Una luce in fondo al tunnel per il trattamento della malattia di Huntington / A light at the end of the tunnel for Huntington’s disease treatment

Una luce in fondo al tunnel per il trattamento della malattia di Huntington / A light at the end of the tunnel for Huntington’s disease treatment

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Una nuova ricerca rivela come minuscoli "tunnel" permettano alla proteina huntingtina mutata di diffondersi tra i neuroni, cambiando la nostra comprensione della progressione della malattia di Huntington ed offrendo un promettente bersaglio terapeutico.

Riaccendendo le speranze di una cura per la malattia di Huntington, un gruppo di scienziati della Florida Atlantic University (Florida, USA) ha identificato una nuova via cellulare che permette alle cellule cerebrali di trasmettere materiale tossico, come la proteina responsabile della malattia di Huntington, alle cellule vicine attraverso minuscole strutture tubulari. Aspetto cruciale, i ricercatori hanno anche dimostrato che interrompere questo processo riduce drasticamente la diffusione della proteina responsabile della malattia nel cervello, aprendo potenzialmente la strada a nuove terapie.

La malattia di Huntington è caratterizzata dalla diffusione della proteina huntingtina mutata (mHTT) tra le cellule cerebrali. Questo può avvenire tramite nanotubi di tunneling (TNT), sottili strutture membranose a base di actina che formano ponti citoplasmatici tra le cellule. I ricercatori avevano precedentemente identificato una proteina chiamata Rhes come regolatore chiave della formazione dei nanotubi e della trasmissione della mHTT; tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questo processo rimangono sconosciuti.

Nella speranza di cambiare questa situazione, il gruppo ha eseguito un'analisi imparziale di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per identificare il sensore di pH intracellulare Slc4a7 come partner chiave di legame alla membrana di Rhes, responsabile della regolazione della formazione di TNT e della trasmissione di mHTT.

Inizialmente, per valutare il ruolo di Rhes nella formazione di TNT, hanno generato linee cellulari che esprimevano la proteina fluorescente verde (EGFP) o EGFP-Rhes utilizzando vettori lentivirali in cellule neuronali striatali di topo. Queste sono state poi utilizzate per stabilire un'espressione stabile di EGFP o EGFP-Rhes in cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y ed in cellule staminali pluripotenti indotte umane affette dalla malattia di Huntington. Come previsto, GFP-Rhes ha indotto fortemente la formazione di strutture simili a TNT.

Hanno quindi proceduto ad identificare le proteine ​​interagenti con Rhes associate alla membrana trasfettando cellule neuronali striatali con EGFP, EGFP-Rhes o EGFP-Rhes C263S (un mutante con deficit di legame alla membrana) ed eseguendo un frazionamento biochimico della membrana. Le frazioni sono state sottoposte a immunoprecipitazione per isolare selettivamente le proteine ​​marcate con GFP, che sono state poi analizzate mediante LC-MS/MS per individuare le proteine ​​che interagiscono con Rhes associato alla membrana.

Questo processo ha identificato 188 proteine, tra cui Slc4a7 è emersa come un candidato promettente. Ciò è stato confermato da studi di screening con siRNA (small interfering RNA) e di silenziamento genico, che hanno rivelato che l'inibizione di Slc4a7 riduceva sostanzialmente la formazione di TNT indotta da Rhes e sopprimeva il trasferimento intercellulare di mHTT.

Utilizzando diverse tecniche avanzate di mappatura proteica, il gruppo è stato anche in grado di descrivere il meccanismo di questa interazione. Hanno scoperto che Rhes interagisce direttamente con Slc4a7 attraverso i suoi domini ammino- e carbossi-terminali e modula il pH intracellulare per facilitare la formazione di TNT.

Inoltre, esperimenti in vivo su topi privi del gene Slc4a7 hanno rivelato che la trasmissione intercellulare di mHTT nello striato – la parte del cervello maggiormente colpita dalla malattia di Huntington – è notevolmente ridotta, suggerendo Slc4a7 come potenziale bersaglio terapeutico per limitare la diffusione della malattia.

"Questo lavoro cambia radicalmente il nostro modo di pensare alla progressione della malattia di Huntington", ha affermato Srinivasa Subramaniam, autore senior dello studio.

"Imparando come le proteine ​​dannose si spostano fisicamente da una cellula all'altra, otteniamo nuovi e potenti strumenti terapeutici", ha aggiunto Randy Blakely, direttore esecutivo dello Stiles-Nicholson Brain Institute della Florida Atlantic University , che non ha partecipato allo studio. "L'idea di poter rallentare od addirittura arrestare la progressione della malattia bloccando questi tunnel microscopici apre una frontiera entusiasmante per il trattamento non solo della malattia di Huntington, ma anche di una vasta gamma di disturbi neurologici e tumori in futuro".

ENGLISH

New research reveals how tiny ‘tunnels’ allow mutant huntingtin protein to spread between neurons, changing our understanding of Huntington’s disease progression and offering a promising therapeutic target.

Sparking fresh hope for a Huntington’s disease treatment, a team led by scientists from Florida Atlantic University (FL, USA) has identified a novel cellular pathway that allows brain cells to pass toxic material, such as the protein responsible for Huntington’s, to their neighbors via tiny, tube-like structures. Crucially, the researchers also demonstrate that disrupting this process dramatically reduces the spread of the disease-causing protein in the brain, potentially paving the way for novel therapeutics.

Huntington’s disease is characterized by the spread of the mutant huntingtin protein (mHTT) between brain cells. This can occur via tunneling nanotubes (TNT) – thin, actin-based membranous structures that form cytoplasmic bridges between cells. The researchers previously identified a protein called Rhes as a key regulator of nanotube formation and mHTT transmission; however, the molecular mechanisms underlying this process remain unknown.

With hopes of changing that, the team performed unbiased liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis to identify the intracellular pH sensor Slc4a7 as a key membrane-binding partner of Rhes, responsible for regulating TNT formation and mHTT transmission.

Initially, to assess the role of Rhes in TNT formation, they generated cell lines expressing green fluorescent protein (EGFP) or EGFP-Rhes using lentiviral vectors in mouse striatal neuronal cells. These were then used to establish stable EGFP or EGFP-Rhes expression in human SH-SY5Y neuroblastoma cells and Huntington’s disease human induced pluripotent stem cells. As suspected, GFP-Rhes strongly induced TNT-like structures.

They then went on to identify membrane-associated protein interactors of Rhes by transfecting striatal neuronal cells with EGFP, EGFP-Rhes or EGFP-Rhes C263S (a membrane binding–deficient mutant) and performing biochemical membrane fractionation. Fractions were subjected to immunoprecipitation to selectively isolate GFP-tagged proteins, which then underwent LC-MS/MS to uncover proteins interacting with membrane-associated Rhes.

This process identified 188 proteins, from which Slc4a7 emerged as a promising candidate. This was confirmed by siRNA (small interfering RNA) screening and knockdown studies, which revealed that inhibition of Slc4a7 substantially decreased Rhes-induced TNT formation and suppressed mHTT intercellular transfer.

Using various advanced protein-mapping techniques, the team was also able to describe the mechanism of this interaction. They discovered that Rhes directly interacts with Slc4a7 through its amino- and carboxyl-terminal domains and modulates intracellular pH to facilitate TNT formation.

Moreover, in vivo experiments in Slc4a7 knock-out mice revealed that cell-to-cell transmission of mHTT in the striatum – the part of the brain most affected by Huntington’s disease – is markedly reduced, suggesting Slc4a7 as a potential therapeutic target to limit disease spread.

“This work fundamentally changes how we think about disease progression in Huntington’s,” stated Srinivasa Subramaniam, senior author of the study.

“By learning how harmful proteins physically move from cell to cell, we gain powerful new leverage points for therapy,” added Randy Blakely, executive director of Florida Atlantic University’s Stiles-Nicholson Brain Institute, who was not involved in the study. “The idea that we could slow or even halt disease progression by blocking these microscopic tunnels opens an exciting frontier for treating not only Huntington’s disease, but a wide range of neurological disorders and cancers in the future.”

Da:

https://www.biotechniques.com/neuroscience/a-light-at-the-end-of-the-tunnel-for-huntingtons-disease-treatment/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Tech%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-_7dLuB5IKTyidYKeHW1UE09bSxljuFJep-CkPS2KjteJy_K1cFNYcpYvGxVZfAOwZNhsFH1Js4N2qNwnQhofbUNN-4a6PCAovg0NOvpLwBHdlQefw&_hsmi=420591354&utm_content=420590766&utm_source=hs_email