La mappatura delle varianti genetiche rivela una nuova condizione neuroevolutiva / Mapping Gene Variants Reveals New Neurodevelopmental Condition
La mappatura delle varianti genetiche rivela una nuova condizione neuroevolutiva / Mapping Gene Variants Reveals New Neurodevelopmental Condition
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Definire in che modo le variazioni genetiche causino malattie ed in che misura contribuiscano alla patogenesi di tali malattie è stato storicamente difficile.
Mappando tutte le possibili varianti di un singolo gene, i ricercatori hanno scoperto una condizione neurosviluppale precedentemente sconosciuta.
Sindrome RNU4-2 e ReNU
La sindrome ReNU è una rara malattia neurosviluppale ereditaria, identificata nel 2024, che colpisce le funzioni cerebrali, lo sviluppo e le capacità motorie e si prevede che interesserà decine di migliaia di persone in tutto il mondo.
Il professor Nicky Whiffin ed i suoi colleghi hanno scoperto che le mutazioni a carico di un gene non codificante per proteine, RNU4-2, che codifica per un componente di RNA dello spliceosoma, causano la sindrome ReNU.
Hanno identificato una regione di 18 paia di basi del gene RNU4-2 che conteneva diverse mutazioni distinte legate alla sindrome di ReNU, sebbene i dati della UK Biobank indicassero che molte altre varianti di RNU4-2 si verificano in persone non affette da sindrome di ReNU.
Per comprendere lo spettro delle mutazioni dannose e potenzialmente identificare ulteriori varianti patogene, i ricercatori si sono rivolti alla genomica funzionale.
Modifica genomica satura
Un nuovo metodo, chiamato editing genomico di saturazione (SGE), è stato sviluppato dal dottor Greg Findlay e consente di mappare ogni singola variante in un dato gene al fine di identificarne l'impatto funzionale e clinico.
"L'editing genomico di saturazione utilizza uno strumento molecolare chiamato CRISPR che ci permette di riscrivere il DNA nel genoma umano", ha spiegato Findlay a Technology Networks. "Questo ci offre un modo per testare le varianti genetiche e vedere quali effetti hanno sulle cellule umane in laboratorio."
"La particolarità di SGE è che ci permette di testare centinaia di varianti per esperimento, tutte contemporaneamente", ha affermato. I geni umani sono costituiti da centinaia o migliaia di basi di DNA e SGE testa sistematicamente le varianti in ogni singola base. Eliminando la necessità di selezionare poche varianti da studiare, SGE consente di testare le varianti su larga scala ed aiuta ad interpretare le varianti di significato incerto.
Sebbene la tecnica SGE sia stata applicata a numerosi geni codificanti proteine, il lavoro su RNU4-2 ha rappresentato la prima applicazione di questa tecnica ad un gene non codificante.
Comprendere le mutazioni dei geni non codificanti
"In genere, si sa molto meno sui geni non codificanti", ha osservato Findlay. "Poiché i geni non codificanti non producono proteine, può essere più difficile prevedere in che modo le varianti possano influenzarne la funzione."
I geni non codificanti non vengono sequenziati frequentemente nei flussi di lavoro diagnostici come il sequenziamento dell'esoma, il che significa che sono disponibili meno informazioni sulle mutazioni che si verificano in questi geni nelle persone.
Cosa ha reso RNU4-2 un caso particolarmente interessante per testare l'analisi SGE su un gene non codificante? "Un numero relativamente elevato di casi di malattie neurosviluppali era attribuibile ad un numero molto ristretto di varianti al centro del gene", ha spiegato Findlay. "Eravamo curiosi di sapere se anche altre varianti all'interno del gene potessero causare la malattia, soprattutto considerando che le varianti in RNU4-2 sono relativamente comuni nella popolazione generale."
Il dottor Joachim De Jonghe, ex ricercatore post-dottorato nel gruppo di Findlay, ha introdotto oltre 500 diverse varianti a singolo nucleotide del gene RNU4-2 in cellule umane, utilizzando una versione leggermente modificata di SGE. Alle varianti è stato assegnato un punteggio funzionale SGE in base al loro impatto sulla vitalità cellulare.
"Volevamo capire con precisione quali delle 539 varianti che abbiamo testato in RNU4-2 causassero effettivamente la sindrome di ReNU e quali fossero benigne", ha affermato Findlay. Comprendere la relazione genotipo-fenotipo potrebbe anche fornire nuove informazioni sul perché alcune varianti causino una malattia più grave.
Tuttavia, RNU4-2 ha presentato alcune sfide uniche per SGE. " Nel genoma umano sono presenti molte sequenze simili a RNU4-2 , quindi è stato difficile per noi progettare esperimenti CRISPR per manipolare specificamente solo RNU4-2 e non altri geni", ha spiegato Findlay.
Risultati promettenti ma sconcertanti
I risultati dell'analisi SGE di RNU4-2 "sembravano molto promettenti, ma anche un po' enigmatici", ha affermato Findlay.
I punteggi di funzionalità SGE per le varianti nella regione di 18 paia di basi identificate da Whiffin erano strettamente correlati alla gravità fenotipica, ma Findlay e De Jonghe hanno identificato un ulteriore insieme di mutazioni al di fuori di questa regione che compromettevano anch'esse la funzione genica.
"Tutte le varianti note per causare la sindrome di ReNU che abbiamo testato hanno avuto effetti significativi nell'esperimento, il che ci ha confermato che il metodo funzionava, in sostanza", ha spiegato Findlay. "Ma abbiamo anche trovato molte varianti che hanno avuto effetti rilevanti in nuove regioni di RNU4-2 che non erano ancora state collegate alla malattia."
Una forma recessiva della sindrome ReNU
Whiffin ha coordinato una ricerca in banche dati genetiche di pazienti con casi irrisolti di malattie neurosviluppali in tutto il mondo per identificare individui con due varianti del gene RNU4-2.
"Abbiamo subito individuato uno schema negli individui che presentavano due varianti con effetti significativi nell'esperimento, una su ciascuna copia del gene RNU4-2 ", ha affermato Findlay. "Tutti questi individui, circa 20 in totale, presentavano un disturbo neuroevolutivo di origine sconosciuta."
«Sapevamo di aver scoperto la forma recessiva della malattia.» — Dr. Greg Findlay
In seguito alla scoperta della sindrome recessiva ReNU, a 38 individui è stata diagnosticata la condizione.
Sebbene la sindrome di ReNU recessiva condivida alcune caratteristiche con la sindrome di ReNU dominante, colpisce la sostanza bianca del cervello in modo diverso, una differenza che può essere evidenziata tramite risonanza magnetica .
"Tutte le varianti note per causare la sindrome di ReNU che abbiamo testato hanno avuto effetti significativi nell'esperimento, il che ci ha confermato che il metodo funzionava, in sostanza", ha spiegato Findlay. "Ma abbiamo anche trovato molte varianti che hanno avuto effetti rilevanti in nuove regioni di RNU4-2 che non erano ancora state collegate alla malattia."
Una forma recessiva della sindrome ReNU
Whiffin ha coordinato una ricerca in banche dati genetiche di pazienti con casi irrisolti di malattie neurosviluppali in tutto il mondo per identificare individui con due varianti del gene RNU4-2 .
"Abbiamo subito individuato uno schema negli individui che presentavano due varianti con effetti significativi nell'esperimento, una su ciascuna copia del gene RNU4-2 ", ha affermato Findlay. "Tutti questi individui, circa 20 in totale, presentavano un disturbo neuroevolutivo di origine sconosciuta."
«Sapevamo di aver scoperto la forma recessiva della malattia.» — Dr. Greg Findlay
In seguito alla scoperta della sindrome recessiva ReNU, a 38 individui è stata diagnosticata la condizione.
Sebbene la sindrome di ReNU recessiva condivida alcune caratteristiche con la sindrome di ReNU dominante, colpisce la sostanza bianca del cervello in modo diverso, una differenza che può essere evidenziata tramite risonanza magnetica.
I ricercatori hanno inoltre scoperto che i trascritti di RNU4-2 erano ridotti nella sindrome ReNU recessiva, suggerendo un meccanismo patogenetico di perdita di funzione distinto da quello della sindrome ReNU dominante.
Impatto sulla genetica clinica
I dati SGE relativi a RNU4-2 saranno fondamentali per la diagnosi di pazienti affetti da disturbi dello sviluppo neurologico attualmente inspiegabili e per la potenziale modifica del percorso terapeutico.
"Per RNU4-2 , come per altri geni, i dati SGE aiuteranno i gruppi clinici a decidere se una variante rara in un paziente possa effettivamente causare la malattia", ha spiegato Findlay. "Spesso, i dati funzionali sono fondamentali per orientare questa valutazione, fornendo sufficiente certezza per formulare una diagnosi formale."
"Inoltre, conoscere la causa molecolare della malattia di ciascun paziente fornisce un punto di partenza per lo sviluppo di terapie", ha concluso.
ENGLISH
Saturation genome editing has helped to uncover a previously unknown neurodevelopmental condition.
How genetic variations cause disease, and the extent of their contributions to disease pathology, has historically been difficult to define.
By mapping all the possible variations in a single gene, researchers have uncovered a previously hidden neurodevelopmental condition.
RNU4-2 and ReNU syndrome
ReNU syndrome is a rare, inherited neurodevelopmental disorder identified in 2024 that affects brain function, development, and motor skills and is predicted to affect tens of thousands of individuals worldwide.
Mutations to a non-protein-coding gene, RNU4-2, which codes for an RNA component of the spliceosome, were found to cause ReNU syndrome by Prof. Nicky Whiffin and colleagues.
They identified an 18-base pair region of RNU4-2 that held several distinct mutations linked to ReNU syndrome, although UK Biobank data indicated that many other variants in RNU4-2 occur in people without ReNU syndrome.
To understand the spectrum of deleterious mutations and potentially identify additional pathogenic variants, the researchers turned to functional genomics.
Saturation genome editing
A new method, called saturation genome editing (SGE), was developed by Dr. Greg Findlay and enables every single variant in a given gene to be mapped in order to identify its functional and clinical impact.
“Saturation genome editing uses a molecular tool called CRISPR that lets us rewrite DNA in the human genome,” Findlay told Technology Networks. “This gives us a way to test genetic variants to see what effects they have on human cells in the lab.”
“What’s special about SGE is that we can test hundreds of variants per experiment, all at once,” he said. Human genes consist of hundreds to thousands of DNA bases, and SGE systematically tests variants at each base. By removing the need to select a few variants for study, SGE enables variant testing at scale and helps to interpret variants of uncertain significance.
While SGE has been performed across numerous protein-coding genes, the work on RNU4-2 was the first time it had been used on a non-coding gene.
Understanding mutations to non-coding genes
“Typically, a lot less is known about non-coding genes,” noted Findlay. “Because non-coding genes do not make proteins, it can be more difficult to predict how variants may impact their function.”
Non-coding genes are also not frequently sequenced in diagnostic workflows like exome sequencing, meaning there is less information available about the mutations that occur in these genes in people.
What made RNU4-2 a compelling case to test SGE on a non-coding gene? “A relatively large number of neurodevelopmental disease cases were attributable to a very small number of variants at the center of the gene,” explained Findlay. “We were curious whether variants elsewhere in the gene may also cause disease, especially as variants in RNU4-2 are relatively common in the general population.”
Dr. Joachim De Jonghe, a former postdoc in Findlay’s team, installed over 500 different single-nucleotide RNU4-2 variants in human cells, using a slightly modified version of SGE. Variants were assigned an SGE function score based on how they impacted cell fitness.
“We wanted to understand precisely which of the 539 variants we tested in RNU4-2 actually caused ReNU syndrome, and which were benign,” said Findlay. Understanding the genotype–phenotype relationship could also provide new insights about why certain variants cause more severe disease.
However, RNU4-2 presented some unique challenges for SGE. “There are many similar sequences to RNU4-2 in the human genome, so it was difficult for us to design CRISPR experiments to specifically manipulate only RNU4-2 and not any of the other genes,” explained Findlay.
Promising but puzzling results
The results of the SGE analysis of RNU4-2 “looked very promising but also a little puzzling,” said Findlay.
The SGE function scores for variants in the 18-base pair region identified by Whiffin closely correlated with phenotypic severity, but Findlay and De Jonghe identified a further set of mutations outside of this region that also impaired gene function.
“All variants known to cause ReNU syndrome that we tested had strong effects in the experiment, telling us the method was working, essentially,” explained Findlay. “But we also found many variants that had strong effects in new regions of RNU4-2 that hadn’t yet been linked to disease.”
A recessive form of ReNU syndrome
Whiffin coordinated a search of genetic databases of patients with unsolved neurodevelopmental disease cases across the globe to identify individuals with two variants to the RNU4-2 gene.
“We quickly saw a pattern in individuals who had two variants with strong effects in the experiment, one on each copy of their RNU4-2 gene,” said Findlay. “All such individuals, about 20 in total, had an unexplained neurodevelopmental disorder.”
“We knew we had discovered the recessive form of the disease.” — Dr. Greg Findlay
Following the discovery of recessive ReNU syndrome, 38 individuals were diagnosed with the condition.
While recessive ReNU syndrome shares some of the features of dominant ReNU syndrome, it impacts the white matter of the brain differently, which can be distinguished by magnetic resonance imaging.
The researchers also found that RNU4-2 transcripts were reduced in recessive ReNU syndrome, suggesting a loss-of-function disease mechanism distinct from dominant ReNU syndrome.
Impact on clinical genetics
SGE data for RNU4-2 will be critical for diagnosing patients with currently unexplained neurodevelopmental disorders and potentially altering the course of their care.
“For RNU4-2, like other genes, the SGE data will help clinical teams decide whether a rare variant in a patient may actually be causing disease,” explained Findlay. “Often, functional data is critical for tipping this assessment, providing enough certainty to make a formal diagnosis.”
“Further, knowing the molecular cause of each patient’s disease provides a starting place for therapy development,” he concluded.
Da:
https://www.technologynetworks.com/genomics/news/mapping-gene-variants-reveals-new-neurodevelopmental-condition-412229?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Breaking%20Science%20News&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz--HHd72ZSoZZOWwQbGCtSdYnZaburLVOQ4MjhLUBo_8WzQNb-zg0GcBlRB_4y3vagj9_G1D5bbh6bMVR1CflgW4ISXnO060A_BJJXH_5xO7CqCKTrg&_hsmi=417875099&utm_content=417875099&utm_source=hs_email
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