Coltura artificiale dei tessuti / Artificial tissue culture

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa  / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Espianti di patate con coltura di tessuti in vitro / Potato explants with tissue culture in vitro

Un espianto è un tessuto vivo separato dal proprio organo e trasferito in un mezzo artificiale di crescita.

Può essere una porzione del germoglio, delle foglie o di alcune cellule di una pianta, oppure può essere una qualsiasi parte del tessuto di un animale.

In breve il tessuto è raccolto in maniera asettica, spesso triturato, e i frammenti sono posti in un recipiente di coltura cellulare contenente un mezzo nutritivo. Col tempo, le cellule progenitrici migrano fuori dal tessuto sulla superficie del recipiente. Queste cellule primarie possono poi essere ulteriormente espanse e trasferite in nuovi recipienti.

Tale procedura trova vasta applicazione nel campo delle biotecnologie (soprattutto vegetali) e prende il nome di coltura artificiale dei tessuti.

Un'altra forma di coltura degli espianti è la coltivazione delle stesse parti di tessuto, in cui le cellule sono lasciate nella loro matrice extracellulare circostante per riprodurre in maniera più accurata l'ambiente in vivo, ad es. la coltura di un espianto di cartilagine

La coltura artificiale dei tessuti è una serie di tecniche usate per mantenere o far crescere cellule, tessuti od organi vegetali in condizioni sterili su un mezzo di coltura nutriente di composizione nota. La coltura artificiale dei tessuti è usata ampiamente per produrre i cloni di una pianta in un metodo noto come micropropagazione. Le diverse tecniche della coltura artificiale dei tessuti possono offrire certi vantaggi sui metodi tradizionali di propagazione, compresi:

• La produzione di copie esatte di piante che producono fiori e frutti particolarmente buoni o possiedono altri tratti desiderabili.
• Per produrre rapidamente piante mature.
• La produzione di multipli di piante in assenza di semi o degli impollinatori necessari per produrre i semi stessi.
• La rigenerazione di intere piante da cellule vegetali che sono state geneticamente modificate.
• La produzione di piante in contenitori sterili che permette loro di essere spostate con rischi grandemente ridotti di trasmettere malattie, parassiti e patogeni.
• La produzione di piante da semi che altrimenti avrebbero bassissime possibilità di germinare e di crescere, ad es. orchidee e nepente.
• Per pulire particolari piante da infezioni virali e di altro tipo e moltiplicarle rapidamente come "ceppo puilito" per l'orticoltura e l'agricoltura.

La coltura artificiale dei tessuti fa affidamento sul fatto che molte cellule vegetali hanno la capacità di rigenerare un'intera pianta (totipotenza). Singole cellule, cellule vegetali senza pareti cellulari (protoplasti), pezzi di foglie o (meno comunemente) di radici possono spesso essere usati per generare una nuova pianta su mezzi di coltura, dati i nutrienti e gli ormoni vegetali richiesti.

Tecniche

La moderna coltura artificiale dei tessuti è eseguita in condizioni asettiche in aria con filtri HEPA prodotta da una cappa a flusso laminare. I materiali vegetali viventi provenienti dall'ambiente sono naturalmente contaminati sulle loro superfici (e talvolta al loro interno) da microorganismi, perciò è richiesta la sterilizzazione del materiale di partenza (espianti) in soluzioni chimiche (di solito ipoclorito di sodio o di calcio o cloruro mercurico). Il cloruro mercurico si usa raramente oggi come sterilizzante vegetale, a meno che non si trovi che altri agenti sterilizzanti siano inefficaci, poiché è pericoloso da usare ed è difficile da eliminare. Gli espianti sono poi posti di solito sulla superficie di un mezzo di coltura solido, ma a volte sono posti direttamente in un mezzo liquido, particolarmente quando si desiderano colture di sospensione cellulare. I mezzi solidi e liquidi sono composti generalmente di sali inorganici più alcuni nutrienti organici, vitamine e ormoni vegetali. I mezzi solidi sono preparati da mezzi con l'aggiunta di un agente gelificante, di solito agar purificato.

Quando i germogli emergono da una coltura, possono essere recisi e piantari con l'auxina per produrre pianticelle che, quando sono mature, possono essere trasferite a terreno per vasi per l'ulteriore crescita in serra come piante normali.La composizione del mezzo, particolarmente gli ormoni vegetali e la sorgente di azoto (sali di nitrato rispetto a quelli di ammonio o amminoacidi) hanno effetti profondi sulla morfologia dei tessuti che crescono dall'espianto iniziale. Ad esempio, un eccesso di auxinadarà spesso come risultato una proliferazione di radici, mentre un eccesso di citochinina può produrre germogli. Un bilanciamento sia di auxina che di citochinina produrrà spesso la crescita disorganizzata di cellule, o callo, ma la morfologia dell'ecrescenza dipenderà dalla specie vegetale come pure dalla composizione del mezzo. Mentre le colture crescono, delle parti sono tipicamente recise e trasferite a nuovi mezzi (sottocolture) per consentire la crescita o alterare la morfologia della coltura. L'abilità e l'esperienza del coltivatore dei tessuti sono importanti nel giudicare quali parti coltivare e quali scartare.

Scelta dell'espianto

Il tessuto ottenuto dalla pianta per la coltura è chiamato espianto. In base al lavoro condotto su certi sistemi modello, in particolare il tabacco, si è spesso sostenuto che un espianto totipotente possa essere fatto crescere a partire da qualsiasi parte della pianta. Tuttavia, questo concetto in pratica è stato invalidatato. In molte specie gli espianti i diversi organi variano nei loro tassi di crescita e rigenerazione, mentre alcuni non crescono affatto. La scelta del materiale per l'espianto determina anche se le pianticelle sviluppatesi attraverso la coltura dei tessusi sono aploidi o diploidi. Anche il rischio della contaminazione micorbica è aumentatto con espianti inappropriati. Pertanto è molto importante che anteriormente alla coltura dei tessusti sia fatta una scelta appropriata dell'espianto.

Le specifiche differenze nel potenziale di rigenerazione dei diversi organi ed espianti hanno varie spiegazioni. I fattori significativi comprendono differenze nello stadio delle cellule nel ciclo cellulare, la disponibilità di o la capacità di trasportare regolatori endogeni della crescita, e le capacità metaboliche delle cellule. Gli espianti di tessuti più comunemente utilizzati sono le estremità meristematiche delle piante come la punta del fusto, la punta ausiliaria della gemma e la punta della radice. Questi tessuti hanno elevati tassi di divisione cellulare e concentrano o producono le sostanze richieste per la regolazione della crescita, comprese le auxine e le citochinine.

I percorsi attraverso i quali intere piante sono rigenerate da cellule e tessuti o da espianti come i meristemi ricadono in linea di massima in tre tipi:

1. Il metodo nel quale gli espianti che includono un meristema (ossia le punte o i nodi dei germogli) sono fatti crescere su mezzi appropriati integrati con regolatori della crescita delle piante per indurre la proliferazione di germogli multipli, seguita dal radicamento dei germogli recisi per rigenerare intere piante,
2. Il metodo nel quale la totipotenza delle cellule è realizzata sotto forma di organogenesi de novo, o direttamente sotto forma di induzione di meristemi dei germogli sugli espianti o indirettamente mediante un callo (massa disorganizzata di cellule risultante dalla proliferazione di cellule dell'espianto) e le piante sono rigenerati attraverso l'induzione di radici sui fermogli risultanti,
3. Embriogenesi somatica, nel quale embrioni avventizi asessuati (comparabili agli embrioni zigotici nella loro struttura e nel loro sviluppo) sono indotti direttamente sugli espianti o indirettamente attraverso una fase callosa.

Il primo metodo che coinvolge i meristemi e l'induzione di germogli multipli è il metodo preferito per l'industria della micropropagazione poiché i rischi della variazione somaclonale (variazione genetica indotta nella coltura dei tessuti) sono minimi quando sono comparati agli altri due metodi. L'embriogenesi somatica è un metodo che ha il potenziale per essere parecchie volte più alto per quanto riguarda i tassi di moltiplicazione ed è suscettibile di essere maneggiato mei sistemi di coltura liquida come i bioreattori.

Alcuni espianti, come la punta della radice, sono difficili da isolare e sono contaminati dalla microflora del suolo che diventa problematica durante il processo di coltura dei tessuti. Certi tipi di microflora del suolo possono formare strette associazioni con i sistemi radicali, o perfino crescere all'interno della radice. Le particelle di suolo legate alle radici sono difficili da rimuovere senza arrecare danni alle radici che poi permettono l'attacco microbico. Questa microflora associata generalmente ricopre il mezzo di coltura dei tessuti prima che vi sia una crescita significativa del tessuto vegetale.

Gli espianti aerei (del suolo superiore) sono anche ricchi di microflora indesiderabile. Tuttavia, essa è rimossa più facilmente dall'espianto mediante un lavaggio delicato, e il resto di solito può essere ucciso mediante una sterilizzazione superficiale. La maggior parte della microflora superficiale non forma associazioni strette con il tessuto delle piante. Tali associazioni di solito si possono trovare mediante un'ispezione visiva come un mosaico, una decolorazione o una necrosi localizzata sulla superficie dell'espianto.

Un'alternativa per ottenere espianti incontaminati è prendere gli espianti dai semenzali che sono cresciuti asetticamente da semi sterilizzati in superficie. La superficie dura del seme è meno permeabile alla penetrazione di agenti sterilizzanti superficiali aggressivi, come l'ipoclorito, perciò le condizioni accettabili della sterilizzazione usata per i semi possono essere molto più stringenti dei tessuti vegetativi.

Le piante coltivate dai tessuti sono cloni. Se la pianta madre originale usata per produrre i primi espianti fosse sensibile a una condizione patogena o ambientale, l'intera coltura sarebbe sensibile allo stesso problema. Per converso, anche qualunque tratto positivo rimarrebbe all'interno della stirpe.

Alcuni tessuti coltivati sono lenti nella loro crescita. Per loro ci sarebbero due opzioni: (i) Ottimizzare il terreno di coltura, (ii) Coltura in modo sano e con forza crescente tessuti o varietà.^[2] Necrosi potrebbe rovinare i tessuti in coltura. Generalmente, necrosi del tessuto varia in diverse varietà di piante. Quindi, può essere migliorata coltivando sano e vigorosamente crescente varietà o tessuti.

Applicazioni

La coltura artificiale dei tessuti è ampiamente usata nella scienza delle piante; ha anche parecchie applicazioni commerciali, tra le quali si possono citare:

• La micropropagazione è usata ampiamente in silvicoltura e in floricoltura. La micropropagazione può essere usata anche per conservare specie vegetali rare o a rischio.
• Un allevatore di piante può utilizzare la coltura dei tessuti per selezionare cellule piuttosto che piante per isolare caratteri vantaggiosi, ad es. la resistenza/tolleranza ai diserbanti.
• La crescita su larga scala di cellule vegetali in coltura liquida nei bioreattori per la produzione di composti preziosi, come metaboliti secondari derivati dalle piante e proteine ricombinanti usati come biofarmaci.^[4]
• Incrociare specie lontanamente imparentate mediante fusione dei protoplasti e rigenerazione del nuovo ibrido.
• Fare l'impollinazione incrociata di specie lontanamente imparentate e poi la coltivazione dei tessuti dell'embrione risultante che altrimenti normalmente morirebbe (recupero dell'embrione).
• Per la produzione di piante monoploidi doppie (ploidia) da colture aploidi per ottenere stirpi omozigoti più rapidamente nei programmi di allevamento, solitamente mediante trattamento con la colchicina che causa il raddoppiamento del numero cromosomico.
• Come tessuto per la trasformazione, seguita o dalla sperimentazione a breve termine di costrutti genetici o dalla rigenerazione di piante transgeniche.
• Certe tecniche come la coltura delle punte meristematiche possono essere usate per produrre materiale vegetale pulito da ceppi viralizzati, come le patate e varie specie di frutti morbidi.
• La micropropagazione che usa la coltura dei meristemi e dei germogli per produrre grandi numeri di individui identici.
• Può essere ottenuta la produzione di identiche specie ibride sterili.

Laboratori

Anche se alcuni coltivatori e serre hanno i propri laboratori per propagare le piante per mezzo della tecnica della coltura dei tessuti, parecchi laboratori indipendenti forniscono servizi di propagazione personalizzati. La  Plant Tissue Culture Information Exchange  elenca molti laboratori commerciali di coltura dei tessuti. Poiché la coltura artificiale dei tessuti è un processo ad alta intensità di lavoro, questo sarebbe un importante fattore nel determinare quali piante sarebbero commercialmente vitali da propagare in un laboratorio.

ENGLISH

An explant is a living tissue separated from its organ and transferred into an artificial growth medium.

It can be a portion of the shoot, leaves or some plant cells, or it can be any part of an animal's tissue.

Briefly, the tissue is collected aseptically, often ground, and the fragments are placed in a cell culture vessel containing a nutrient medium. Over time, the progenitor cells migrate out of the tissue onto the surface of the vessel. These primary cells can then be further expanded and transferred to new vessels.

This procedure is widely used in the field of biotechnology (especially vegetables) and is called artificial tissue culture.

Another form of explant culture is the cultivation of the same tissue parts, in which cells are left in their surrounding extracellular matrix to more accurately reproduce the in vivo environment, e.g. the cultivation of a cartilage explant

Artificial tissue culture is a series of techniques used to maintain or grow plant cells, tissues or organs under sterile conditions on a nutritious culture medium of known composition. Artificial tissue culture is used extensively to produce clones of a plant in a method known as micropropagation. The different techniques of artificial tissue culture can offer certain advantages over traditional propagation methods, including:

The production of exact copies of plants that produce particularly good flowers and fruits or have other desirable traits.

To quickly produce mature plants.

The production of multiples of plants in the absence of seeds or pollinators necessary to produce the seeds themselves.

The regeneration of entire plants from plant cells that have been genetically modified.

The production of plants in sterile containers that allows them to be moved with greatly reduced risks of transmitting diseases, parasites and pathogens.

The production of seed plants that otherwise would have very low chances of germinating and growing, eg orchids and Nepenthes.

To clean particular plants from viral and other infections and multiply them rapidly as a "clean strain" for horticulture and agriculture.

Artificial tissue culture relies on the fact that many plant cells have the ability to regenerate an entire plant (totipotency). Individual cells, plant cells without cell walls (protoplasts), pieces of leaves or (less commonly) roots can often be used to generate a new plant on culture media, given the nutrients and plant hormones required.

Techniques

Modern artificial tissue culture is performed under aseptic conditions in air with HEPA filters produced by a laminar flow hood. Living plant materials coming from the environment are naturally contaminated on their surfaces (and sometimes inside them) by microorganisms, therefore sterilization of the starting material (explants) in chemical solutions is required (usually sodium or calcium hypochlorite or chloride) mercuric). Mercuric chloride is rarely used today as a vegetable sterilizer, unless it is found that other sterilizing agents are ineffective, since it is dangerous to use and is difficult to eliminate. The explants are then usually placed on the surface of a solid culture medium, but are sometimes placed directly in a liquid medium, particularly when cell suspension cultures are desired. Solid and liquid media are generally composed of inorganic salts plus some organic nutrients, vitamins and plant hormones. The solid media are prepared from media with the addition of a gelling agent, usually purified agar.

When the shoots emerge from a crop, they can be cut and planted with the auxin to produce seedlings which, when mature, can be transferred to potting soil for further growth in the greenhouse as normal plants. The composition of the medium, particularly plant hormones and the source of nitrogen (nitrate salts compared to those of ammonium or amino acids) have profound effects on the morphology of the tissues that grow from the initial explant. For example, an excess of auxin will often result in a proliferation of roots, while an excess of cytokinin may produce sprouts. A balance of both auxin and cytokinin will often produce the disorganized growth of cells, or callus, but the morphology of the outgrowth will depend on the plant species as well as on the composition of the medium. As the crops grow, parts are typically severed and transferred to new media (sub-cultures) to allow growth or alter the morphology of the crop. The skill and experience of the tissue grower is important in judging which parts to cultivate and which to discard.

Explanation choice

The tissue obtained from the plant for cultivation is called explant. Based on the work carried out on certain model systems, in particular tobacco, it has often been argued that a totipotent explant can be made to grow from any part of the plant. However, this concept has been invalidated in practice. In many species the explants of the different organs vary in their growth and regeneration rates, while some do not grow at all. The choice of the material for explant determines even if the seedlings developed through the cultivation of the weavings are haploid or diploid. The risk of micorbic contamination is also increased with inappropriate explants. Therefore it is very important that an appropriate harvesting choice is made prior to the cultivation of the tissues.

The specific differences in the regeneration potential of the different organs and explants have various explanations. The significant factors include differences in cell stage in the cell cycle, the availability of or the ability to transport endogenous growth regulators, and the metabolic capacities of cells. The most commonly used tissue explants are the meristematic ends of the plants such as the tip of the stem, the auxiliary tip of the bud and the tip of the root. These tissues have high cell division rates and concentrate or produce the substances required for growth regulation, including auxins and cytokinins.

The paths through which entire plants are regenerated by cells and tissues or by explants such as meristems fall broadly into three types:

The method in which explants that include a meristem (ie the tips or knots of the shoots) are grown on appropriate means integrated with plant growth regulators to induce the proliferation of multiple shoots, followed by rooting of cut buds to regenerate whole plants ,

The method in which the totipotency of the cells is realized in the form of de novo organogenesis, or directly in the form of induction of meristems of the shoots on the explants or indirectly through a callus (disorganized mass of cells resulting from the proliferation of explant cells) and the plants are regenerated through the induction of roots on the resulting retainers,

Somatic embryogenesis, in which asexual adventitious embryos (comparable to zygotic embryos in their structure and in their development) are directly induced on the explants or indirectly through a callous phase.

The first method involving meristems and the induction of multiple shoots is the preferred method for the micropropagation industry since the risks of somaclonal variation (genetic variation induced in tissue culture) are minimal when compared to the other two methods. Somatic embryogenesis is a method that has the potential to be several times higher in terms of multiplication rates and is likely to be handled in liquid culture systems such as bioreactors.

Some explants, such as the tip of the root, are difficult to isolate and are contaminated by soil microflora which becomes problematic during the tissue culture process. Certain types of soil microflora can form close associations with root systems, or even grow within the root. The soil particles tied to the roots are difficult to remove without causing damage to the roots which then allow the microbial attack. This associated microflora generally covers the tissue culture medium before there is significant growth of the plant tissue.

Aerial explants (from the upper soil) are also rich in undesirable microflora. However, it is more easily removed by explant by gentle washing, and the rest can usually be killed by surface sterilization. Most superficial microflora do not form tight associations with plant tissue. Such associations can usually be found by visual inspection such as a mosaic, discoloration or necrosis located on the surface of the explant.

An alternative to get pristine explants is to take explants from seedlings that have grown aseptically from seeds sterilized on the surface. The hard surface of the seed is less permeable to the penetration of aggressive surface sterilizing agents, such as hypochlorite, therefore the acceptable conditions of sterilization used for the seeds can be much more stringent than the vegetative tissues.

Plants grown from tissues are clones. If the original parent plant used to produce the first explants was sensitive to a pathogenic or environmental condition, the entire crop would be sensitive to the same problem. Conversely, even any positive trait would remain within the lineage.

Some cultivated fabrics are slow in their growth. For them there would be two options: (i) Optimize the culture medium, (ii) Culture in a healthy way with increasing tissue or variety. [2] Necrosis could ruin cultured tissues. Generally, tissue necrosis varies in different plant varieties. Thus, it can be improved by growing healthy and vigorously growing varieties or fabrics.

Applications

Artificial tissue culture is widely used in plant science; it also has several commercial applications, among which we can mention:

Micropropagation is widely used in forestry and floriculture. Micropropagation can also be used to conserve rare or endangered plant species.

A plant breeder can use tissue culture to select cells rather than plants to isolate advantageous traits, e.g. resistance / tolerance to herbicides.

The large-scale growth of plant cells in liquid culture in bioreactors for the production of valuable compounds, as secondary metabolites derived from plants and recombinant proteins used as biopharmaceuticals. [4]

Crossing species distantly related by fusion of protoplasts and regeneration of the new hybrid.

Cross-pollinate distantly related species and then cultivate the resulting embryo tissues that would otherwise normally die (embryo recovery).

For the production of double monoploid plants (ploidy) from haploid cultures to obtain homozygous lineages more quickly in breeding programs, usually by treatment with colchicine which causes the chromosome number to double.

As a tissue for transformation, followed by either the short-term experimentation of genetic constructs or the regeneration of transgenic plants.

Certain techniques such as the cultivation of meristematic tips can be used to produce clean plant material from viralized stocks, such as potatoes and various species of soft fruits.

The micropropagation that uses the culture of meristems and shoots to produce large numbers of identical individuals.

The production of identical sterile hybrid species can be obtained.

Workshops

Although some growers and greenhouses have their own laboratories to propagate plants by tissue culture technique, several independent laboratories provide customized propagation services. The Plant Tissue Culture Information Exchange lists many commercial tissue culture laboratories. Since artificial tissue culture is a labor-intensive process, this would be an important factor in determining which plants would be commercially viable to propagate in a laboratory.

Da:

https://it.wikipedia.org/wiki/Espianto

https://it.wikipedia.org/wiki/Coltura_artificiale_dei_tessuti