Vettori per la terapia genica / Vectors for gene therapy.
Vettori per la terapia genica / Vectors for gene therapy.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Joseph Cotellessa
La parte decisiva della terapia genica consiste nel metodo da adottare per effettuare il trasferimento del gene terapeutico (trasfezione). Questa tecnica si basa sull'utilizzo di vettori che veicolino il materiale genetico all'interno delle cellule. Vengono attualmente distinti in virali e non virali.
I vettori virali
Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. Il virus viene reso difettivo, cioè incapace di riprodursi autonomamente per evitare la diffusione di virus ricombinanti. Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante, e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali ricombinanti (linee di packaging). Queste complementano i difetti introdotti nel genoma.
In linea di massima, il principale vantaggio dei vettori virali consiste nell'elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule). Gli svantaggi invece risiedono nella possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell'ospite, nel rischio di mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) e nell'insorgenza di reazioni immunitarie. Possono poi trasportare generalmente molecole di DNA di dimensioni limitate. Un altro problema sono i costi elevati.
I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono: i retrovirus; i lentivirus; gli adenovirus; i virus adenoassociati; gli herpes simplex virus. Ognuno di questi vettori presenta vantaggi e svantaggi.
Retrovirus
I retrovirus sono stati i primi virus ad essere studiati nella terapia genica, il loro genoma è costituito da un singolo filamento di RNA delle dimensioni di circa 10kb, contenente 3 geni essenziali: gag (codifica per le proteine del core), pol (codifica per la trascrittasi inversa) ed env (codifica per le proteine del capside). A questi si aggiunge una regione y per l'impacchettamento. A ciascuna estremità vi sono le LTR (long terminal repeats) con sequenze implicate nell'integrazione e regioni promotore ed enhancer. Una volta infettata la cellula, attraverso un processo di trascrizione inversa si forma il doppio filamento di DNA che si integra nel genoma della cellula ospite esprimendo così le proteine virali. I retrovirus comunemente usati derivano dal virus della leucemia murina (Mo MLV) che deve essere però opportunamente modificato: i 3 geni essenziali vengono sostituiti col gene di interesse mentre vengono mantenute le sequenze regolatrici; possono essere aggiunti geni marcatori (NEO) e promotori alternativi di origine virale (CMV) o cellulare (beta actina,tirosina).
Vantaggi:
- Non provocano malattie umane.
- Inducono scarsa risposta immunitaria nell'ospite.
- I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite.
- Capacità di infettare efficientemente una vasta gamma di tipi cellulari.
- Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio.
- Alta efficienza di trasduzione.
Svantaggi:
- Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite in molteplici siti.
- Possono subire inattivazione trascrizionale in vivo.
- Infettano solo cellule in attiva divisione.
- Sono difficili da coltivare.
- Basso titolo.
Lentivirus
I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo ma, a differenza dei precedenti, possono infettare anche cellule non replicanti, il che li rende dei buoni candidati per modificare l'espressione delle cellule a differenziazione terminale, come quelle del cuore o del sistema nervoso centrale. Oggi vengono utilizzati lentivirus derivati dal virus HIV opportunamente modificati per garantire la sicurezza del ricevente.
Vantaggi:
- Possono essere somministrati in vivo.
- Non sono inattivati dal complemento.
- Infettano sia cellule in divisione che quiescenti.
- I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite.
- Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio.
Svantaggi:
- Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell'ospite in molteplici siti.
- Possono provocare malattia nell'uomo.
- Sono difficili da coltivare.
Adenovirus
Gli adenovirus, che nell'uomo provocano infezioni del tratto respiratorio, presentano un genoma costituito da un doppio filamento di DNA di circa 35 kb, 30 dei quali possono essere rimpiazzati col gene di interesse. Una volta all'interno della cellula, l'adenovirus non si integra nel genoma ma si replica nel nucleo come un episoma.
Vantaggi:
- Sicuri (non integrano nel genoma).
- Facilmente manipolabili.
- Stabili.
- Si ottengono alti titoli.
- Ampio trofismo.
- Infettano anche cellule quiescenti.
- Possono veicolare inserti di grosse dimensioni (36Kb).
Svantaggi:
- Espressione transiente.
- Alta risposta immunitaria.
Virus adenoassociati
I virus adenoassociati appartengono alla famiglia dei parvovirus, piccoli virus non patogeni per l'uomo, hanno un genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di circa 5 kb e possono infettare cellule proliferanti e non. Per replicarsi autonomamente necessitano però di un altro virus che in genere è un adenovirus o un herpesvirus.
Vantaggi:
- Non sono patogeni per l’uomo.
- Sono stabili.
- Vengono ottenuti con alti titoli.
- Alta efficienza di trasferimento genico.
- Ampio trofismo.
- Infettano sia cellule in divisione che non.
- Integrazione del transgene.
Svantaggi:
- Dimensioni ridotte del transgene (4.7 Kb). Recentemente la capacità di questi vettori è stata aumentata sfruttando concatamerizzazione del genoma dei AAV dopo il traferimento. Si usano due vettori, ciascuno codificante metà della proteina di interesse.
- Vettore ricombinante non ha integrazione sito specifica e talvolta resta episomale.
Herpes simplex virus
Gli herpes simplex virus, grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni latenti nei neuroni, vengono utilizzati per il trasporto di geni nel CNS. L'espressione a lungo termine del transgene viene ottenuta utilizzando dei promotori neurone-specifici, attivati durante il periodo di latenza. Il genoma degli herpes virus è costituito da un doppio filamento di DNA di 152kb, contiene più di 80 geni, la metà dei quali non risulta essenziale per la crescita in cellule di coltura; una volta eliminati tali geni è possibile inserire un transgene di grosse dimensioni (circa 40-50kb).
I vettori non virali
Le metodologie adottate per trasferire il DNA senza ricorrere a virus comprendono: l'iniezione di DNA nudo; l'inserimento tramite liposomi; l'inserimento attraverso l'uso di polimeri cationici; il bombardamento tramite particelle (gene gun).
DNA nudo
L'inserzione di DNA nudo è la procedura più lineare e più semplice ed inoltre permette di trasferire costrutti genici di grandi dimensioni. Consiste nell'iniettare il gene terapeutico, legato ad un plasmide, direttamente nella cellula tramite l'utilizzo d'una micropipetta. Lo svantaggio di questa metodica consiste nel fatto che bisogna iniettare il DNA in ogni cellula, una per una. Il rendimento, inoltre, è decisamente basso.
Liposomi
I liposomi sono vescicole sferiche la cui parete è composta da un doppio strato fosfolipidico. Usando liposomi cationici è possibile far complessare ad essi il DNA, che a pH neutro presenta carica negativa. Il complesso DNA-liposoma può fondersi con la membrana cellulare ma nella maggior parte dei casi viene internalizzato tramite endocitosi. Successivamente il DNA viene liberato nel citoplasma, entra nel nucleo e viene espresso. Sfortunatamente questo processo è a bassa efficienza in quanto si è visto che solo lo 0,1% del DNA introdotto viene espresso. Per ovviare a ciò nei liposomi sono state anche inserite proteine ed anticorpi che possano aumentare l'efficacia della procedura minimizzando la degradazione del DNA e facilitando il corretto direzionamento della vescicola.
Polimeri cationici
Molto simile è la procedura di trasfezione che utilizza polimeri cationici, infatti macromolecole dotate di molteplici cariche positive possono interagire con il DNA, il quale a pH fisiologico è un polianione, provocandone la condensazione e proteggendolo da aggressivi sia chimici che enzimatici, oltre che da radiazioni ionizzanti. Anche i complessi DNA-policatione vengono internalizzati dalla cellula per endocitosi, e possono essere attivamente indirizzati verso specifiche linee cellulari o tessuti utilizzando anticorpi o altre molecole direzionanti.
Bombardamento tramite particelle (gene gun)
Il bombardamento tramite particelle consiste nell'utilizzo di particolari strumenti elettrici o ad alta pressione, dette pistole geniche (gene gun), che permettono di inviare nella cellula particelle microscopiche d'oro o di tungsteno ricoperte di DNA. Al momento non esistono studi sull'uomo di questa metodica ma solo su animali.
ENGLISH
Viral vectors
You are obtained by inserting the gene of interest into the genome of different types of viruses, under the control of a strong promoter. The virus is rendered defective, that is unable to replicate autonomously to prevent the spread of recombinant viruses. The genome is engineered with the techniques of recombinant DNA, and transfected into particular cell lines capable of producing the recombinant viral particles (packaging lines). These complement the defects introduced into the genome.
In principle, the main advantage of viral vectors is the high transduction efficiency (up to 100% of the cells). The disadvantages reside in the possibility to generate new pathogenic viruses for recombination with any viruses present in the host, the risk of insertional mutagenesis (for those that are randomly integrated into the genome) and in the onset of immune reactions. They can then generally carry DNA molecules of limited size. Another problem is the high cost.
The viruses currently studied as vectors for gene therapy are: retroviruses; lentiviruses; adenoviruses; The adeno-associated virus; the herpes simplex virus. Each of these vectors has advantages and disadvantages.
retrovirus
Retroviruses have been the first viruses to be studied in gene therapy, their genome consists of a single strand of RNA of the size of approximately 10kb containing 3 essential genes: gag (coding for core proteins), pol (coding for the reverse transcriptase) and env (coding for the capsid proteins). To these is added a y region for packaging. At each end there are the LTR (long terminal repeats) sequences involved with integration and promoter and enhancer regions. Once infected the cell, through a process of reverse transcription will form the double-stranded DNA which integrates into the genome of the host cell thereby expressing the viral proteins. Retroviruses commonly used are derived from murine leukemia virus (Mo MLV) but it must be suitably modified: the 3 essential genes are replaced with the gene of interest while the regulatory sequences are maintained; They can be added marker genes (NEO) and alternative promoters of viral origin (CMV) or mobile (beta actin, tyrosine).
Advantages:
Do not cause human disease.
Induce poor immune response in the host.
The transgenes can be expressed throughout the host life.
Ability to efficiently infect a wide range of cell types.
Integration of genetic material by the carrier went into the genome of the target cells.
High transduction efficiency.
disadvantages:
Oncogenic potential because they are integrated into the host genome at multiple sites.
They are subject to transcriptional inactivation in vivo.
Only infect cells that are dividing.
They are difficult to cultivate.
Low titer.
lentivirus
Lentiviruses belonging to the retrovirus family of which share morphology and replicative cycle but, unlike the previous ones, can also infect non-replicating cells, which makes them good candidates for modifying the expression of terminal differentiation in cells, such as those of the heart or of the central nervous system. Today they are used by HIV lentivirus derivatives appropriately modified to ensure the safety of the recipient.
Advantages:
They can be administered in vivo.
They are not inactivated by the complement.
Infect both dividing and quiescent cells.
The transgenes can be expressed throughout the host life.
Integration of genetic material by the carrier went into the genome of the target cells.
disadvantages:
Oncogenic potential because they are integrated into the host genome at multiple sites.
They can cause disease in humans.
They are difficult to cultivate.
adenovirus
Adenoviruses, which cause respiratory tract infections in humans, have a genome consisting of a double-stranded DNA of about 35 kb, 30 of which can be replaced with the gene of interest. Once inside the cell, adenovirus does not integrate into the genome but will replicate in the nucleus as an episome.
Advantages:
Sure (they do not integrate into the genome).
Easily manipulated.
Stable.
They get high titers.
Broad tropism.
also infect resting cells.
They can carry large inserts (36Kb)
.
disadvantages:
transient expression.
High immune response.
adeno-associated virus
The adeno-associated viruses belong to the family of parvoviruses, small viruses are not pathogenic to humans, have a genome size from a single-stranded DNA molecule of approximately 5 kb and can infect proliferating cells and not. To replicate independently but in need of another virus which is typically an adenovirus, or a herpesvirus.
Advantages:
They are not pathogenic to humans.
They are stable.
They are obtained with high titers.
High gene transfer efficiency.
Broad tropism.
Infect both dividing cells that do not.
Integration of the transgene.
disadvantages:
small size of the transgene (4.7 Kb). Recently, the ability of these vectors has been increased by exploiting concatamerizzazione of the AAV genome after my transfer. Using two vectors, each encoding half of the protein of interest.
recombinant vector does not integrate site specific and sometimes remains episomal.
Herpes simplex virus
The herpes simplex virus, due to their natural ability to establish latent infections in neurons, are used for the transport of genes in the CNS. The long-term transgene expression is achieved using the neuron-specific promoters, activated during the latency period. The genome of the herpes virus is constituted by a double-strand of DNA 152kb, it contains more than 80 genes, half of which is not essential for growth in cell culture; Once these genes deleted you can place a large transgene (about 40-50kb).
The non-viral vectors
The methods used to transfer the DNA without using viruses include the injection of naked DNA; insertion via liposomes; inserting through the use of cationic polymers; by particle bombardment (gene gun).
naked DNA
The insertion of naked DNA is the most linear and simple procedure and also enables to transfer gene constructs large. It consists in injecting the therapeutic gene, linked to a plasmid, directly into the cell through the use of a micropipette. The disadvantage of this method consists in the fact that you have to inject the DNA in each cell, one by one. The yield, moreover, is definitely low.
liposomes
Liposomes are spherical vesicles whose wall is composed of a phospholipid bilayer. Using cationic liposomes is possible to complexing the DNA to them, that at neutral pH introduces a negative charge. The DNA-liposome complex can fuse with the cell membrane but in most cases is internalized through endocytosis. Subsequently, the DNA is released into the cytoplasm, it enters the nucleus and is expressed. Unfortunately this process has low efficiency, since it is seen that only 0.1% of the introduced DNA is expressed. To overcome this, in liposomes proteins and antibodies were also included that can increase the effectiveness of the procedure minimizing DNA degradation and facilitating the correct heading of the vesicle.
cationic polymers
Very similar is the transfection procedure using cationic polymers, macromolecules in fact equipped with multiple positive charges can interact with DNA, which at physiological pH is a polyanion, causing condensation and protecting it from aggressive both chemical and enzymatic, as well as by radiation ionizing. Even DNA-polycation complexes are internalized by the cell by endocytosis, and may be actively directed to specific cell lines or tissues using antibodies or other molecules direzionanti.
By particle bombardment (gene gun)
The bombardment by particles is the use of particular electrical tools or high pressure, said genic gun (gene gun), which allow to send the cell microscopic particles of gold or tungsten coated with DNA. At the moment there are no human studies of this method but only on animals.
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