New universe of miniproteins is upending cell biology and genetics / Il nuovo universo di miniproteine sta ribaltando la biologia cellulare e la genetica
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New universe of miniproteins is upending cell biology and genetics / Il nuovo universo di miniproteine sta ribaltando la biologia cellulare e la genetica
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
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The venom of this predatory water bug has more than a dozen small proteins. /
Il veleno di questo insetto d'acqua predatore ha più di una dozzina di piccole proteine
Mice put human runners to shame. Despite taking puny strides, the rodents can log 10 kilometers or more per night on an exercise wheel. But the mice that muscle biologist Eric Olson of the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas and colleagues unveiled in 2015 stood out. On a treadmill, the mice could scurry up a steep 10% grade for about 90 minutes before faltering, 31% longer than other rodents. Those iron mice differed from counterparts in just one small way—the researchers had genetically altered the animals to lack one muscle protein. That was enough to unleash superior muscle performance. "It's like you've taken the brakes off," Olson says.
Just as startling was the nature of the crucial protein. Muscles house some gargantuan proteins. Dystrophin, a structural protein whose gene can carry mutations that cause muscular dystrophy, has more than 3600 amino acids. Titin, which acts like a spring to give muscles elasticity, is the biggest known protein, with more than 34,000 amino acids. The protein disabled in the mice has a paltry 46. Although researchers have probed how muscles work for more than 150 years, they had completely missed the huge impact this tiny protein, called myoregulin, has on muscle function.
Olson and his colleagues weren't the only ones to be blindsided by Lilliputian proteins. As scientists now realize, their initial rules for analyzing genomes discriminated against identifying those pint-size molecules. Now, broader criteria and better detection methods are uncovering minuscule proteins by the thousands, not just in mice, but in many other species, including humans. "For the first time, we are about to explore this universe of new proteins," says biochemist Jonathan Weissman of the University of California, San Francisco.
Biologists are just beginning to delve into the functions of those molecules, called microproteins, micropeptides, or miniproteins. But their small size seems to allow them to jam the intricate workings of larger proteins, inhibiting some cellular processes while unleashing others. Early findings suggest microproteins bolster the immune system, control destruction of faulty RNA molecules, protect bacteria from heat and cold, dictate when plants flower, and provide the toxic punch for many types of venom. "There's probably going to be small [proteins] involved in all biological processes. We just haven't looked for them before," says biochemist Alan Saghatelian of the Salk Institute for Biological Studies in San Diego, California.
Small proteins also promise to revise the current understanding of the genome. Many appear to be encoded in stretches of DNA—and RNA—that were not thought to help build proteins of any sort. Some researchers speculate that the short stretches of DNA could be newborn genes, on their way to evolving into larger genes that make full-size proteins. Thanks in part to small proteins, "We need to rethink what genes are," says microbiologist and molecular biologist Gisela Storz of the National Institute of Child Health and Human Development in Bethesda, Maryland.
Despite the remaining mysteries, scientists are already testing potential uses for the molecules. One company sells insecticides derived from small proteins in the poison of an Australian funnel-web spider. And a clinical trial is evaluating an imaging agent based on another minute protein in scorpion venom, designed to highlight the borders of tumors so that surgeons can remove them more precisely. Many drug companies are now searching for small proteins with medical potential, says biochemist Glenn King of the University of Queensland in St. Lucia, Australia. "It's one of the most rapidly growing areas."
OTHER SHORT AMINO ACID chains, often called peptides or polypeptides, abound in cells, but they are pared-down remnants of bigger predecessors. Myoregulin and its diminutive brethren, in contrast, are born small. How tiny they can be remains unclear. Fruit flies rely on a microprotein with 11 amino acids to grow normal legs, and some microbes may crank out proteins less than 10 amino acids long, notes microbial genomicist Ami Bhatt of Stanford University in Palo Alto, California. But even the largest small proteins don't measure up to average-size proteins such as alpha amylase, a 496–amino-acid enzyme in our saliva that breaks down starch.
Few small proteins came to light until recently because of a criterion for identifying genes set about 20 years ago. When scientists analyze an organism's genome, they often scan for open reading frames (ORFs), which are DNA sequences demarcated by signals that tell the cell's ribosomes, its proteinmaking assembly lines, where to start and stop. In part to avoid a data deluge, past researchers typically excluded any ORF that would yield a protein smaller than 100 amino acids in eukaryotes or 50 amino acids in bacteria. In yeast, for example, that cutoff limited the list of ORFs to about 6000.
Relaxing that criterion reveals that cells carry vastly more ORFs. Earlier this year, Stanford postdoc Hila Sberro Livnat, Bhatt, and colleagues trawled genome fragments from the microbes that inhabit four parts of the human body, including the gut and skin. By searching for small ORFs that could encode proteins between five and 50 amino acids long, the researchers identified about 4000 families of potential microproteins. Almost half resemble no known proteins, but the sequence for one small ORF suggested that a corresponding protein resides in ribosomes—a hint that it could play some fundamental role. "It's not just genes with esoteric functions that have been missed" when scientists overlooked small ORFs, Bhatt says. "It's genes with core functions."
For the first time, we are about to explore this universe of new proteins.
Other cells also house huge numbers of short ORFs—yeast could make more than 260,000 molecules with between two and 99 amino acids, for example. But cells almost certainly don't use all those ORFs, and some of the amino acid strings they produce may not be functional. In 2011, after finding more than 600,000 short ORFs in the fruit fly genome, developmental geneticist Juan Pablo Couso of the University of Sussex in Brighton, U.K., and colleagues tried to whittle down the number. They reasoned that if a particular ORF had an identical or near-identical copy in a related species, it was less likely to be genomic trash. After searching another fruit fly's genome and analyzing other evidence that the sequences were being translated, the group ended up with a more manageable figure of 401 short ORFs likely to yield microproteins. That would still represent a significant fraction of the insects' protein repertoire—they harbor about 22,000 full-size proteins.
Weissman and colleagues found microproteins a second way, through a method they invented to broadly determine which proteins cells are making. To fashion any protein, a cell first copies a gene into messenger RNA. Then ribosomes read the mRNA and string together amino acids in the order it specifies. By sequencing mRNAs attached to ribosomes, Weissman and his team pinpoint which ones cells are actually turning into proteins and where on the RNAs a ribosome starts to read. In a 2011 Cell study, he and his team applied that ribosome profiling method, also called Ribo-seq, to mouse embryonic stem cells and discovered the cells were making thousands of unexpected proteins, including many that would fall below the 100–amino-acid cutoff. "It was quite clear that the standard understanding had ignored a large universe of proteins, many of which were short," Weissman says.
Saghatelian and his colleagues adopted a third approach to discover a trove of microproteins in our own cells. The researchers used mass spectrometry, which involves breaking up proteins into pieces that are sorted by mass to produce a distinctive spectrum for each protein. Saghatelian, his then-postdoc Sarah Slavoff, and colleagues applied the method to protein mixtures from human cells and then subtracted the signatures of known proteins. That approach revealed spectra for 86 previously undiscovered tiny proteins, the smallest just 18 amino acids long, the researchers reported in 2013 in Nature Chemical Biology.
BEING SMALL LIMITS a protein's capabilities. Larger proteins fold into complex shapes suited for a particular function, such as catalyzing chemical reactions. Proteins smaller than about 50 to 60 amino acids probably don't fold, says chemist Julio Camarero of the University of Southern California in Los Angeles. So they probably aren't suited to be enzymes or structural proteins.
However, their diminutive size also opens up opportunities. "They are tiny enough to fit into nooks and crannies of larger proteins that function as channels and receptors," Olson says. Small proteins often share short stretches of amino acids with their larger partners and can therefore bind to and alter the activity of those proteins. Bound microproteins can also shepherd bigger molecules to new locations—helping them slip into cell membranes, for instance.
A microprotein in the poison of the deathstalker scorpion has been fused to a fluorescent dye to make tumors emit near-infrared light. (1) A tumor seen in visible light (2) Same tumor in visible and near-infrared light
Because of their attraction to larger proteins, small proteins may give cells a reversible way to switch larger proteins on or off. In a 2016 study in PLOS Genetics, plant developmental biologist Stephan Wenkel of the University of Copenhagen and colleagues genetically altered Arabidopsis plants to produce extra amounts of two small proteins. The plants normally burst into flower when the days are long enough, but when they overproduced the two microproteins, their flowering was postponed. The small proteins caused that delay by blocking a hefty protein called CONSTANS that triggers flowering. They tether CONSTANS to other inhibitory proteins that shut it down. "A cell uses things that help it survive. If a short protein does the job, that's fine," Saghatelian says.
Those jobs include other key tasks. In 2016, Slavoff, Saghatelian, and colleagues revealed that human cells manufacture a 68–amino-acid protein they named NoBody that may help manage destruction of faulty or unneeded mRNA molecules. NoBody's name reflects its role in preventing formation of processing bodies (P-bodies), mysterious clusters in the cytoplasm where RNA breakdown may occur. When the protein is missing, more P-bodies form, thus boosting RNA destruction and altering the cell's internal structure. "It shows that small proteins can have massive effects in the cell," Slavoff says.
Muscles appear to depend on a variety of microproteins. During embryonic development, individual muscle cells merge into fibers that power contraction. The 84–amino-acid protein myomixer teams up with a larger protein to bring the cells together, Olson's team reported in 2017 in Science. Without it, embryonic mice can't form muscles and are almost transparent.
Later in life, myoregulin steps in to help regulate muscle activity. When a muscle receives a stimulus, cellular storage depots spill calcium, triggering the fibers to contract and generate force. An ion pump called SERCA then starts to return the calcium to storage, allowing the muscle fibers to relax. Myoregulin binds to and inhibits SERCA, Olson's team found. The effect limits how often a mouse's muscles can contract—perhaps ensuring that the animal has muscle power in reserve for an emergency, such as escaping a predator. Another small protein, DWORF, has the opposite effect, unleashing SERCA and enabling the muscle to contract repeatedly.
Even extensively studied organisms such as the intestinal bacterium Escherichia coli harbor unexpected small proteins that have important functions. Storz and her team reported in 2012 that a previously undiscovered 49–amino-acid protein called AcrZ helps the microbe survive some antibiotics by stimulating a pump that expels the drugs.
And the venom produced by a variety of organisms—including spiders, centipedes, scorpions, and poisonous mollusks—teems with tiny proteins. Many venom components disable or kill by blocking the channels for sodium or other ions that are necessary for transmission of nerve impulses. Small proteins "hit these ion channels with amazing specificity and potency," King says. "They are the major components of venoms and are responsible for most of the pharmacological and biological effects."
Australia's giant fish-killing water bug, for instance, doesn't just rely on sharp claws and lancelike mouthparts to subdue prey. It injects its victims with a brew of more than 130 proteins, 15 of which have fewer than 100 amino acids, King and colleagues reported last year.
UNLIKE HULKING PROTEINS such as antibodies, microproteins delivered by pill or injection may be able to slip into cells and alter their functions. Captopril, the first of a class of drugs for high blood pressure known as angiotensin-converting enzyme inhibitors was developed from a small protein in the venom of a Brazilian pit viper. But the drug, which the Food and Drug Administration approved for sale in the United States in 1981, was discovered by chance, before scientists recognized small proteins as a distinct group. So far, only a few microproteins have reached the market or clinical trials.
Cancer researchers are trying to capitalize on a microprotein in the poison of the deathstalker scorpion (Leiurus quinquestriatus) of Africa and the Middle East. The molecule has a mysterious attraction to tumors. By fusing it to a fluorescent dye, scientists hope to illuminate the borders of brain tumors so that surgeons can safely cut out the cancerous tissue. "It lights up the tumor. You can see the margins and if there are any metastases," King says. A clinical trial is now evaluating whether the dual molecule can help surgeons remove brain tumors in children.
How important small proteins will be for medicine is still unknown, but they have already upended several biological assumptions. Geneticist Norbert Hübner of the Max Delbrück Center for Molecular Medicine in Berlin and colleagues found dozens of new microproteins in human heart cells. The group traced them to an unexpected source: short sequences within long noncoding RNAs, a variety that was thought not to produce proteins. After identifying 169 long noncoding RNAs that were probably being read by ribosomes, Hübner and his team used a type of mass spectrometry to confirm that more than half of them yielded microproteins in heart cells, a result reported earlier this year in Cell.
Bacteria such as Escherichia coli also churn out many microproteins, although their functions remain unclear in many cases. /
The DNA sequences for other tiny proteins also occur in unconventional locations. For example, some lie near the ORFs for bigger proteins. Researchers previously thought those sequences helped manage the production of the larger proteins, but rarely gave rise to proteins themselves. Some coding sequences for recently discovered microproteins are even nested within sequences that encode other, longer proteins.
Those genomic surprises could illuminate how new genes arise, says evolutionary systems biologist Anne-Ruxandra Carvunis of the University of Pittsburgh in Pennsylvania. Researchers had thought most new genes emerge when existing genes duplicate or fuse, or when species swap DNA. But to Carvunis, microproteins suggest protogenes can form when mutations create new start and stop signals in a noncoding portion of the genome. If the resulting ORF produces a beneficial protein, the novel sequences would remain in the genome and undergo natural selection, eventually evolving into larger genes that code for more complex proteins.
In a 2012 study, Carvunis, who was then a postdoc in the lab of Marc Vidal at the Dana-Farber Cancer Institute in Boston, and colleagues found that yeast translate more than 1000 short ORFs into proteins, implying that these sequences are protogenes. In a new study, Carvunis and her team tested whether young ORFs can be advantageous for cells. They genetically altered yeast to boost output of 285 recently evolved ORFs, most of which code for molecules that are smaller than the standard protein cutoff or just over it. For almost 10% of the proteins, increasing their levels enhanced cell growth in at least one environment. The results, posted on the preprint server bioRxiv, suggest these sequences could be on their way to becoming full-fledged genes, Carvunis says.
Slavoff still recalls being astonished when, during her interview for a postdoc position with Saghatelian, he asked whether she would be willing to go hunting for small proteins. "I had never thought that there could be this whole size of proteins that was dark to us until then."
But the bet paid off—she now runs her own lab that is searching for microproteins. Recently, she unleashed some of her postdocs and graduate students on one of the most studied organisms, the K12 strain of E. coli. The team soon uncovered five new microproteins. "We are probably only scratching the surface," she says.
ITALIANO
I topi fanno vergognare i corridori umani. Nonostante faccia passi da gigante, i roditori possono registrare 10 o più chilometri a notte su una ruota degli esercizi. Ma i topi che il biologo muscolare Eric Olson del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas a Dallas e i colleghi hanno svelato nel 2015 si sono distinti. Su un tapis roulant, i topi potevano raggiungere un ripido grado del 10% per circa 90 minuti prima di vacillare, il 31% in più rispetto agli altri roditori. Quei topi di ferro differivano dalle controparti solo in un piccolo modo: i ricercatori avevano alterato geneticamente gli animali per non avere una proteina muscolare. Ciò è bastato a scatenare prestazioni muscolari superiori. "È come se avessi tolto i freni", dice Olson.
Altrettanto sorprendente era la natura della proteina cruciale. I muscoli ospitano alcune proteine gigantesche. La distrofina, una proteina strutturale il cui gene può trasportare mutazioni che causano la distrofia muscolare, ha più di 3600 aminoacidi. La titina, che agisce come una molla per dare elasticità ai muscoli, è la proteina più grande conosciuta, con oltre 34.000 aminoacidi. La proteina disabilitata nei topi ha un valore irrisorio 46. Sebbene i ricercatori abbiano sondato il funzionamento dei muscoli per oltre 150 anni, hanno completamente perso l'enorme impatto che questa minuscola proteina, chiamata miorgulina, ha sulla funzione muscolare.
Olson e i suoi colleghi non erano i soli a essere accecati dalle proteine lillipuziane. Come ora gli scienziati realizzano, le loro regole iniziali per l'analisi dei genomi discriminavano l'identificazione di quelle molecole di dimensioni pari a una pinta. Ora, criteri più ampi e metodi di rilevazione migliori stanno scoprendo migliaia di proteine minuscole, non solo nei topi, ma in molte altre specie, inclusi gli umani. "Per la prima volta, stiamo per esplorare questo universo di nuove proteine", afferma il biochimico Jonathan Weissman dell'Università della California, San Francisco.
I biologi stanno appena iniziando ad approfondire le funzioni di quelle molecole, chiamate microproteine, micropeptidi o miniproteine. Ma le loro dimensioni ridotte sembrano consentire loro di inceppare i complessi meccanismi delle proteine più grandi, inibendo alcuni processi cellulari e liberandone altri. I primi risultati suggeriscono che le microproteine rafforzano il sistema immunitario, controllano la distruzione di molecole di RNA difettose, proteggono i batteri dal caldo e dal freddo, dettano quando le piante fioriscono e forniscono il punch tossico per molti tipi di veleno. "Probabilmente ci saranno piccole [proteine] coinvolte in tutti i processi biologici. Non le abbiamo mai cercate prima", afferma il biochimico Alan Saghatelian del Salk Institute for Biological Studies di San Diego, California.
Le piccole proteine promettono anche di rivedere l'attuale comprensione del genoma. Molti sembrano essere codificati in tratti di DNA - e RNA - che non si pensava aiutassero a costruire proteine di alcun tipo. Alcuni ricercatori ipotizzano che i brevi tratti del DNA potrebbero essere geni appena nati, in procinto di evolversi in geni più grandi che producono proteine a grandezza naturale. Grazie in parte alle piccole proteine, "Dobbiamo ripensare a cosa sono i geni", afferma la microbiologa e biologa molecolare Gisela Storz del National Institute of Child Health and Human Development di Bethesda, Maryland.
Nonostante i rimanenti misteri, gli scienziati stanno già testando i potenziali usi delle molecole. Una società vende insetticidi derivati da piccole proteine nel veleno di un ragno australiano a ragnatela. E una sperimentazione clinica sta valutando un agente di imaging basato su un'altra minuscola proteina nel veleno di scorpione, progettato per evidenziare i bordi dei tumori in modo che i chirurghi possano rimuoverli con maggiore precisione. Molte compagnie farmaceutiche stanno ora cercando piccole proteine con potenziale medico, afferma il biochimico Glenn King dell'Università del Queensland a St. Lucia, in Australia. "È una delle aree in più rapida crescita."
Altre catene di aminoacidi corti, spesso chiamate peptidi o polipeptidi, abbondano nelle cellule, ma sono residui ridotti di precedenti predecessori. La miorgulina e i suoi fratelli minori, al contrario, nascono piccoli. Quanto piccoli possano essere rimane poco chiari. I moscerini della frutta si basano su una microproteina con 11 aminoacidi per far crescere le gambe normali e alcuni microbi possono estrarre proteine lunghe meno di 10 aminoacidi, osserva il genomicista microbico Ami Bhatt dell'Università di Stanford a Palo Alto, in California. Ma anche le piccole proteine più grandi non misurano proteine di dimensioni medie come l'alfa-amilasi, un enzima 496-amminoacido nella nostra saliva che rompe l'amido.
Poche proteine sono venute alla luce fino a poco tempo fa a causa di un criterio per l'identificazione dei geni stabilito circa 20 anni fa. Quando gli scienziati analizzano il genoma di un organismo, scansionano spesso alla ricerca di frame di lettura aperti (ORF), che sono sequenze di DNA delimitate da segnali che indicano ai ribosomi della cellula, alle sue linee di assemblaggio di proteine, da dove iniziare e fermarsi. In parte per evitare un diluvio di dati, i ricercatori del passato in genere escludevano qualsiasi ORF che avrebbe prodotto una proteina inferiore a 100 aminoacidi negli eucarioti o 50 aminoacidi nei batteri. Nel lievito, ad esempio, quel taglio ha limitato l'elenco di ORF a circa 6000.
Rilassare questo criterio rivela che le cellule trasportano molto più ORF. All'inizio di quest'anno, Stanford postdoc Hila Sberro Livnat, Bhatt e colleghi hanno intrappolato frammenti di genoma dai microbi che popolano quattro parti del corpo umano, compreso l'intestino e la pelle. Cercando piccoli ORF in grado di codificare proteine comprese tra cinque e 50 aminoacidi, i ricercatori hanno identificato circa 4000 famiglie di potenziali microproteine. Quasi la metà non assomiglia a proteine conosciute, ma la sequenza per un piccolo ORF ha suggerito che una proteina corrispondente risieda nei ribosomi, un suggerimento che potrebbe svolgere un ruolo fondamentale. "Non sono stati mancati solo i geni con funzioni esoteriche" quando gli scienziati hanno trascurato i piccoli ORF, afferma Bhatt. "Sono geni con funzioni fondamentali."
Per la prima volta, stiamo per esplorare questo universo di nuove proteine.
Altre cellule ospitano anche un numero enorme di ORF brevi: il lievito potrebbe produrre più di 260.000 molecole con tra due e 99 aminoacidi, per esempio. Ma le cellule quasi certamente non usano tutti quegli ORF e alcune delle stringhe di aminoacidi che producono potrebbero non essere funzionali. Nel 2011, dopo aver trovato oltre 600.000 brevi ORF nel genoma della mosca della frutta, il genetista dello sviluppo Juan Pablo Couso dell'Università del Sussex a Brighton, Regno Unito, e colleghi hanno cercato di ridurre il numero. Sostenevano che se un ORF particolare avesse una copia identica o quasi identica in una specie correlata, avrebbe avuto meno probabilità di essere spazzatura genomica. Dopo aver cercato un altro genoma di moscerini della frutta e aver analizzato altre prove che le sequenze venivano tradotte, il gruppo si è ritrovato con una cifra più gestibile di 401 ORF corti che potrebbero produrre microproteine. Ciò rappresenterebbe ancora una frazione significativa del repertorio proteico degli insetti: ospitano circa 22.000 proteine a grandezza naturale.
Weissman e colleghi hanno scoperto le microproteine in un secondo modo, attraverso un metodo che hanno inventato per determinare ampiamente quali proteine stanno producendo le cellule. Per modellare qualsiasi proteina, una cellula prima copia un gene nell'RNA messaggero. Quindi i ribosomi leggono l'mRNA e mettono insieme gli amminoacidi nell'ordine specificato. Sequenziando gli mRNA attaccati ai ribosomi, Weissman e il suo team individuano quali cellule si stanno effettivamente trasformando in proteine e dove sugli RNA un ribosoma inizia a leggere. In uno studio sulle cellule del 2011, lui e il suo team hanno applicato quel metodo di profilazione ribosoma, chiamato anche Ribo-seq, alle cellule staminali embrionali di topo e hanno scoperto che le cellule stavano producendo migliaia di proteine inaspettate, incluse molte che sarebbero scese al di sotto dei 100 aminoacidi tagliato fuori. "Era abbastanza chiaro che la comprensione standard aveva ignorato un vasto universo di proteine, molte delle quali erano brevi", afferma Weissman.
Saghatelian e i suoi colleghi hanno adottato un terzo approccio per scoprire una miniera di microproteine nelle nostre stesse cellule. I ricercatori hanno usato la spettrometria di massa, che prevede la scomposizione delle proteine in pezzi che sono ordinati per massa per produrre uno spettro distintivo per ogni proteina. Saghatelian, la sua allora postdoc Sarah Slavoff e i suoi colleghi hanno applicato il metodo alle miscele proteiche da cellule umane e quindi hanno sottratto le firme di proteine conosciute. Questo approccio ha rivelato spettri per 86 minuscole proteine precedentemente sconosciute, le più piccole lunghe solo 18 aminoacidi, hanno riferito i ricercatori nel 2013 in Nature Chemical Biology.
Essere piccoli limita le capacità di una proteina. Le proteine più grandi si piegano in forme complesse adatte a una particolare funzione, come catalizzare reazioni chimiche. Le proteine più piccole di circa 50-60 aminoacidi probabilmente non si piegano, dice il chimico Julio Camarero dell'Università della California del Sud a Los Angeles. Quindi probabilmente non sono adatti per essere enzimi o proteine strutturali.
Tuttavia, la loro dimensione ridotta apre anche opportunità. "Sono abbastanza piccoli da adattarsi ad angoli e fessure di proteine più grandi che funzionano come canali e recettori", afferma Olson. Le piccole proteine spesso condividono brevi tratti di aminoacidi con i loro partner più grandi e possono quindi legarsi e alterare l'attività di tali proteine. Le microproteine legate possono anche trasportare molecole più grandi in nuove posizioni, aiutandole ad esempio a scivolare nelle membrane cellulari.
A causa della loro attrazione per le proteine più grandi, le piccole proteine possono dare alle cellule un modo reversibile per accendere o spegnere le proteine più grandi. In uno studio del 2016 su PLOS Genetics, il biologo dello sviluppo vegetale Stephan Wenkel dell'Università di Copenaghen e colleghi hanno modificato le piante di Arabidopsis geneticamente modificate per produrre quantità extra di due piccole proteine. Le piante normalmente esplodono in fiore quando i giorni sono abbastanza lunghi, ma quando hanno prodotto in eccesso le due microproteine, la loro fioritura è stata posticipata. Le piccole proteine causarono quel ritardo bloccando una proteina pesante chiamata CONSTANS che innesca la fioritura. Legano CONSTANS ad altre proteine inibitorie che lo chiudono. "Una cellula usa cose che la aiutano a sopravvivere. Se una proteina corta fa il lavoro, va bene", afferma Saghatelian.
Tali lavori includono altre attività chiave. Nel 2016, Slavoff, Saghatelian e colleghi hanno rivelato che le cellule umane producono una proteina 68-aminoacido che hanno chiamato NoBody che può aiutare a gestire la distruzione di molecole di mRNA difettose o non necessarie. Il nome di NoBody riflette il suo ruolo nella prevenzione della formazione di corpi di elaborazione (corpi P), ammassi misteriosi nel citoplasma in cui potrebbe verificarsi la rottura dell'RNA. Quando manca la proteina, si formano più corpi P, aumentando così la distruzione dell'RNA e alterando la struttura interna della cellula. "Dimostra che le piccole proteine possono avere effetti enormi nella cellula", afferma Slavoff.
I muscoli sembrano dipendere da una varietà di microproteine. Durante lo sviluppo embrionale, le singole cellule muscolari si fondono in fibre che alimentano la contrazione. Il miomixer di 84 proteine di aminoacidi si unisce a una proteina più grande per riunire le cellule, ha riferito il team di Olson nel 2017 su Science. Senza di essa, i topi embrionali non possono formare i muscoli e sono quasi trasparenti.
Più tardi nella vita, la miogulina interviene per aiutare a regolare l'attività muscolare. Quando un muscolo riceve uno stimolo, i depositi di accumulo cellulare versano calcio, innescando le fibre per contrarsi e generare forza. Una pompa ionica chiamata SERCA inizia quindi a riportare il calcio in deposito, permettendo alle fibre muscolari di rilassarsi. La miaoregulina si lega e inibisce la SERCA, ha scoperto il team di Olson. L'effetto limita la frequenza con cui i muscoli di un topo possono contrarsi, forse garantendo che l'animale abbia la potenza muscolare in riserva per un'emergenza, come la fuga da un predatore. Un'altra piccola proteina, DWORF, ha l'effetto opposto, scatenando SERCA e permettendo al muscolo di contrarsi ripetutamente.
Anche organismi ampiamente studiati come il batterio intestinale Escherichia coli ospitano piccole proteine inaspettate che hanno importanti funzioni. Storz e il suo team hanno riferito nel 2012 che una proteina 49-amminoacido precedentemente sconosciuta chiamata AcrZ aiuta il microbo a sopravvivere ad alcuni antibiotici stimolando una pompa che espelle i farmaci.
E il veleno prodotto da una varietà di organismi - tra cui ragni, millepiedi, scorpioni e molluschi velenosi - pullula di minuscole proteine. Molti componenti del veleno disabilitano o uccidono bloccando i canali per sodio o altri ioni necessari per la trasmissione degli impulsi nervosi. Le piccole proteine "colpiscono questi canali ionici con straordinaria specificità e potenza", afferma King. "Sono i principali componenti dei veleni e sono responsabili della maggior parte degli effetti farmacologici e biologici".
Il gigantesco insetto acquatico australiano che uccide i pesci, ad esempio, non si affida solo ad artigli affilati e boccagli simili a lanci per sottomettere la preda. Inietta le sue vittime con una miscela di oltre 130 proteine, 15 delle quali hanno meno di 100 aminoacidi, secondo quanto riferito da King e colleghi l'anno scorso.
PROTEINE CHE NON HANKING HOLKING come anticorpi, microproteine rilasciate tramite pillola o iniezione possono essere in grado di scivolare nelle cellule e alterarne le funzioni. Captopril, il primo di una classe di farmaci per l'ipertensione noto come inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina è stato sviluppato da una piccola proteina nel veleno di una vipera brasiliana. Ma il farmaco, che la Food and Drug Administration approvò per la vendita negli Stati Uniti nel 1981, fu scoperto per caso, prima che gli scienziati riconoscessero le piccole proteine come un gruppo distinto. Finora, solo poche microproteine hanno raggiunto il mercato o studi clinici.
I ricercatori sul cancro stanno provando a capitalizzare una microproteina nel veleno dello scorpione del Deathstalker (Leiurus quinquestriatus) dell'Africa e del Medio Oriente. La molecola ha una misteriosa attrazione per i tumori. Fondendolo in un colorante fluorescente, gli scienziati sperano di illuminare i confini dei tumori cerebrali in modo che i chirurghi possano tagliare in sicurezza il tessuto canceroso. "Illumina il tumore. Puoi vedere i margini e se ci sono metastasi", dice King. Uno studio clinico sta ora valutando se la doppia molecola può aiutare i chirurghi a rimuovere i tumori cerebrali nei bambini.
L'importanza delle piccole proteine per la medicina è ancora sconosciuta, ma hanno già ribaltato diverse ipotesi biologiche. Il genetista Norbert Hübner del Max Delbrück Center for Molecular Medicine di Berlino e colleghi hanno trovato dozzine di nuove microproteine nelle cellule cardiache umane. Il gruppo li ha rintracciati in una fonte inaspettata: brevi sequenze all'interno di lunghi RNA non codificanti, una varietà che si pensava non producesse proteine. Dopo aver identificato 169 RNA lunghi non codificanti che probabilmente venivano letti dai ribosomi, Hübner e il suo team hanno usato un tipo di spettrometria di massa per confermare che oltre la metà di essi ha prodotto microproteine nelle cellule cardiache, un risultato riportato all'inizio di quest'anno in Cell.
Le sequenze di DNA per altre minuscole proteine si verificano anche in posizioni non convenzionali. Ad esempio, alcuni si trovano vicino agli ORF per proteine più grandi. I ricercatori in precedenza pensavano che quelle sequenze aiutassero a gestire la produzione delle proteine più grandi, ma raramente davano origine alle proteine stesse. Alcune sequenze di codifica per microproteine scoperte di recente sono addirittura nidificate all'interno di sequenze che codificano per altre proteine più lunghe.
Queste sorprese genomiche potrebbero illuminare come nascono nuovi geni, afferma la biologa dei sistemi evolutivi Anne-Ruxandra Carvunis dell'Università di Pittsburgh in Pennsylvania. I ricercatori avevano pensato che la maggior parte dei nuovi geni emergesse quando i geni esistenti si duplicano o si fondono o quando le specie scambiano il DNA. Ma per Carvunis, le microproteine suggeriscono che i protogeni possono formarsi quando le mutazioni creano nuovi segnali di inizio e fine in una porzione non codificante del genoma. Se l'ORF risultante produce una proteina benefica, le nuove sequenze rimarrebbero nel genoma e subirebbero una selezione naturale, evolvendosi infine in geni più grandi che codificano per proteine più complesse.
In uno studio del 2012, Carvunis, che era poi post-dottorato nel laboratorio di Marc Vidal presso il Dana-Farber Cancer Institute di Boston, e colleghi hanno scoperto che il lievito traduce più di 1000 brevi ORF in proteine, il che implica che queste sequenze sono protogene. In un nuovo studio, Carvunis e il suo team hanno testato se i giovani ORF possono essere vantaggiosi per le cellule. Hanno alterato geneticamente il lievito per aumentare la produzione di 285 ORF recentemente evoluti, la maggior parte dei quali codifica per molecole che sono più piccole del cutoff proteico standard o appena sopra di esso. Per quasi il 10% delle proteine, aumentando i loro livelli ha favorito la crescita cellulare in almeno un ambiente. I risultati, pubblicati sul server di prestampa bioRxiv, suggeriscono che queste sequenze potrebbero essere sulla buona strada per diventare geni a pieno titolo, afferma Carvunis.
Slavoff ricorda ancora di essere rimasto stupito quando, durante la sua intervista per una posizione postdoc con Saghatelian, le chiese se sarebbe stata disposta a cercare piccole proteine. "Non avevo mai pensato che ci potesse essere questa intera dimensione di proteine che era scura per noi fino ad allora."
Ma la scommessa è stata ripagata: ora gestisce il proprio laboratorio alla ricerca di microproteine. Di recente, ha scatenato alcuni dei suoi dottorandi e dottorandi in uno degli organismi più studiati, il ceppo K12 di E. coli. Il team ha presto scoperto cinque nuove microproteine. "Probabilmente stiamo solo graffiando la superficie", afferma.
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