Presentazione di PLAMseq: un nuovo metodo di sequenziamento che trasforma la caratterizzazione proteogenomica. / Introducing PLAMseq: new sequencing method transforms proteogenomic characterization

Presentazione di PLAMseq: un nuovo metodo di sequenziamento che trasforma la caratterizzazione proteogenomica. / Introducing PLAMseq: new sequencing method transforms proteogenomic characterization

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

È stata sviluppata una nuova tecnologia che consente di eseguire simultaneamente analisi proteomiche e genomiche.

Una nuova tecnica innovativa sviluppata dal Centro Andaluso di Biologia Molecolare e Medicina Rigenerativa (Siviglia, Spagna) consente di caratterizzare l'ambiente genomico e proteomico di una proteina di interesse nello stesso protocollo sperimentale. Di conseguenza, la spettrometria di massa con purificazione per affinità e marcatura di prossimità, abbinata al sequenziamento (nota anche come PLAMseq), colma una lacuna metodologica di lunga data nello studio delle proteine ​​associate alla cromatina.

Studiare la distribuzione delle proteine ​​nel genoma è fondamentale per la nostra comprensione dell'epigenetica e delle dinamiche della cromatina e, di conseguenza, per la nostra conoscenza delle malattie umane; tuttavia, presenta alcune sfide importanti. Le tecniche esistenti per lo studio della distribuzione delle proteine ​​genomiche, come l'immunoprecipitazione della cromatina ed il sequenziamento (ChIP-seq), il Cut and Run e il Cut and Tag, richiedono anticorpi specifici ad alta sensibilità, il che ne limita il potenziale.

"Uno dei principali ostacoli allo studio dei loci genomici delle proteine ​​associate alla cromatina tramite ChIP-seq ed altre tecniche era la disponibilità di anticorpi specifici per ChIP", ha spiegato Román González-Prieto, responsabile principale dello studio, in un'intervista a BioTechniques. "Inoltre, gli anticorpi sono reagenti costosi che spesso presentano problemi di specificità e sensibilità."

Nel frattempo, l'approccio senza anticorpi attualmente in uso, DamID, presenta una risoluzione scarsa rispetto ad altri metodi, spingendo i ricercatori a cercare disperatamente un'alternativa valida: ecco che entra in gioco PLAMseq.

PLAMseq utilizza un enzima di biotinilazione rapida chiamato TurboID, che etichetta le proteine ​​vicine, consentendo di identificare i loci genomici e il proteoma interagente di una proteina di interesse nello stesso flusso di lavoro. Inoltre, può essere utilizzato per mappare le interazioni proteiche e le modificazioni proteiche di tipo ubiquitina.

I ricercatori hanno dimostrato che la biotina può essere utilizzata per indurre l'attività TurboID, consentendo la formazione di legami crociati tra DNA e proteine ​​e la successiva copurificazione delle proteine ​​con il DNA ad esse associato mediante l'utilizzo di microsfere di streptavidina. In seguito, i legami crociati proteina-DNA vengono invertiti e il DNA viene sequenziato, mentre le proteine ​​vengono digerite con tripsina ed identificate mediante spettrometria di massa.

Riassumendo il concetto, González-Prieto ha spiegato a BioTechniques: "PLAMseq consiste essenzialmente nell'eseguire una marcatura di prossimità con biotina e quindi indurre il cross-linking delle proteine ​​al DNA. In questo modo, possiamo co-purificare insieme l'ambiente genomico e proteomico di una proteina di interesse ed identificarla mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa e sequenziamento del DNA, il tutto nello stesso esperimento."

Il gruppo ha convalidato PLAMseq utilizzando due proteine ​​genomiche ben caratterizzate, la RNA polimerasi II e CTCF, dimostrandone la robustezza e la riproducibilità. Lo hanno inoltre applicato agli istoni H1 modificati con SUMO, che storicamente sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di reagenti specifici.

In questo studio, hanno rivelato che l'enzima SETDB1 si lega agli istoni SUMOilati che si localizzano insieme alle modificazioni epigenetiche H3K9me3 nelle regioni ripetitive del genoma, il che potrebbe aiutarci a comprendere la compattazione del DNA e la regolazione dell'espressione genica.

"In alcuni casi, PLAMseq può essere utilizzato come alternativa più economica a ChIPseq, ed anche quando non è disponibile un anticorpo di qualità ChIP", ha osservato González-Prieto a proposito delle sue applicazioni. "Tuttavia, credo che il maggiore valore aggiunto di PLAMseq risieda nella possibilità di mappare le interazioni proteiche che si verificano nel genoma utilizzando la sua modalità split-PLAMseq."

La sua modalità split-PLAMseq consente la complementazione bimolecolare, in cui due proteine ​​vengono marcate, ciascuna con un frammento complementare di TurboID. Quando queste proteine ​​interagiscono o si trovano in stretta prossimità, l'attività enzimatica di TurboID viene ripristinata e le proteine ​​vicine a questa interazione vengono biotinilate.

Per González-Prieto, l'aspetto fondamentale della ricerca è "la semplicità del metodo e la sua applicabilità allo studio delle interazioni proteiche nel genoma e delle proteine ​​che sono state modificate da processi simili all'ubiquitinazione, cosa che, nella maggior parte dei casi, non è possibile con gli anticorpi".

Riguardo al futuro della tecnologia, ha concluso: "Credo che il prossimo passo [per PLAMseq] sia quello di sfruttarla per rispondere a quesiti di ricerca per i quali prima non esisteva un metodo adeguato".

ENGLISH

A new technology to enable the simultaneous performance of proteomics and genomics has been developed.

An innovative new technique from the Andalusian Centre for Molecular Biology and Regenerative Medicine (Seville, Spain) enables the characterization of the genomic and proteomic environment of a protein of interest in the same experimental protocol. As a result, proximity-labeled affinity-purified mass spectrometry plus sequencing, aka PLAMseq, fills a long-established methodological gap in the study of chromatin-associated proteins.

Studying the distribution of proteins across the genome is essential for our understanding of epigenetics and chromatin dynamics and, therefore, our grasp of human disease, yet it presents some major challenges. Existing techniques for studying genomic protein distribution – like chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq), Cut and Run and Cut and Tag – require specific high-sensitivity antibodies, which limit their potential.

“One of the major bottlenecks for studying the genomic loci of chromatin-associated proteins via ChIP-seq and others was the availability of specific ChIP-grade antibodies,” explained Román González-Prieto, principal investigator of the study, while speaking to BioTechniques. “Plus, antibodies are costly reagents that often face specificity and sensitivity issues.”

Meanwhile, the existing antibody-free approach, DamID, has poor resolution compared to other methods, leaving researchers crying out for a viable alternative – enter PLAMseq.

PLAMseq utilizes a rapid biotinylation enzyme called TurboID, which tags nearby proteins, enabling the genomic loci and interacting proteome of a protein of interest to be identified in the same workflow. Furthermore, it can be used to map protein interactions and ubiquitin-like protein modifications.

The researchers demonstrated that biotin can be used to induce TurboID activity, DNA–protein crosslinking can take place and then they can co-purify the proteins with their associated DNA using streptavidin beads. Next, protein–DNA crosslinks are reverted and the DNA is sequenced, while the proteins are trypsin-digested and identified by mass spectrometry.

Summarizing the concept, González-Prieto told BioTechniques: “PLAMseq is basically performing proximity labelling with biotin and then inducing crosslinking of the proteins to DNA. This way, we can co-purify altogether the genomic and proteomic environment of a protein of interest and identify it by mass spectrometry-based proteomics and DNA sequencing, all in the same experiment.”

The team validated PLAMseq using two well-characterized genome proteins, RNA polymerase II and CTCF, illustrating its robustness and reproducibility. They also applied it to SUMO-modified H1 histones, which have historically been difficult to study due to a lack of specific reagents.

Here, they revealed that the enzyme SETDB1 binds to SUMOylated histones that colocalize with H3K9me3 epigenetic modifications at repetitive regions of the genome, which could help our understanding of DNA compaction and gene expression regulation.

“PLAMseq can be used in some cases as a more affordable alternative to ChIPseq, and also in cases where a ChIP-grade antibody is not available,” González-Prieto noted of its applications. “Nevertheless, I think the bigger added value of PLAMseq is to map protein interactions that occur in the genome using its split-PLAMseq mode.”

Its split-PLAMseq mode allows for bimolecular complementation, whereby two proteins are tagged, each with a complementary fragment of TurboID. When these proteins interact or are in close proximity, TurboID’s enzymatic activity is restored, and proteins nearby to this interaction are biotinylated.

For González-Prieto, the key takeaway from the research is “the straightforwardness of the method and its applicability to study protein interactions in the genome and proteins that have been modified by ubiquitin-like modifications, which is, in most cases, not possible with antibodies.”

As for the future of the technology, he concluded: “I think what is next [for PLAMseq] is to exploit it to answer research questions that had no suitable method before.”

Da:

https://www.biotechniques.com/proteomics/introducing-plamseq-new-sequencing-method-transforms-proteogenomic-characterization/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Tech%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-87-Poe5k8dkaF-2D5fowtSW2aNbrzgwvvv2CxFe3PBpjq33vVYDEes5Aong0Z_C1suC8YzS0P8cCb4xa0JN4SnLhHdq9Z2XOYg7opzS6V3dCOSNVY&_hsmi=411569093&utm_content=411512400&utm_source=hs_email