Una comprensione ad altissima risoluzione delle dinamiche della cromatina nelle cellule viventi / A super-resolution understanding of chromatin dynamics in living cells

Una comprensione ad altissima risoluzione delle dinamiche della cromatina nelle cellule viventi / A super-resolution understanding of chromatin dynamics in living cells

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Monitorando le strutture cromosomiche su diverse scale temporali, i ricercatori del MIT hanno scoperto che la cromatina contribuisce ad avvicinare i geni ai loro elementi regolatori.

L'espressione genica è controllata, in parte, dalle interazioni tra i geni e gli elementi regolatori situati lungo il genoma. Tali interazioni dipendono dalla capacità della cromatina, una miscela di DNA e proteine, di muoversi all'interno di uno spazio affollato.

In un nuovo studio, i ricercatori del MIT (MA, USA) hanno misurato il movimento della cromatina su scale temporali che vanno da centinaia di microsecondi ad ore, consentendo loro di quantificare rigorosamente tali dinamiche per la prima volta.

La loro analisi ha rivelato che la cromatina può esistere in due diverse categorie. In una, la cromatina si muove in modo vincolato, il che le consente di entrare in contatto principalmente solo con le regioni vicine del genoma; nell'altra, la cromatina si muove più liberamente ed entra in contatto con regioni più distanti, ma solo su scale temporali più lunghe.

Secondo i ricercatori, i risultati offrono spunti di riflessione su come viene regolata l'espressione genica e su come i segmenti di cromatina si uniscono per altri processi, come la riparazione del DNA.

"Grazie alla possibilità di osservare per la prima volta le dinamiche della cromatina su scale temporali così rapide, ed anche per la prima volta sull'intera gamma dinamica, siamo stati in grado di osservare il movimento della cromatina su un intervallo che prima non era possibile", ha commentato Anders Sejr Hansen, professore associato di ingegneria biologica al MIT ed autore senior del nuovo studio.

Monitorando le strutture cromosomiche su diverse scale temporali, i ricercatori del MIT hanno scoperto che la cromatina contribuisce ad avvicinare i geni ai loro elementi regolatori.

L'espressione genica è controllata, in parte, dalle interazioni tra i geni e gli elementi regolatori situati lungo il genoma. Tali interazioni dipendono dalla capacità della cromatina, una miscela di DNA e proteine, di muoversi all'interno di uno spazio affollato.

In un nuovo studio, i ricercatori del MIT (MA, USA) hanno misurato il movimento della cromatina su scale temporali che vanno da centinaia di microsecondi a ore, consentendo loro di quantificare rigorosamente tali dinamiche per la prima volta.

La loro analisi ha rivelato che la cromatina può esistere in due diverse categorie. In una, la cromatina si muove in modo vincolato, il che le consente di entrare in contatto principalmente solo con le regioni vicine del genoma; nell'altra, la cromatina si muove più liberamente e entra in contatto con regioni più distanti, ma solo su scale temporali più lunghe.

Secondo i ricercatori, i risultati offrono spunti di riflessione su come viene regolata l'espressione genica e su come i segmenti di cromatina si uniscono per altri processi, come la riparazione del DNA.

"Grazie alla possibilità di osservare per la prima volta le dinamiche della cromatina su scale temporali così rapide, ed anche per la prima volta sull'intera gamma dinamica, siamo stati in grado di osservare il movimento della cromatina su un intervallo che prima non era possibile", ha commentato Anders Sejr Hansen, professore associato di ingegneria biologica al MIT ed autore senior del nuovo studio.

Movimento limitato

Nei libri di testo, la cromatina viene spesso raffigurata come una struttura statica all'interno del nucleo cellulare, ma in realtà è in costante movimento. Questi movimenti sono necessari affinché i geni interagiscano con le sequenze regolatrici del DNA, come gli enhancer, che possono trovarsi ad una distanza di anche un milione di paia di basi. Inoltre, assicurano che, in caso di rotture del DNA, le due estremità possano incontrarsi per essere riparate.

"Le dinamiche della cromatina sono fondamentali per tutti i processi che avvengono nel nucleo, ed in particolare per quelli che implicano l'incontro tra due elementi. Questo è importante per la riparazione del DNA, la regolazione genica, la ricombinazione o lo spostamento di un gene specifico nel compartimento corretto del nucleo", ha spiegato Hansen.

Il movimento di una qualsiasi posizione sul genoma, o locus, è vincolato dal fatto che il DNA è un polimero. Dopo essersi spostato in una qualsiasi direzione, un locus verrà richiamato indietro dal DNA su entrambi i lati.

«I cromosomi sono polimeri. Sono tenuti insieme da molti nucleotidi di DNA. Far parte del DNA è un po' come correre tenendosi per mano con altre persone. Se cento persone si tengono per mano e tu, che sei nel mezzo della catena, provi a correre in una direzione, verrai tirato indietro», ha commentato Hansen.

Questo tipo di comportamento è noto come movimento subdiffusivo. Studi precedenti hanno prodotto risultati contrastanti sulla subdiffusione della cromatina, principalmente perché non sono stati in grado di monitorare il movimento per un periodo di tempo sufficientemente lungo da ottenere misurazioni statisticamente significative. Poiché i movimenti sono così piccoli, dell'ordine dei nanometri, è necessario acquisire dati su intervalli dinamici lunghi, dai millisecondi alle ore.

In quegli studi precedenti, i ricercatori utilizzavano tecniche di imaging in grado di tracciare la posizione di una singola molecola nel tempo confrontando le immagini fotogramma per fotogramma. Queste tecniche sono utili, ma possono essere utilizzate solo in un intervallo dinamico ristretto a causa dei limiti della microscopia convenzionale.

Per generare dati statisticamente più robusti, il gruppo del MIT ha utilizzato MINFLUX, una tecnica di microscopia ottica a super risoluzione in grado di tracciare il movimento di oggetti minuscoli come le proteine ​​per periodi di tempo prolungati. Questa tecnica è stata recentemente sviluppata da Stefan Hell del Max Planck Institute (Göttingen, Germania), premio Nobel per il suo lavoro nel campo della microscopia a super risoluzione. In questo studio, il gruppo del MIT è stato il primo ad applicare questa tecnica alla cromatina nelle cellule viventi.

"MINFLUX ci ha permesso di superare i limiti della microscopia convenzionale, consentendoci di misurare il movimento della cromatina più velocemente e per un periodo di tempo più lungo che mai", ha affermato Domenic Narducci, coautore principale dello studio. "A nostra conoscenza, è la prima volta che questa tecnica viene utilizzata in questo modo."

Grazie a MINFLUX, i ricercatori sono stati in grado di studiare le cellule su scale temporali che coprivano quattro ordini di grandezza, da 200 microsecondi a 10 secondi. Inoltre, combinando MINFLUX con due tecniche di imaging tradizionali, hanno potuto tracciare il movimento della cromatina su sette ordini di grandezza nel tempo, da centinaia di microsecondi a diverse ore.

'Regione di influenza'

Questi studi, condotti su diversi tipi di cellule di topo e umane, hanno permesso ai ricercatori di identificare due classi distinte di dinamiche della cromatina. In entrambe le classi, su scale temporali brevi e intermedie (fino a 200 secondi), ogni singolo locus tende a spostarsi di soli 200 nanometri circa. Ciò suggerisce che la forza di attrazione subdiffusiva sia più forte di quanto si pensasse in precedenza.

"Uno dei punti chiave è che esiste una regione di influenza in cui un locus genomico ha accesso ad altri loci genomici, e questa regione ha un'estensione di circa un paio di centinaia di nanometri", ha spiegato Simon Grosse-Holz, coautore principale dello studio. "Se i loci sono molto più vicini di un paio di centinaia di nanometri, sono di fatto in contatto costante. Si crea un limite di un paio di centinaia di nanometri oltre il quale tutto ciò che si trova all'interno di quella regione attorno ad un dato locus può vedere quel locus, mentre tutto ciò che si trova all'esterno non può".

Questo contatto costante è probabilmente benefico per la riparazione del DNA, poiché i filamenti rotti rimangono in stretta prossimità tra loro. I risultati suggeriscono inoltre che, per i geni e gli elementi regolatori che si trovano entro circa 100.000 paia di basi, non è necessario alcun aiuto aggiuntivo per ritrovarsi, poiché ciò avviene di routine attraverso il loro normale movimento.

"Se la distanza tra le basi è inferiore a 100.000, come accade per la maggior parte degli elementi regolatori, allora questi elementi troveranno il gene bersaglio in pochi millisecondi o pochi minuti", ha spiegato Matteo Mazzocca, coautore principale dello studio. "Si tratta di tempistiche perfettamente compatibili con la trascrizione".

Nell'altra classe di dinamiche della cromatina identificata dai ricercatori, la cromatina è in grado di muoversi su una gamma più ampia, ma solo su scale temporali più lunghe (da pochi minuti a ore). Questa classe di cromatina è stata riscontrata in alcuni tipi di cellule ma non in altri, per ragioni che non sono ancora state comprese.

"Sarebbe ragionevole supporre che il comportamento sia più o meno lo stesso in tutti i tipi di cellule, ma non è affatto quello che abbiamo riscontrato", ha commentato Hansen. "È molto diverso nei diversi tipi di cellule, e non c'è un modo ovvio per classificarli."

Ha aggiunto che la forza dell'attrazione subdiffusiva riscontrata dai ricercatori in questo studio non può essere spiegata con i modelli esistenti sviluppati per studiare la dinamica della cromatina: il modello di Rouse e il modello del globulo frattale. Ciò suggerisce che i modelli potrebbero dover includere fattori precedentemente trascurati, come le interazioni tra la cromatina ed il nucleoplasma densamente popolato in cui è immersa.

ENGLISH

Gene expression is controlled, in part, by the interactions between genes and regulatory elements located along the genome. Those interactions depend on the ability of chromatin, a mix of DNA and proteins, to move around within a crowded space.

In a new study, MIT (MA, USA) researchers have measured chromatin movement at timescales ranging from hundreds of microseconds to hours, allowing them to rigorously quantify those dynamics for the first time.

Their analysis revealed that chromatin can exist in two different categories. In one, chromatin moves in a constrained way that allows it to primarily contact only neighboring regions of the genome; in the other, chromatin moves more freely and contacts regions that are farther away, but only over longer timescales.

The findings offer insight into how gene expression is regulated, as well as how chromatin segments come together for other processes such as DNA repair, the researchers say.

“Because we were able to look at chromatin dynamics for the first time at these very fast timescales, and also for the first time across the full dynamic range, we were able to observe chromatin motion over a range that just wasn’t possible before,” commented Anders Sejr Hansen, an associate professor of biological engineering at MIT and the senior author of the new study.

Constrained movement

In textbooks, chromatin is often depicted as a static structure within the cell nucleus, but in reality, it is constantly moving. Those movements are necessary for genes to interact with DNA regulatory sequences such as enhancers, which can be as far as 1 million base pairs away. They also ensure that when DNA breaks occur, the two ends of DNA can encounter each other to be repaired.

“Chromatin dynamics are foundational to all processes in the nucleus, and especially processes that involve two things finding each other. That’s important in DNA repair, gene regulation, recombination, or moving a particular gene to the right compartment of the nucleus,” Hansen explained.

The movement of any particular location on the genome, or locus, is constrained by the fact that DNA is a polymer. After moving in any direction, a locus will be pulled back by the DNA on either side of it.

“Chromosomes are polymers. They’re held together by many nucleotides of DNA. Being part of DNA is a little bit like running while holding hands with other people. If a hundred people are holding hands and you, in the middle of the chain, try to run in one direction, you’ll get pulled back,” Hansen commented.

This type of behavior is known as subdiffusive movement. Previous studies have yielded conflicting reports on how subdiffusive chromatin is, mainly because the studies were not able to track the movement over a long enough period of time to obtain statistically robust measurements. Because the movements are so small, on the order of nanometers, data needs to be obtained over long dynamic ranges – from milliseconds to hours.

In those earlier studies, researchers used imaging techniques that can track the position of a single molecule over time by comparing images frame by frame. These are useful but can only be used over a small dynamic range because of the limitations of conventional microscopy.

To generate more statistically robust data, the MIT team used MINFLUX – a super-resolution light microscopy technique that can track the movement of tiny objects such as proteins over longer periods of time. This technique was recently developed by Stefan Hell of the Max Planck Institute (Göttingen, Germany), a Nobel laureate for his work in super resolution microscopy. In this study, the MIT team became the first to apply this technique to chromatin in living cells.

“MINFLUX allowed us to get around the limitations of conventional microscopy, letting us measure chromatin movement faster and for a longer period of time than ever before,” co-lead author Domenic Narducci shared. “To our knowledge, it’s the first time this technique has been used this way.”

Using MINFLUX, the researchers were able to study cells over timescales that covered four orders of magnitude – from 200 microseconds to 10 seconds. And by combining MINFLUX with two traditional imaging techniques, they could track chromatin movement over seven orders of magnitude across time, from hundreds of microseconds to several hours.

‘Region of influence’

These studies, performed across several different mouse and human cell types, allowed the researchers to identify two distinct classes of chromatin dynamics. In both classes, over short and intermediate timescales (up to 200 seconds), any given locus tends to move only within about 200 nanometers. This suggests that the subdiffusive pull is stronger than had been previously thought.

“One of the main takeaways is that you have this region of influence where a genomic locus has access to other genomic loci, and this is roughly a couple hundred nanometers large,” co-lead author Simon Grosse-Holz explained. “If loci are much closer together than a couple hundred nanometers, they’re effectively in contact all the time. You get a cutoff at a couple hundred nanometers where everything within that region around a given locus can see that locus, and everything outside cannot.”

This constant contact is likely beneficial for DNA repair, as the broken strands remain in close proximity to each other. The findings also suggest that for genes and regulatory elements that are within about 100,000 base pairs, they don’t need any extra help to find each other, they will do so routinely through their normal movement.

“If they are closer than 100,000 bases, and most regulatory elements are, then those elements are going to find their target gene within a few milliseconds or a few minutes,” co-lead author Matteo Mazzocca shared. “These are timescales that are completely consistent with transcription.”

In the other class of chromatin dynamics that the researchers identified, chromatin is able to move over a wider range, but only at longer timescales (a few minutes to hours). This class of chromatin appeared in some types of cells but not others, for reasons that are not yet understood.

“It would be reasonable to assume that the behavior would be more or less the same in all cell types, but that’s not at all what we found,” Hansen commented. “It’s very different in different cell types, with no obvious way of categorizing things.”

He added that the strength of the subdiffusive pull that the researchers found in this study can’t be explained with existing models that have been developed to study chromatin dynamics: the Rouse model and the fractal globule model. This suggests that the models may need to incorporate factors that were previously left out, such as the interactions between chromatin and the crowded nucleoplasm it sits within.

Da:

https://www.biotechniques.com/imaging/a-super-resolution-understanding-of-chromatin-dynamics-in-living-cells/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Daily%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz--YazbbYbg91ulmb3ZzzilZOU8YOhQfp0nmGj3Z9sfBDrLd6epUirr8vgG3pwtirEZkUlyiNPTouQJsxki_piR0sbRB7VaAVoK5vOJP1qS3_4FqY3c&_hsmi=417745637&utm_content=417673038&utm_source=hs_email