Prime, il nuovo editing genomico che reinventa CRISPR / Prime, the new genomic editing that reinvents CRISPR
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Un approccio innovativo alla modifica genetica riesce a copiare alla lettera le istruzioni fornite dai ricercatori senza rompere la doppia elica del DNA e in linea di principio potrebbe correggere la quasi totalità delle mutazioni che causano malattie genetiche
Dapprima è arrivato l’editing genomico classico, e per spiegare come funziona i ricercatori hanno usato la metafora delle forbici che tagliano il DNA. Poi è stato sviluppato il base editing, e lo hanno paragonato alla correzione manuale di un testo, fatta con gomma e matita. Ora che sulla scena si affaccia un altro approccio innovativo alla modificazione genetica, come possiamo descriverlo?
“Immaginate un programma di videoscrittura al posto delle forbici e della matita”, ha detto David Liu presentando l’ultima tecnica messa a punto nel suo laboratorio al Broad Institute di Boston, durante la conferenza stampa organizzata da "Nature" per la pubblicazione del relativo articolo. Se l’ambizione ultima delle biotecnologie dell’era CRISPR è riuscire ad apportare qualunque cambiamento in qualsiasi punto del genoma, possiamo dire di esserci avvicinati all’obiettivo. La novità si chiama prime editing (la parola "prime" sta per avvio) ma è già stata soprannominata “editing trova-e-sostituisci” in omaggio alla funzione del programma di videoscrittura Word.
L’ingrediente chiave è lo stesso degli altri sistemi CRISPR, ovvero l’enzima Cas9, che ha il pregio di scorrere fino a posizionarsi nel punto prescelto del genoma. Assomiglia al cursore che lampeggia sullo schermo mentre scriviamo al computer, perché indica il punto in cui vanno a inserirsi le lettere. Nel prime editing, però, Cas9 è doppiamente programmabile oltre che accessoriata con un nuovo dominio, per poter copiare alla lettera le istruzioni fornite dai ricercatori senza tagliare e senza bisogno di fornire uno stampo aggiuntivo.
Per capire come funziona il meccanismo molecolare in dettaglio ci vuole un po’ di pazienza, ma ne vale la pena: il prime editing è così versatile che, in linea di principio, potrebbe correggere l’89 per cento delle mutazioni che causano malattie genetiche nell’uomo.
“Immaginate un programma di videoscrittura al posto delle forbici e della matita”, ha detto David Liu presentando l’ultima tecnica messa a punto nel suo laboratorio al Broad Institute di Boston, durante la conferenza stampa organizzata da "Nature" per la pubblicazione del relativo articolo. Se l’ambizione ultima delle biotecnologie dell’era CRISPR è riuscire ad apportare qualunque cambiamento in qualsiasi punto del genoma, possiamo dire di esserci avvicinati all’obiettivo. La novità si chiama prime editing (la parola "prime" sta per avvio) ma è già stata soprannominata “editing trova-e-sostituisci” in omaggio alla funzione del programma di videoscrittura Word.
Per capire come funziona il meccanismo molecolare in dettaglio ci vuole un po’ di pazienza, ma ne vale la pena: il prime editing è così versatile che, in linea di principio, potrebbe correggere l’89 per cento delle mutazioni che causano malattie genetiche nell’uomo.
Partiamo dunque dal modello più vecchio, Cas9 che abbiamo imparato a conoscere nel 2012, con lo storico lavoro di Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier. Per trovare il sito bersaglio usa una molecola guida di RNA. Poi, una volta arrivata a destinazione, recide il DNA, consentendo ai ricercatori di inattivare il gene preso di mira. Il modello successivo, il base editing sviluppato da Liu a partire dal 2016, consente correzioni mirate a livello di singola lettera e si affida a un meccanismo leggermente diverso. L’enzima Cas9 è ancora presente e resta programmabile attraverso la molecola guida, ma è stato privato delle forbici e fuso con un altro componente che converte chimicamente le lettere del DNA, cambiandone l’identità.
Peccato che su 12 tipi di conversioni possibili, sia in grado di compierne soltanto quattro. Per esempio non può trasformare la T (timina) in A (adenina), come sarebbe necessario per correggere l’anemia falciforme, e non può nemmeno operare piccole inserzioni o piccole delezioni mirate, come quella necessaria per rimuovere le quattro lettere extra nella malattia di Tay Sachs.
L’idea di progettare un nuovo modello capace di superare questi limiti è venuta al postdoc Andrew Anzalone, il primo firmatario del lavoro pubblicato su "Nature" insieme a Liu. Per prima cosa ha pensato di conferire un incarico aggiuntivo all’RNA guida. “Ho immaginato che l’RNA potesse servire anche a portare le informazioni sui cambiamenti da effettuare”, ha spiegato Anzalone. Nel prime editing, dunque, si usa un RNA detto peg (da prime editing guide) che non si limita a indicare il sito prescelto sul genoma, ma suggerisce anche quali refusi correggere. Per questo abbiamo detto che il sistema è doppiamente programmabile. Quanto all’enzima Cas9, ha le forbici disattivate come nel base editing, ma è fuso con un componente a cui finora non aveva pensato nessuno. Un enzima capace di trascrivere l’RNA in DNA, ovvero una trascrittasi inversa che legge il copione fornito dal pegRNA e lo ricopia lettera per lettera nel punto in cui si posiziona il cursore, senza bisogno di stampi aggiuntivi.
È probabile che in futuro ognuna delle tre vie all’editing troverà impieghi utili, perché ogni strumento ha i suoi punti forti e i suoi punti deboli. Ma i prime-editor sembrano destinati a primeggiare nelle applicazioni terapeutiche perché, come spiega Liu, “offrono una maggiore flessibilità nella scelta dei bersagli e maggiore precisione nell’editing”.
Peccato che su 12 tipi di conversioni possibili, sia in grado di compierne soltanto quattro. Per esempio non può trasformare la T (timina) in A (adenina), come sarebbe necessario per correggere l’anemia falciforme, e non può nemmeno operare piccole inserzioni o piccole delezioni mirate, come quella necessaria per rimuovere le quattro lettere extra nella malattia di Tay Sachs.
L’idea di progettare un nuovo modello capace di superare questi limiti è venuta al postdoc Andrew Anzalone, il primo firmatario del lavoro pubblicato su "Nature" insieme a Liu. Per prima cosa ha pensato di conferire un incarico aggiuntivo all’RNA guida. “Ho immaginato che l’RNA potesse servire anche a portare le informazioni sui cambiamenti da effettuare”, ha spiegato Anzalone. Nel prime editing, dunque, si usa un RNA detto peg (da prime editing guide) che non si limita a indicare il sito prescelto sul genoma, ma suggerisce anche quali refusi correggere. Per questo abbiamo detto che il sistema è doppiamente programmabile. Quanto all’enzima Cas9, ha le forbici disattivate come nel base editing, ma è fuso con un componente a cui finora non aveva pensato nessuno. Un enzima capace di trascrivere l’RNA in DNA, ovvero una trascrittasi inversa che legge il copione fornito dal pegRNA e lo ricopia lettera per lettera nel punto in cui si posiziona il cursore, senza bisogno di stampi aggiuntivi.
È probabile che in futuro ognuna delle tre vie all’editing troverà impieghi utili, perché ogni strumento ha i suoi punti forti e i suoi punti deboli. Ma i prime-editor sembrano destinati a primeggiare nelle applicazioni terapeutiche perché, come spiega Liu, “offrono una maggiore flessibilità nella scelta dei bersagli e maggiore precisione nell’editing”.
La parte del pegRNA che specifica la sequenza può essere progettata a piacimento, allo scopo di ottenere mutazioni puntiformi, delezioni su misura, inserzioni su misura e, volendo, tutte queste cose combinate insieme. Lavorando in vitro, Anzalone, Liu e colleghi hanno riparato le mutazioni dell'anemia falciforme e della malattia di Tay Sachs, raggiungendo rispettivamente un’efficienza del 55 per cento e del 35 per cento con pochissimi effetti indesiderati. Per testare la flessibilità del sistema, inoltre, hanno lavorato con quattro tipi di linee cellulari umane e hanno operato oltre 175 eventi di prime editing in cellule umane, tra cui 100 mutazioni puntiformi di tutti i tipi possibili, precise inserzioni lunghe fino a 44 lettere, delezioni precise lunghe fino a 80, e avrebbero potuto spingersi oltre.
A conti fatti i prime-editor non sbagliano quasi mai bersaglio e operano con una specificità sorprendente in corrispondenza del sito prescelto, grazie al particolare meccanismo di azione che prevede un maggior numero di appaiamenti con il DNA rispetto all’editing classico. In pratica l’upgrade ha fornito un sistema di sicurezza ridondante che offre più opportunità per bloccare il processo se qualcosa non torna.
Ora bisognerà ottimizzare il prime editing per il maggior numero possibile di specie e linee cellulari, oltre a individuare i vettori più adatti per trasportare i prime-editor dentro le cellule (Liu e colleghi finora hanno usato con successo transfezione e lentivirus). Per essere soltanto il primo lavoro, comunque, è uno splendido inizio e Liu è fiducioso: “La comunità dell'editing è vibrante, penso che nei prossimi mesi centinaia se non migliaia di ricercatori proveranno a usare il prime editing contribuendo al suo sviluppo”.
A conti fatti i prime-editor non sbagliano quasi mai bersaglio e operano con una specificità sorprendente in corrispondenza del sito prescelto, grazie al particolare meccanismo di azione che prevede un maggior numero di appaiamenti con il DNA rispetto all’editing classico. In pratica l’upgrade ha fornito un sistema di sicurezza ridondante che offre più opportunità per bloccare il processo se qualcosa non torna.
Ora bisognerà ottimizzare il prime editing per il maggior numero possibile di specie e linee cellulari, oltre a individuare i vettori più adatti per trasportare i prime-editor dentro le cellule (Liu e colleghi finora hanno usato con successo transfezione e lentivirus). Per essere soltanto il primo lavoro, comunque, è uno splendido inizio e Liu è fiducioso: “La comunità dell'editing è vibrante, penso che nei prossimi mesi centinaia se non migliaia di ricercatori proveranno a usare il prime editing contribuendo al suo sviluppo”.
ENGLISH
An innovative approach to genetic modification is able to literally copy the instructions provided by researchers without breaking the double helix of DNA and in principle could correct almost all of the mutations that cause genetic diseases
First came the classical genomic editing, and to explain how it works, the researchers used the metaphor of scissors that cut DNA. Then the basic editing was developed, and compared it to the manual correction of a text, made with rubber and pencil. Now that another innovative approach to genetic modification appears on the scene, how can we describe it?
"Imagine a word processing program instead of scissors and pencil," said David Liu, presenting the latest technique developed in his laboratory at the Broad Institute in Boston, during a press conference organized by "Nature" for the publication of the related article. If the ultimate ambition of the biotechnology of the CRISPR era is to succeed in making any change anywhere in the genome, we can say that we have moved closer to the goal. The novelty is called prime editing (the word "prime" is about to start) but has already been dubbed "find-and-replace editing" as a tribute to the Word word processing program function.
The key ingredient is the same as in the other CRISPR systems, or the Cas9 enzyme, which has the advantage of flowing up to position itself in the chosen point of the genome. It looks like the cursor that flashes on the screen as we write to the computer, because it indicates where the letters go. In the first editing, however, Cas9 is doubly programmable as well as equipped with a new domain, to be able to literally copy the instructions provided by the researchers without cutting and without needing to provide an additional mold.
To understand how the molecular mechanism works in detail it takes a little patience, but it's worth it: the first editing is so versatile that, in principle, it could correct 89 percent of the mutations that cause genetic diseases in the 'man.
Let's start with the older model, Cas9 that we learned about in 2012, with the historic work of Jennifer Doudna and Emmanuelle Charpentier. To find the target site use a guiding RNA molecule. Then, once it reaches its destination, it cuts the DNA, allowing the researchers to inactivate the targeted gene. The next model, the basic editing developed by Liu starting in 2016, allows targeted corrections at the single letter level and relies on a slightly different mechanism. The Cas9 enzyme is still present and remains programmable through the guide molecule, but it has been deprived of scissors and fused with another component that chemically converts the letters of the DNA, changing its identity.
Too bad that out of 12 types of conversions possible, you can only perform four. For example, it cannot transform T (thymine) into A (adenine), as would be necessary to correct sickle cell anemia, and it cannot even make small insertions or small targeted deletions, such as that necessary to remove the four extra letters in the disease of Tay Sachs.
The idea of designing a new model capable of overcoming these limitations came to the post-doc Andrew Anzalone, the first signer of the work published in "Nature" together with Liu. First he thought of giving an additional assignment to the guide RNA. "I imagined that RNA could also be used to bring information about changes to be made," explained Anzalone. In the first editing, therefore, we use an RNA called peg (from the first editing guide) which does not just indicate the site chosen on the genome, but also suggests which typographical errors to correct. This is why we have said that the system is doubly programmable. As for the Cas9 enzyme, it has the scissors disabled as in the basic editing, but it is merged with a component that no one had thought of before. An enzyme capable of transcribing RNA into DNA, which is a reverse transcriptase that reads the script provided by pegRNA and recreates it letter by letter at the point where the cursor is positioned, without the need for additional molds.
It is likely that in the future each of the three ways to editing will find useful uses, because each instrument has its strengths and its weaknesses. But the first editors seem destined to excel in therapeutic applications because, as Liu explains, "they offer greater flexibility in the choice of targets and greater precision in editing".
The part of the pegRNA that specifies the sequence can be designed at will, in order to obtain point mutations, customized deletions, customized insertions and, if desired, all these things combined together. Working in vitro, Anzalone, Liu and colleagues repaired mutations in sickle cell disease and Tay Sachs disease, reaching an efficiency of 55 percent and 35 percent respectively with very few side effects. Furthermore, to test the flexibility of the system, they worked with four types of human cell lines and operated over 175 first editing events in human cells, including 100 point mutations of all possible types, precise insertions up to 44 letters long, precise deletions up to 80, and could have gone further.
On balance the prime-editors almost never make a mistake and operate with a surprising specificity at the chosen site, thanks to the particular mechanism of action that foresees a greater number of pairing with DNA compared to classic editing. In practice the upgrade has provided a redundant security system that offers more opportunities to block the process if something does not come back.
Now the first editing needs to be optimized for as many species and cell lines as possible, as well as identifying the most suitable vectors to carry the first-editors into the cells (Liu and colleagues have so far successfully used transfection and lentiviruses). To be just the first job, however, is a wonderful start and Liu is confident: "The editing community is vibrant, I think that in the coming months hundreds, if not thousands of researchers will try to use the first editing contributing to its development".
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