting strategy.

Best Practices for Sorting Cells Upstream of Single-Cell Sequencing

Careful optimization and thorough planning are crucial for the success of your experiment. In addition to following the best practices for cell handling listed above, it is also important to select the appropriate sorting method and adjust the sorter settings for your cell or sample type.

Sorter settings to adjust:

Bigger is better when it comes to nozzle size, especially for fragile cells.
Use the lowest sheath pressure and flow rate settings to minimize cell stress.
Perform drop delay calibration before each sort.

Some cell sorters are better suited for single-cell genomics workflows because of their low pressure and flow rates. These include Miltenyi’s MACSQuant® Tyto® and Sony Biotechnology’s SH800S. Traditional droplet-based sorters enable high-speed, multiparameter gating, allowing users to quickly sort large numbers of cells. However, the cells can be damaged and have lower RNA quality due to sorter-induced cell stress1, 2.

Quality Control for Single-Cell RNA Sequencing Experiments

It is often said that if you put garbage into your scRNA-seq experiments, you will get garbage out. But how can cell health and membrane integrity be measured? There are several quality control checks that can be done prior to cell capture, including:

Monitor viability during and after sorting by using a live/dead stain.
Gate on singlets using FSC-A vs FSC-H
Remove debris
Check cell size and granularity
Determine RNA quality by checking the RIN score3
After sorting, check cells with a microscope and cell dye (i.e. Trypan blue or AO/PI). The cell or nucleus membrane should be intact with no blebbing.

Key Considerations When Planning a Cell Sorting Experiment

How do you determine when to use cell sorting before scRNA-seq? Keep the following in mind when planning your experiment:

Biological question
- Are you trying to find a new or rare cell type?
- Are you creating a cell atlas?
- Would sorting cells create a biased sample?
Populations of interest
- What is the frequency of the cell population of interest within the starting material?
Sample size and complexity
- How many cells are you starting with?
- Are you starting with a tissue sample that will have high amounts of dissociation-associated debris?
- Are there many cell populations within your starting sample?
- Are your cells large, fragile, or have a non-round shape?
  - Cells with dendrites or those that are long and spindly may clog microfluidics.
  - Fragile cells may not survive high-pressure sorting.
- Downstream scRNA-seq platform
  - Plate-based methods require sorting one cell into one well.
  - Droplet-based methods will encapsulate individual cells from the cell suspension. For these workflows, sorting is typically used to enrich for a particular population of interest or to clean up debris prior to cell capture.

Ultimately, the choice of whether to sort cells depends on whether it addresses a sample quality problem or a biological question, such as enriching rare cell types or removing debris and dead or dying cells. Before starting the cell capture part of the experiment, it’s helpful to do a small pilot test to compare sorted and unsorted samples or to practice the cell handling and dissociation steps.

Supporting Your Research – Integrating Flow Cytometry with Single-Cell Sequencing

Fluorescence-based cell sorting and phenotyping are often critical steps in single-cell sequencing workflows, especially when enriching rare populations, removing debris or dead cells, or validating markers identified from scRNA-seq data. FluoroFinder helps researchers design optimized flow cytometry panels by identifying compatible antibodies and fluorophores for specific instruments and experimental goals. By simplifying antibody discovery and panel design, FluoroFinder enables scientists to efficiently integrate flow cytometry, FACS sorting, and multiomic approaches such as CITE-seq into their single-cell sequencing workflows while improving data quality and reproducibility.

Da:

https://fluorofinder.com/how-to-use-cell-sorting-for-single-cell-rna-sequencing-scrna-seq/?_hsenc=p2ANqtz-9HUK77iUebFdcm2_S6mQ8T84sQQLi-LhXsc0xMj8fblyXJbZ5qX5pFTnWn3C6PDmxdYdQlGDlvr-71--eoV9bOUeFApDoSGWNnn2a4jJvF9sJM9Rg&_hsmi=408664617

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