Dopo l’editing genetico, Crispr sbarca nella diagnostica / After genetic editing, Crispr lands in the diagnostic.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Si chiama SHERLOCK ed è un nuovo strumento diagnostico basato sul metodo CRISPR/Cas. Accurato, versatile, facile da impiegare, e molto economico potrebbe sostituire le attuali tecniche per l’identificazione di patogeni e mutazioni cancerogene.

Non solo genome editing: una variante della tecnica CRISPR/Cas, strumento di punta dell’ingegneria genetica, può essere applicata in ambito diagnostico per rilevare le infezioni o per individuare DNA tumorali mutati in modo rapido, economico ed estremamente accurato. SHERLOCK, questo il nome della nuova tecnica messa a punto da un gruppo di scienziati del Broad Institute di Cambridge, Massachusetts, e descritta in un articolo su Science, che sfrutta il principio CRISPR/Cas per riconoscere acidi nucleici presenti in concentrazioni infinitesime e con precisione superiore a quella di metodi analoghi.

Alla base del sistema immunitario acquisito di alcuni procarioti, il meccanismo CRISPR/Cas è diventato la tecnica di genome editing che ha rivoluzionato l’ingegneria genetica. Diversi ingredienti hanno consentito di trasformarlo poi in uno strumento diagnostico. Il principale è l’enzima C2C2 (ribattezzato Cas13a), che, attivato dalla presenza di sequenze specifiche di RNA, inizia a distruggere tutte le molecole di RNA circostanti. Questo “effetto collaterale” è specifico di Cas13a: altri enzimi associati al CRISPR, come il Cas9 usato nell’ingegneria genetica, non lo fanno. Per evidenziare l’avvenuta attivazione del Cas13a (e quindi il riconoscimento e il taglio della sequenza target), i ricercatori hanno pensato di aggiungere un RNA reporter, una molecola di RNA che, se tagliata, diventa fluorescente. Il segnale luminoso emesso dai frammenti indica che Cas13a ha iniziato la sua opera distruttiva e, dunque, che la sequenza “target” è stata riconosciuta. Infine, una tecnica detta di “amplificazione isotermica”, per pre-amplificare la quantità di acidi nucleici, è stata utilizzata spingere il nuovo strumento fino a sensibilità attomolari (10−18). Dalla combinazione di questi ingredienti è nato SHERLOCK, “Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing”.

Uno dei punti forza di SHERLOCK è la versatilità: i ricercatori hanno messo alla prova le sue capacità in una serie di applicazioni, dal rilevamento di infezioni virali e batteriche alla distinzione di genotipi di DNA umani e di mutazioni tumorali.

Nei test effettuati al Broad Institute, SHERLOCK è stato capace di rilevare il virus Zika, distinguendolo dal suo parente prossimo Dengue, in campioni di siero, urina o saliva in cui il virus è presente in concentrazioni molto basse (dell’ordine di un migliaio di repliche per millilitro). Inoltre, SHERLOCK è sensibile a differenze di anche una sola base nucleica: ad esempio è in grado di discriminare due ceppi di Zika, quello americano da quello africano. SHERLOCK è in grado di identificare anche infezioni batteriche: ha identificato con successo diversi ceppi patogeni di Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, e due ceppi di Klebisiella pneumoniae con diversa resistenza antibiotica.

I ricercatori immaginano di trasformare SHERLOCK in pratici economici strip-test, come quelli utilizzati nei test di gravidanza, dal costo stimato di poco più di cinquanta centesimi l’uno.

ENGLISH

It is called SHERLOCK and is a new diagnostic tool based on the CRISPR / Cas method. Accurate, versatile, easy-to-use, and very inexpensive can replace existing techniques for the identification of pathogens and carcinogenic mutations.

Not only genome editing: a variant of the CRISPR / Cas technique, the ultimate tool for genetic engineering, can be applied in diagnostic scope to detect infections or detect mutated tumor DNA quickly, economically and extremely accurately. SHERLOCK, this is the name of the new technique developed by a group of scientists from the Broad Institute of Cambridge, Massachusetts, and described in an article on Science, which uses the CRISPR / Cas principle to recognize nucleic acids present in infinitesimal and precision concentrations Higher than that of similar methods.

Underlying the acquired immune system of some prokaryotes, the CRISPR / Cas mechanism has become the genome editing technique that has revolutionized genetic engineering. Several ingredients made it possible to turn it into a diagnostic tool. The main one is the C2C2 enzyme (renamed Cas13a), which, triggered by the presence of specific RNA sequences, begins to destroy all surrounding RNA molecules. This "side effect" is specific to Cas13a: other enzymes associated with CRISPR, such as Cas9 used in genetic engineering, do not. To highlight the activation of Cas13a (and thus the recognition and cutting of the target sequence), the researchers thought they would add an RNA reporter, a RNA molecule that, if cut, becomes fluorescent. The light signal emitted by the fragments indicates that Cas13a has started its destructive work and therefore that the "target" sequence has been recognized. Finally, a technique known as "isothermal amplification", to pre-amplify the amount of nucleic acids, was used to push the new instrument up to atomic sensitivity (10-18). From the combination of these ingredients was born SHERLOCK, "Special High-Sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing".

One of SHERLOCK's strengths is versatility: researchers have tested their capabilities in a variety of applications, from detecting viral and bacterial infections to the distinction of human DNA genotypes and tumor mutations.

In tests at the Broad Institute, SHERLOCK was able to detect the Zika virus, distinguishing it from its close relative Dengue, in serum, urine or saliva samples in which the virus is present in very low concentrations (of the order of a thousand Replicas per milliliter). In addition, SHERLOCK is sensitive to even a single nucleic base difference: for example, it is able to discriminate between two strains of Zika, the American one and the African one. SHERLOCK is also able to identify bacterial infections: it has successfully identified several pathogenic strains of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, and two strains of Klebisiella pneumoniae with different antibiotic resistance.

The researchers imagine transforming SHERLOCK into practical strip-testing, such as those used in pregnancy tests, from the estimated cost of just over fifty cents

Da:

http://www.galileonet.it/2017/04/editing-genetico-crispr-diagnostica/