Quando la terapia genica incontra CRISPR / When gene therapy meets CRISPR

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Le potenzialità della terapia genica, che di recente ha iniziato a mietere significativi successi, potrebbero essere ulteriormente rafforzate dall'utilizzo della tecnica di editing CRISPR? E' quanto cerca di appurare questa intervista a Luigi Naldini, direttore dell'Istituto Telethon-San Raffaele di Milano per la terapia genica.

L’idea di base è semplice e ambiziosa: curare un numero crescente di malattie correggendo i difetti genetici che le causano. E dopo anni di tentativi, aggiustamenti, ripartenze, nel campo della terapia genica si respira decisamente aria di ottimismo. L’istituto dedicato del San Raffaele-Telethon ha già trattato con questo approccio ben 58 pazienti, tra immunodeficienza ADA-SCID, leucodistrofia, sindrome di Wiskott-Aldrich e beta talassemia. Allargando lo sguardo al mondo intero il conteggio si avvicina a quota 300.

Mentre all’orizzonte si intravedono le nuove potenzialità offerte da CRISPR, la tecnologia emergente per l’editing genomico. Ne abbiamo parlato con Luigi Naldini, che dirige l’Istituto per la terapia genica di Telethon e San Raffaele di Milano ed è l’unico italiano interpellato dall’Accademia americana delle scienze per la stesura dell’ultimo rapporto dedicato all’editing del genoma umano.  

Qual è lo stato dell’arte della terapia genica convenzionale? 
Il bilancio è positivo per i trattamenti ex vivo, quelli in cui le cellule sono prelevate dal paziente, manipolate e infine reintrodotte. Ma ci sono stati importanti progressi anche per i trattamenti in vivo, eseguiti direttamente  nell’organismo. La seconda generazione di vettori virali (lentivirus e virus adeno-associati) si è dimostrata più sicura ed efficiente per il trasferimento genico e sta dando buoni risultati.

Questo approccio è destinato a restare confinato alle malattie rare? 
I vettori lentivirali sono già utilizzati in vari studi clinici per ri-direzionare le cellule immunitarie contro i tumori. Noi stiamo prendendo di mira anche malattie genetiche più diffuse, 

come emofilia e talassemia, che suscitano maggiore interesse anche da parte dell’industria. Il trattamento Strimvelis, già autorizzato in Europa per correggere con la terapia genica una patologia che compromette il sistema immunitario (ADA-SCID), viene somministrato a una decina di soggetti all’anno. In confronto una terapia genica per la talassemia potrebbe interessare decine di migliaia di persone.

Intanto è arrivata la possibilità di correggere il DNA con cambiamenti mirati lettera per lettera. Cosa cambia per la terapia genica nell’era dell’editing?
La velocità della tecnica CRISPR paga più per la ricerca di base che per lo sviluppo clinico, ma si tratta di una piattaforma in continua evoluzione, perciò è probabile che i vantaggi diventeranno più consistenti anche sul piano dell’efficienza. Intanto prosegue il lavoro con le tecnologie di editing sviluppate prima di CRISPR, ovvero Zinc Finger Nucleasi e Talen.

La prima somministrazione di cellule sottoposte a editing genetico ha riguardato una terapia che viene detta “adottiva”, con linfociti provenienti da donatori. L’editing permette di rendere le cellule immunitarie ri-direzionate contro i tumori più aggressive e utilizzabili anche se provengono da donatori terzi. La bambina che è stata trattata non aveva abbastanza cellule sane da utilizzare per generare cellule anti-tumorali, per questo è stata adottata questa strategia. È da notare che le prime prove di utilizzo dell’editing genetico per meglio ri-direzionare le cellule immunitarie contro i tumori erano state realizzate dal nostro istituto in collaborazione con il gruppo di Chiara Bonini e Sangamo Biosciences. Non bisogna dimenticare nemmeno la sperimentazione di Sangamo per bloccare l’accesso del virus Hiv alle cellule immunitarie.

Quali sono i pregi dell’editing? 
Rispetto alla terapia genica classica, l’editing consente di fare più cose. Può servire a controllare più finemente l’espressione del gene corretto, a distruggere i geni malfunzionanti, e a convertire direttamente il gene difettoso in gene funzionante.

Cosa offre in particolare CRISPR? 
Si può dire che CRISPR abbia democratizzato l’editing, perché è più facile da usare rispetto ai sistemi prima disponibili, e questo ha rivoluzionato la ricerca. Inoltre offrirà la possibilità di intervenire contemporaneamente su due o tre bersagli, modificando più geni. Ad esempio potremo introdurre nelle cellule immunitarie una nuova specificità contro il tumore, e al tempo stesso inattivare le sequenze originali che potrebbero essere d’intralcio, e anche eliminare alcuni freni, cosiddetti checkpoint che controllano l’attività delle cellule T.

C’è qualche ostacolo da superare? 
Come per i trattamenti classici, bisogna pur sempre raggiungere i siti da trattare. Con le cellule del sangue è facile, lo è  meno con il cervello o con un muscolo, ad esempio. Poi bisogna valutare la tossicità del trattamento a la sua immunogenicità. Gli enzimi usati per tagliare il DNA e modificarlo sono derivati da batteri, perciò il sistema immunitario potrebbe cercare di eliminare le cellule trattate. Insomma bisogna riuscire a somministrare il trattamento in modo efficiente, transiente e nascosto al sistema immunitario.

Siamo piuttosto avanti con un progetto basato sulle Zinc Finger Nucleasi, che potrebbe passare presto alla sperimentazione clinica in un tipo di immunodeficienza. Abbiamo anche avviato una collaborazione con Editas, per contrastare altre immunodeficienze con l’aiuto di cellule staminali ematopoietiche trattate con CRISPR. Siamo in fase preclinica, ci vorranno almeno un paio d’anni per passare all’uomo.

Il quadro normativo in vigore per la terapia genica classica è sufficiente?
Ritengo di sì, condivido le conclusioni del rapporto dell’Accademia americana delle scienze a cui ho contribuito. Si può far rientrare l’editing delle cellule somatiche nel sistema regolatorio già esistente che è ben rodato.

L’editing della linea germinale è più controverso, perché le modifiche genetiche sarebbero ereditate anche dai discendenti degli individui trattati. Cosa ne pensa?
Le condizioni per cui potrebbe essere utile farlo sono poche, ma se anche si potessero aiutare solo pochi individui, non si dovrebbe chiudere la porta senza valide ragioni. Se fossimo ragionevolmente sicuri che il procedimento è sicuro e funziona bene, ci sarebbero anche dei vantaggi etici nella prevenzione della trasmissione di malattie genetiche. Si parla sempre dell’editing degli embrioni ma è improbabile che riusciremo a effettuarlo in modo abbastanza efficiente.

Come usare l'editing al San Raffaele-Telethon?

Credo sia più realistico arrivare un giorno a modificare i precursori delle cellule germinali. Gli spermatogoni, in particolare, potrebbero essere corretti in vitro e poi trapiantati nuovamente nei testicoli. Per le cellule uovo si può immaginare di correggere delle cellule staminali pluripotenti e di usarle per generare ovociti in vitro. A quel punto il dilemma di dire sì o no a modifiche ereditabili si porrebbe. Non per potenziare le caratteristiche positive sul piano dell’aspetto fisico o dell’intelligenza, non mi sembrano obiettivi perseguibili. Ma se si tratta di impedire la trasmissione dei geni responsabili di gravi malattie, considerare di farlo mi sembra lecito e realistico.

La terapia genica è costosa. Chi pagherà quando sarà in grado di trattare molte malattie?
Per i trattamenti in vivo una somministrazione endovena (nel caso dell’emofilia ad esempio) può mettere fine alla dipendenza dai trattamenti sostituivi. Credo che l’industrializzazione abbasserà notevolmente i costi, rendendo economicamente sostenibile questo approccio terapeutico. Per gli ex vivo la situazione è più complessa, perché bisogna modificare le cellule del singolo paziente, con costi alti e non molto comprimibili. Ma anche i trapianti e alcuni farmaci tumorali sono molto costosi. Se i risultati terapeutici ci sono, poi un sistema che  renda i trattamenti sostenibili si trova, ad esempio spalmando i costi su più anni, modificando i percorsi regolatori.

Sarà sempre un lusso che solo il mondo sviluppato può permettersi?
Non credo. Un talassemico o un emofiliaco dipendono dalla continua somministrazione di un trattamento (sangue o emoderivati, rispettivamente). Nei paesi sviluppati questi pazienti hanno una buona prospettiva di vita anche con la terapia sostitutiva, ma non è così nei paesi in via di sviluppo. La terapia genica, invece, potrebbe rivelarsi utile anche in questi ultimi, perché con una sola somministrazione si può risolvere il problema. L’emofilia potrebbe richiedere un solo trattamento ambulatoriale, la talassemia un autotrapianto, comunque ipotizzabile anche nei paesi in via di sviluppo. È un approccio economicamente sensato, soprattutto per gli emofiliaci, non è solo una terapia per i privilegiati dei paesi ricchi.

ENGLISH

The potential of gene therapy, which has recently started to gain significant success, could be further strengthened by the use of CRISPR editing technique? This is what it seeks to test this interview with Luigi Naldini, director of the Telethon-San Raffaele Institute of Milan for gene therapy.

The basic idea is simple and ambitious: to cure an increasing number of diseases by correcting the genetic defects that cause them. And after years of attempts, adjustments, restarts, in the field of gene therapy, there is a lot of air to optimism. The dedicated San Raffaele-Telethon Institute has already dealt with this approach with 58 patients, including ADA-SCID, leukodystrophy, Wiskott-Aldrich syndrome and beta thalassemia. By extending the globe to the world, the count approaches to 300.

While on the horizon are seen the new potential offered by CRISPR, the emerging technology for genomic editing. We talked with Luigi Naldini, who directs the Institute for Gene Therapy of Telethon and San Raffaele of Milan and is the only Italian interrogated by the American Academy of Sciences for the elaboration of the last report devoted to the editing of the human genome.

What is the state of the art of conventional gene therapy?

The balance is positive for ex vivo treatments, those where the cells are taken from the patient, manipulated and finally reintroduced. But there have also been some important advances in vivo treatments, performed directly in the body. The second generation of viral vectors (lentivirus and adeno-associated viruses) has proven to be safer and more efficient for gene transfer and is delivering good results.

Is this approach to be confined to rare diseases?

Lentiviral vectors have already been used in various clinical trials to re-direct tumor immune cells. We are also targeting the most widespread genetic diseases,

Such as hemophilia and thalassemia, which also give rise to greater interest on the part of industry. The Strimvelis treatment, already authorized in Europe to correct a pathology that affects the immune system (ADA-SCID), is administered to a dozen subjects per year. In comparison, a thalassemia gene therapy could affect tens of thousands of people.

Meanwhile, there was a chance to correct DNA with targeted changes by letter to letter. What Changes to Gene Therapy in the Age of Editing?

The speed of CRISPR technology pays more for basic research than for clinical development, but it is a constantly evolving platform, so it is likely that the benefits will become even more consistent with efficiency. Meanwhile, she continues working with editing technologies developed before CRISPR, namely Zinc Finger Nuclease and Talen.

The first administration of cells undergoing genetic editing involved a therapy that is termed "adaptive" with donor lymphocytes. Editing allows the immune cells to be re-directed against the most aggressive and usable tumors even if they come from third-party donors. The baby she was treated had not enough healthy cells to use to generate anti-tumor cells, so this strategy was adopted. It should be noted that the early trials of genetic modification used to re-direct tumor immune cells were carried out by our institute in collaboration with Chiara Bonini and Sangamo Biosciences. We should not even forget Sangamo's experiment to block the access of HIV virus to immune cells.

What are the advantages of editing?

Compared to classic gene therapy, editing allows you to do more things. It may serve to control the correct gene expression more finely, to destroy the malignant genes, and to directly convert the defective gene into a functioning gene.

What does CRISPR offer in particular?

It can be said that CRISPR has democratized the editing because it is easier to use than the systems that are available before, and this revolutionized the search. It will also offer the ability to simultaneously interact with two or three targets by modifying multiple genes. For example, we may introduce new tumor specificity into the immune cells, and at the same time inactivate the original sequences that might be inhibition, and also eliminate some of the brakes, so-called checkpoints that control the activity of T cells.

Is there any obstacle to overcome?

As with classical treatments, you must always reach the sites to be treated. With blood cells is easy, it is less with the brain or with a muscle, for example. Then the toxicity of the treatment has to be assessed with its immunogenicity. The enzymes used to cut DNA and modify it are derived from bacteria so the immune system might try to eliminate the treated cells. In short, you need to be able to administer the treatment efficiently, transiently and secretively to the immune system.

We are rather ahead with a project based on Zinc Finger Nucleasi, which could soon go to clinical trials in a type of immunodeficiency. We also started a collaboration with Editas to counter other immunodeficiencies with the help of hematopoietic stem cells treated with CRISPR. We are in the preclinical phase, it will take at least a couple of years to go to the man.

Is the normative framework in place for classical gene therapy sufficient?

Yes, I agree with the conclusions of the report of the American Academy of Sciences to which I have contributed. It is possible to include the somatic cell editing in the already existing regulatory system that is well-known.

Germinal line editing is more controversial because genetic modifications would also be inherited by the descendants of the treated individuals. What do you think?

The conditions for which it may be useful to do so are few, but if only a few individuals could help, you should not close the door for no valid reason. If we were reasonably certain that the procedure is safe and well functioning, there would also be ethical advantages in preventing the transmission of genetic diseases. We always talk about embryo editing, but it is unlikely that we will be able to do it efficiently.

How to use editing at San Raffaele-Telethon?

I think it is more realistic to come one day to modify the precursors of germ cells. The spermatogons, in particular, could be corrected in vitro and then transplanted again into the testes. For egg cells, one can imagine correcting pluripotent stem cells and using them to generate in vitro oocytes. At that point the dilemma of saying yes or no to inheritable changes would arise. Not to enhance the positive features of the physical aspect or the intelligence, I do not seem to be pursuing goals. But if it is to prevent the transmission of genes responsible for serious illness, consider doing it seems legitimate and realistic.

Gene therapy is expensive. Who will pay when he will be able to treat many diseases?

For in vivo treatments an intravenous injection administration (in the case of hemophilia for example) may end the dependence on substitute treatments. I believe that industrialization will significantly lower costs by making this therapeutic approach economically viable. For ex vivo, the situation is more complicated because it is necessary to modify the individual patient's cells at high cost and not very compressible. But transplants and some cancer drugs are also very expensive. If the therapeutic results are there, then a system that makes the treatments sustainable is, for example, spreading costs over many years by modifying the regulatory paths.

Will it always be a luxury that only the developed world can afford?

I do not believe. Thalassemic or hemophilia ectomy is dependent on the continued administration of a treatment (blood or blood derivative, respectively). In developed countries, these patients have a good life prospect with substitution therapy, but this is not the case in developing countries. Gene therapy, on the other hand, may also be useful in the latter because one-on-one can solve the problem. Hemophilia may require only one outpatient treatment, thalassemia is a self-depletion, however, it can be hypothesized even in developing countries. It is an economically sensible approach, especially for hemophiliacs, it is not just a treatment for the privileged people of the rich countries.

Da:

http://www.lescienze.it/news/2017/05/29/news/crispr_terapia_genica_intervista_naldini-3546025/