Cambio di marcia: una nuova piattaforma svela i segreti della regolazione della velocità di trascrizione. / Switching gears: novel platform spills secrets of transcription’s speed regulation

Cambio di marcia: una nuova piattaforma svela i segreti della regolazione della velocità di trascrizione. / Switching gears: novel platform spills secrets of transcription’s speed regulation

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Grazie ad una piattaforma unica nel suo genere, stiamo iniziando a capire come il motore molecolare responsabile della trascrizione nei mammiferi ne controlla la velocità.

Un gruppo di ricercatori della Rockefeller University (New York, USA) e del Fudan University Shanghai Cancer Center (Shanghai, Cina) ha inventato una nuova piattaforma a singola molecola per far luce sui meccanismi della trascrizione del DNA nei mammiferi, con implicazioni di vasta portata in tutta la biologia, compresa la ricerca sul cancro e sull'invecchiamento.

L'allungamento della trascrizione da parte della RNA polimerasi II (Pol II) – il complesso enzimatico responsabile della trascrizione del DNA in mRNA negli eucarioti – è una parte essenziale dell'espressione genica. Durante questo processo, la velocità con cui il complesso proteico si muove lungo il filamento di DNA non è costante ed è regolata da diversi fattori di allungamento.

Nei metazoi, sappiamo che la Pol II si ferma dopo aver assemblato il complesso di inizio a livello del promotore ed aver trascritto 30-60 nucleotidi di RNA. A questo punto, fattori di allungamento come P-TEFb, DSIF e PAF1C avviano il rilascio della Pol II e danno il via ad un periodo di rapida trascrizione, prima che la macchina molecolare intervenga bruscamente e deceleri verso l'estremità 3' del gene per consentire la terminazione della trascrizione.

La disregolazione dell'allungamento è stata collegata a malattie ed invecchiamento; tuttavia, gli esatti meccanismi regolatori che ne sono alla base rimangono ancora poco chiari, soprattutto negli eucarioti superiori. La ricerca sul complesso di allungamento dei mammiferi è stata finora limitata dalla mancanza di tecniche appropriate; le tecniche utilizzate non sono state in grado di chiarire il contributo delle singole proteine ​​né di cogliere la complessità dei meccanismi regolatori eucariotici negli studi a singola molecola condotti su organismi più semplici.

Per contrastare questo problema, il gruppo ha creato una piattaforma a singola molecola per osservare l'allungamento della trascrizione nei mammiferi in tempo reale. Hanno ricostituito il complesso di allungamento dei mammiferi utilizzando proteine ​​purificate assemblate su un'impalcatura di acido nucleico sintetico contenente un primer di RNA con l'estremità 5' marcata fluorescentemente ed uno stampo di DNA biotinilato ad entrambe le estremità.

La struttura è stata quindi ancorata tra una coppia di microsfere rivestite di streptavidina e visualizzata su uno strumento C-Trap che combina pinzette ottiche a doppia trappola e microscopia a fluorescenza a singola molecola.

Combinando biochimica, imaging a singola molecola e calcolo computazionale, i ricercatori sono stati in grado di osservare la Pol II in azione, seguendone l'accelerazione e le pause, e di determinare il ruolo di ciascun fattore di allungamento responsabile della sua cinetica.

"Questa è la prima volta che siamo riusciti a osservare la Pol II dei mammiferi muoversi ad una velocità fisiologica in tempo reale e, grazie all'etichettatura dei vari fattori di allungamento, siamo stati anche in grado di misurarne la cinetica di legame durante la trascrizione attiva", ha spiegato il primo autore Yukun Wang.

Il gruppo ha identificato una gerarchia di diversi fattori chiave di allungamento – P-TEFb, DSIF, PAF1C, SPT6 e RTF1 – che agiscono in sinergia per ottenere un'attività di allungamento ottimale.

"Ciò che colpisce davvero è come questa macchina funzioni quasi come un'automobile finemente regolata", ha aggiunto l'autore corrispondente Shixin Liu. "Ha l'equivalente di più marce, o modalità di velocità, ciascuna controllata dal legame di diverse proteine ​​regolatrici. Abbiamo scoperto, per la prima volta, come viene controllata ciascuna marcia."

Oltre a far luce su come questo meccanismo regolatorio possa essere coinvolto nelle malattie ed ad aprire nuove prospettive per la progettazione di terapie – il P-TEFb, ad esempio, è considerato un promettente bersaglio farmacologico per la leucemia ed i tumori solidi – la piattaforma dimostra che la visualizzazione di singole molecole è possibile in un sistema mammifero completamente ricostituito. Pertanto, esistono molteplici potenziali applicazioni, in biologia e non solo.

"Qualsiasi applicazione che implichi la navigazione nello spazio e le variazioni di velocità potrebbe potenzialmente utilizzare questo software", ha profetizzato Joel E. Cohen, uno degli autori dell'articolo.

ENGLISH

Thanks to a first-of-its-kind platform, we are starting to understand how the molecular engine responsible for transcription in mammals controls its speed.

A team of researchers from The Rockefeller University (NY, USA) and Fudan University Shanghai Cancer Center (Shanghai, China) has invented a novel single-molecule platform to illuminate the intricacies of mammalian DNA transcription, with far-reaching implications throughout biology, including cancer and aging research.

Transcription elongation by RNA polymerase II (Pol II) – the enzyme complex responsible for transcribing DNA into mRNA in eukaryotes – is an essential part of gene expression. During this process, the speed at which the protein complex moves along the DNA template is not constant and is governed by several elongation factors.

In metazoans, we know that Pol II pauses after assembling the initiation complex at the promoter and transcribing 30–60 nucleotides of RNA. At this point, elongation factors such as P-TEFb, DSIF and PAF1C initiate the release of Pol II and kickstart a period of rapid transcription, before the molecular machine slams on the breaks and decelerates toward the 3′ end of the gene to allow for the termination of transcription.

Dysregulation of elongation has been linked to disease and aging; however, the exact regulatory mechanisms that underpin it remain incompletely understood, especially for higher eukaryotes. Research on the mammalian elongation complex has thus far been limited by a lack of appropriate techniques; those techniques used could not illuminate the contributions of individual proteins nor capture the complexity of eukaryotic regulatory mechanisms in single-molecule studies in simpler organisms.

To combat this, the team built a single-molecule platform to watch mammalian transcription elongation in real time. They reconstituted the mammalian elongation complex using purified proteins assembled on a synthetic nucleic acid scaffold containing an RNA primer with its 5′ end fluorescently labeled and a DNA template that was biotinylated at either end.

The construct was then tethered between a pair of streptavidin-coated beads and visualized on a C-Trap instrument that combines dual-trap optical tweezers and single-molecule fluorescence microscopy.

Combining biochemistry, single-molecule imaging and computation, the researchers were able to see Pol II in action, following along as it accelerated and paused, and determine the role of each elongation factor responsible for its kinetics.

“This is the first time we’ve been able to see mammalian Pol II move at a physiological speed in real time and, because we labeled the various elongation factors, we were also able to measure their binding kinetics during active transcription,” first author Yukun Wang explained.

The team identified a hierarchy of several key elongation factors – P-TEFb, DSIF, PAF1C, SPT6 and RTF1 – which act synergistically to achieve optimal elongation activity.

“What’s really striking is how this machine functions almost like a finely tuned automobile,” added corresponding author Shixin Liu. “It has the equivalent of multiple gears, or speed modes, each controlled by the binding of different regulatory proteins. We figured out, for the first time, how each gear is controlled.”

As well as shedding light on how this regulatory mechanism may be involved in disease and opening doors for therapeutic design – P-TEFb, for example, is considered a promising drug target for leukemia and solid tumors – the platform proves that single-molecule visualization is possible in a fully reconstituted mammalian system. As such, there are a multitude of potential applications, in biology and beyond.

“Anything that involves navigation in space and changes in speed could potentially use this software,” prophesized Joel E. Cohen, an author on the paper.

Da:

https://www.biotechniques.com/molecular-biology/switching-gears-novel-platform-spills-secrets-of-transcriptions-speed-regulation/