A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection. / Un metodo multi-attributo di massa accurato ad alta risoluzione per il monitoraggio degli attributi di qualità critica e il rilevamento di nuovi picchi.
A high-resolution accurate mass multi-attribute method for
critical quality attribute monitoring and new peak detection. The procedure of the ENEA RM2012A00067 patent is very useful in this application. / Un metodo multi-attributo di massa accurato ad alta risoluzione per il monitoraggio degli attributi di qualità critica e il rilevamento di nuovi picchi. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A00067 è molto utile in questa applicazione.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
The aim is to develop a high-resolution accurate mass (HRAM) multi-attribute method (MAM) for the analysis of monoclonal antibody (mAb) critical quality attributes (CQAs).We will describe the optimization and application of the Thermo Scientific™ HR MultiAttribute Method as a complete workflow to monitor CQAs of the NISTmAb standard, including glycosylation, deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, C-terminal lysine truncation, N-terminal pyroglutamate, and glycation, under normal and stressed conditions. In addition, we will demonstrate the capability of the HR MAM workflow for new peak detection (NPD) using spiked and stressed samples. The importance of HRAM in CQA quantitation and NPD will be discussed. Introduction In accordance with Quality by Design (QbD) principles outlined by regulatory agencies, it is essential for the biopharmaceutical industry to identify, quantify, and monitor potential CQAs and impurities of protein therapeutics during process development and lot release. Traditionally, a variety of separation techniques such as hydrophilic-interaction liquid chromatography (HILIC), size-exclusion chromatography (SEC), cation-exchange chromatography (CEX), capillary electrophoresis (CE), and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) are used in conjunction with ultraviolet (UV) spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to comprehensively measure these attributes and assess purity. In 2015, Rogers et al.1 developed the MAM, taking advantage of the HRAM capabilities of Orbitrap-based MS detection for simultaneous identification, quantitation, and monitoring of product quality attributes (PQAs) of two antibodies, Mab1 (IgG1) and anti-streptavidin IgG2. It was also demonstrated that MAM is well suited for NPD, enabling new peaks (“impurities”) to be identified when comparing to a reference.2 It was proposed that MAM could replace several conventional methods used in quality control (QC) for lot release of drugs. Since MAM was introduced, it has gained popularity and acceptance in the biopharma industry, featuring as a hot topic in many recent conferences. In this application note, we describe the HR MAM workflow developed using the Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus hybrid quadrupole-Orbitrap™ mass spectrometer and Thermo Scientific™ Vanquish™ Horizon UHPLC system combined with Thermo Scientific™ Chromeleon™ 7.2.10 Chromatography Data System (CDS) and Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 3.1 software for user intuitive data processing and reporting.
The HRAM capability of Orbitrap mass spectrometers promotes resolution of overlapping peaks, ensures precise peak integration, and enables accurate CQA quantitation using MS full scan data. At a resolution setting of <140,000, ions with similar m/z, for example, the monoisotopic peak of a deamidated peptide and the C13 peak of the wild type form, may overlap or even merge into a single peak. This negatively influences mass accuracy and results in incorrect peak integration. At a resolution setting of 70,000, the B0 peak of deamidated HYNPSLK completely overlaps with the A1 peak of the wild type form, resulting in the absence of this isotope in the peak integration window. At even lower resolution setting of 35,000, all three isotopes of the deamidated peptide (B0-B2) overlap with the neighboring isotopes of the wild type form (A1-A3). Only the very low abundant fourth isotope of the deamidated form was integrated. An Orbitrap resolution setting of 140,000, however, can resolve the isotopes of the low abundance deamidated peptide from the abundant native form. Therefore, the first four isotopes of the deamidated peptide generated suitable XICs, using an 8 ppm mass tolerance, enabling accurate quantitation of this CQA Due to significant increase in the level of deamidation, it is more obvious to see the isotopes of the deamidated forms (B0-B2) that are resolved from the neighboring isotopes (A1-A3) of the wild type form. This is an excellent example that highlights the importance of high resolution in CQA quantitation. There were also other examples in the NISTmAb digest where the isotopes of two peptides have very close m/z. In such cases, inaccurate quantitation was obtained for the data acquired at a resolution setting of <140,000 because the overlapped isotopes could not be resolved and extracted properly. High mass accuracy also serves to improve peak extraction and integration In the case of 10 ppm extraction, the wild type form of this peptide dominated the XIC, which led to an incorrect peak integration when the Component Match was set to Greatest. By comparison, the wild type form was not evident in the XIC of the deamidated form when a 5 ppm extraction was used. It should be noted that Peak A in the 10 ppm XIC can be correctly integrated in the presence of abundant Peak B by using the Component Match = Nearest or by setting a narrow RT window, again demonstrating the versatility of peak integration in Chromeleon software.
New Peak Detection (NPD)
In addition to detection and quantitation of known quality attributes, an essential component of the HR MAM workflow is detection of new features, including potential unknowns and impurities.. Generally, the maximum number of frames (potential new features) can be set to the maximum value of 16,000 with minimal impact on computing duty cycle. The frame width in mass accuracy (ppm) can be set to 10 ppm (±5 ppm) given the observed Orbitrap mass accuracy, while the width in RT (min) depends upon the chromatographic performance. The most critical parameter is the Peak Intensity Threshold. This value must be carefully chosen based on not only the intensity of the total ion or base peak chromatogram but also on the question to be answered. Setting a very low threshold may greatly increase the chance of finding false positives. With careful testing and benchmarking, this threshold value could be used for purity test and lot release. The detected features were filtered with the settings shown in Table 4. Briefly, only features with an identified monoisotopic mass (PR Element = 0) and at least one additional isotope (PR Size > 1) for charge state +2 were considered. Finally, those features not showing significant change relative to the reference injection were filtered out.
A ratio of 1000 was used to filter the result of the NISTmAb + PRTC data as PRTC peptides were absent in the reference data (control). For stressed samples, a minimum ratio of 20 was applied to the result to identify the features with a significant fold change from the reference. Among the control samples, both replicate digests and replicate injections (using the first injection from the first digest as the reference) revealed no significant changes, as expected. To act as a positive control for NPD, the PRTC was spiked into NISTmAb digest at a concentration of 500 fmol/µL. All 15 PRTC peptides were detected using the non-targeted MS processing feature in Chromeleon software. The ratio of all PRTC peptides in the spiked vs. control samples were >10,000, except SAAGAFGPELSR, whose abundance was ~1000 times higher in the spiked sample than in the control. The second isotope of a low abundant +5 peak with an m/z nearly identical to SAAGAFGPELSR was present in the control sample, making the measured ratio lower than it should be. This indicates that caution must be taken to set the threshold for NPD, as some ratios may be under-represented due to interfering peaks. This is particularly concerning with low resolution, low mass. D315 isomerization of VVSVLTVLHQDWLNGK in the control (top panels) and thermally stressed (bottom panels) NISTmAb digests. XICs (left panels) are shown at the same scale. Mass spectra (right panels) as recorded at apex RT. D315 isomerization was negligible in the control sample (top panels). By contrast, its abundance was significantly increased under a thermally stressed condition (bottom panels). Control Thermal Stress Retention Time (min) Intensity (counts) m/z (Da) Relative Intensity Retention Time (min) Intensity (counts) m/z (Da) Relative Intensity 19 accuracy instruments. However, the HRAM feature of the Thermo Scientific HR MAM workflow helps minimize the occurrence of any interferences, thus improving the confidence in NPD. It should be noted that some impurities already present in PRTC were also detected as new peaks.
The NPD strategy described above can be applied to the stressed NISTmAb samples to detect “new” or dramatically changing peptides. Most of these correspond to deamidation and isomerization in the thermally stressed sample and oxidation in the oxidatively stressed sample.
The Thermo Scientific HR MAM workflow provides the robustness, flexibility, specificity, and sensitivity to not only identify PQAs and quantify multiple CQAs simultaneously, but also detect new features associated with changes induced by sample preparation, storage, and processing. The HRAM ability of the Q Exactive Plus mass spectrometer makes it possible to resolve species that would otherwise be overlapped, leading to accurate CQA quantitation and reliable NPD. This, combined with the robust separation offered by the Vanquish Horizon UHPLC system and Accucore Vanquish C18+ column, produces reproducible results that can be confidently submitted for review by regulatory agencies. BioPharma Finder software offers rapid peptide mapping, easy CQA selection, and accurate quantitation in a non-compliant environment. The seamless transition from BioPharma Finder software to Chromeleon software through a workbook, enables CQA quantitation and monitoring, as well as NPD, to be performed within a compliant GMP environment. This combination of software utilization provides flexibility in the different phases of drug development and release. It should be emphasized that Chromeleon software affords a comprehensive and fully realized GMP-compliant environment; from instrument configuration, calibration, and tuning through data acquisition, processing and reporting is fully audited with restricted user roles and signatory requirements. As the MAM gains in popularity and recognition within the biopharmaceutical industry and with the regulatory agencies, the workflow described herein can serve as useful guidance for those who are using, or wish to use, this technology in different phases of drug development and QC.
ITALIANO
L'obiettivo è sviluppare un metodo multi-attributo di massa accurata (HRAM) ad alta risoluzione (MAM) per l'analisi degli attributi di qualità critica (CQA) di anticorpi monoclonali (mAb). Descriveremo l'ottimizzazione e l'applicazione di Thermo Scientific ™ HR Metodo MultiAttribute come flusso di lavoro completo per monitorare i CQA dello standard NISTmAb, tra cui glicosilazione, deamidazione, isomerizzazione, formazione di succinimide, ossidazione, lisina C-terminale, pirocutammato N-terminale e glicazione, in condizioni normali e stressate. Inoltre, dimostreremo la capacità del flusso di lavoro MAM delle risorse umane per il nuovo rilevamento di picco (NPD) utilizzando campioni a spillo e stressati. Verrà discussa l'importanza di HRAM nella quantificazione CQA e NPD. Introduzione In conformità con i principi di Quality by Design (QbD) delineati dalle agenzie di regolamentazione, è essenziale per l'industria biofarmaceutica identificare, quantificare e monitorare i potenziali CQA e le impurità delle terapie proteiche durante lo sviluppo del processo e il rilascio dei lotti. Tradizionalmente, un varietà di tecniche di separazione come cromatografia liquida ad interazione idrofila (HILIC), cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), cromatografia a scambio cationico (CEX), elettroforesi capillare (CE) e cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) sono usati in combinazione con la spettroscopia ultravioletta (UV), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per misurare in modo completo questi attributi e valutare la purezza. Nel 2015, Rogers et al.1 hanno sviluppato il MAM, sfruttando le capacità HRAM del rilevamento MS basato su Orbitrap per l'identificazione simultanea, la quantificazione e il monitoraggio degli attributi di qualità del prodotto (PQA) di due anticorpi, Mab1 (IgG1) e anti- streptavidina IgG2. È stato anche dimostrato che MAM è adatto per NPD, consentendo di identificare nuovi picchi ("impurità") quando si confronta con un riferimento.2 È stato proposto che MAM potesse sostituire diversi metodi convenzionali utilizzati nel controllo di qualità (QC) per il rilascio dei lotti di droghe. Da quando è stato introdotto il MAM, ha guadagnato popolarità e accettazione nel settore biofarmaceutico, presentandosi come argomento caldo in molte recenti conferenze. In questa nota di applicazione, descriviamo il flusso di lavoro MAM delle risorse umane sviluppato utilizzando lo spettrometro di massa ibrido quadrupolo-Orbitrap ™ Thermo Scientific ™ Q Exactive ™ Plus e il sistema Thermo Scientific ™ Vanquish ™ Horizon UHPLC combinato con il sistema di dati cromatografici Thermo Scientific ™ Chromeleon ™ 7.2.10 (CDS) e il software Thermo Scientific ™ BioPharma Finder ™ 3.1 per l'elaborazione e la reportistica intuitiva dell'utente.
La capacità HRAM degli spettrometri di massa Orbitrap promuove la risoluzione di picchi sovrapposti, garantisce una precisa integrazione dei picchi e consente una quantificazione accurata del CQA utilizzando i dati di scansione completa MS. Con un'impostazione di risoluzione <140.000, ioni con m / z simili, ad esempio, il picco monoisotopico di un peptide deamidato e il picco C13 nella forma di tipo selvaggio, possono sovrapporsi o persino fondersi in un singolo picco. Ciò influenza negativamente l'accuratezza della massa e si traduce in un'integrazione di picco errata. Con un'impostazione di risoluzione di 70.000, il picco B0 di HYNPSLK deamidato si sovrappone completamente al picco A1 nella forma di tipo selvaggio, causando l'assenza di questo isotopo nella finestra di integrazione del picco. Con una risoluzione ancora più bassa di 35.000, tutti e tre gli isotopi del peptide deamidato (B0-B2) si sovrappongono agli isotopi vicini della forma selvaggia (A1-A3). È stato integrato solo il quarto isotopo abbondante molto basso della forma deamidata. Un'impostazione di risoluzione Orbitrap di 140.000, tuttavia, può risolvere gli isotopi del peptide deamidato a bassa abbondanza dalla forma nativa abbondante. Pertanto, i primi quattro isotopi del peptide deamidato hanno generato XIC adatti, usando una tolleranza di massa di 8 ppm, consentendo una quantificazione accurata di questo CQA A causa del significativo aumento del livello di deamidazione, è più ovvio vedere gli isotopi delle forme deamidate ( B0-B2) che vengono risolti dagli isotopi vicini (A1-A3) della forma wild type. Questo è un eccellente esempio che evidenzia l'importanza dell'alta risoluzione nella quantificazione del CQA. C'erano anche altri esempi nel digest NISTmAb in cui gli isotopi di due peptidi hanno m / z molto vicini. In tali casi, è stata ottenuta una quantificazione imprecisa per i dati acquisiti con una risoluzione <140.000 perché gli isotopi sovrapposti non potevano essere risolti ed estratti correttamente. L'elevata precisione di massa serve anche a migliorare l'estrazione e l'integrazione del picco Nel caso dell'estrazione di 10 ppm, la forma selvaggia di questo peptide dominava l'XIC, il che portava a un'integrazione di picco errata quando Component Match era impostato su Greatest.
In confronto, la forma di tipo selvaggio non era evidente nell'XIC della forma deamidata quando veniva usata un'estrazione di 5 ppm. Va notato che il picco A nella XIC a 10 ppm può essere correttamente integrato in presenza di un picco B abbondante utilizzando Component Match = più vicino o impostando una finestra RT stretta, dimostrando ancora una volta la versatilità dell'integrazione dei picchi nel software Chromeleon.
New Peak Detection (NPD)
Oltre al rilevamento e alla quantificazione di attributi di qualità noti, un componente essenziale del flusso di lavoro di HR MAM è il rilevamento di nuove funzionalità, tra cui potenziali incognite e impurità. Generalmente, il numero massimo di frame (potenziali nuove funzionalità) può essere impostato al massimo valore di 16.000 con un impatto minimo sul duty cycle informatico. La larghezza del fotogramma in precisione di massa (ppm) può essere impostata su 10 ppm (± 5 ppm) data l'accuratezza di massa osservata di Orbitrap, mentre la larghezza in RT (min) dipende dalle prestazioni cromatografiche. Il parametro più critico è la soglia di intensità di picco. Questo valore deve essere scelto con cura in base non solo all'intensità del cromatogramma di picco ionico o di base, ma anche alla domanda a cui rispondere. Impostare una soglia molto bassa può aumentare notevolmente la possibilità di trovare falsi positivi. Con test e benchmarking accurati, questo valore di soglia potrebbe essere utilizzato per il test di purezza e il rilascio dei lotti. Le caratteristiche rilevate sono state filtrate con le impostazioni mostrate nella Tabella 4. In breve, sono state considerate solo le caratteristiche con una massa monoisotopica identificata (elemento PR = 0) e almeno un isotopo aggiuntivo (dimensione PR> 1) per lo stato di carica +2. Infine, sono state filtrate quelle caratteristiche che non mostravano cambiamenti significativi rispetto all'iniezione di riferimento.
È stato utilizzato un rapporto di 1000 per filtrare il risultato dei dati NISTmAb + PRTC poiché i peptidi PRTC erano assenti nei dati di riferimento (controllo). Per i campioni sottoposti a stress, è stato applicato un rapporto minimo di 20 al risultato per identificare le caratteristiche con una variazione significativa della piega rispetto al riferimento. Tra i campioni di controllo, sia replicare i digest che replicare le iniezioni (usando la prima iniezione dal primo digest come riferimento) non hanno rivelato cambiamenti significativi, come previsto. Per agire come controllo positivo per NPD, il PRTC è stato aggiunto al digest NISTmAb ad una concentrazione di 500 fmol / µL. Tutti e 15 i peptidi PRTC sono stati rilevati utilizzando la funzionalità di elaborazione MS non mirata nel software Chromeleon. Il rapporto di tutti i peptidi PRTC nei campioni addizionati rispetto al controllo era> 10.000, ad eccezione di SAAGAFGPELSR, la cui abbondanza era ~ 1000 volte superiore nel campione addizionato rispetto al controllo. Il secondo isotopo di un picco +5 basso e abbondante con un m / z quasi identico a SAAGAFGPELSR era presente nel campione di controllo, rendendo il rapporto misurato inferiore a quello che dovrebbe essere. Ciò indica che è necessario prestare attenzione per impostare la soglia per NPD, poiché alcuni rapporti potrebbero essere sottorappresentati a causa di picchi interferenti. Ciò riguarda in particolare la bassa risoluzione, la massa ridotta. . Isomerizzazione D315 di VVSVLTVLHQDWLNGK nei digest NISTmAb di controllo (pannelli superiori) e sollecitati termicamente (pannelli inferiori). Gli XIC (pannelli di sinistra) sono mostrati sulla stessa scala. Spettri di massa (pannelli di destra) registrati all'apice RT. L'isomerizzazione D315 era trascurabile nel campione di controllo (pannelli superiori). Al contrario, la sua abbondanza è stata notevolmente aumentata in condizioni di stress termico (pannelli inferiori). Controllo del tempo di ritenzione dello stress termico (min) Intensità (conteggi) m / z (Da) Tempo di ritenzione dell'intensità relativa (min) Intensità (conteggi) m / z (Da) Strumenti di precisione dell'intensità relativa 19. Tuttavia, la funzionalità HRAM del flusso di lavoro MAM Thermo Scientific HR aiuta a ridurre al minimo l'insorgenza di eventuali interferenze, migliorando così la fiducia nel NPD. Va notato che alcune impurità già presenti nel PRTC sono state rilevate anche come nuovi picchi.
La strategia NPD sopra descritta può essere applicata ai campioni NISTmAb stressati per rilevare peptidi "nuovi" o che cambiano drasticamente. La maggior parte di questi corrisponde alla deamidazione e all'isomerizzazione nel campione sottoposto a stress termico e all'ossidazione nel campione sottoposto a stress ossidativo.
l flusso di lavoro HR MAM di Thermo Scientific HR offre la robustezza, la flessibilità, la specificità e la sensibilità non solo per identificare i PQA e quantificare simultaneamente più CQA, ma anche per rilevare nuove funzionalità associate alle modifiche indotte dalla preparazione, conservazione ed elaborazione dei campioni. La capacità HRAM dello spettrometro di massa Q Exactive Plus consente di risolvere specie che altrimenti sarebbero sovrapposte, portando a un'accurata quantificazione CQA e NPD affidabile. Questo, combinato con la solida separazione offerta dal sistema UHPLC di Vanquish Horizon e dalla colonna Accucore Vanquish C18 +, produce risultati riproducibili che possono essere sottoposti con fiducia alla revisione da parte delle agenzie di regolamentazione. Il software BioPharma Finder offre una rapida mappatura dei peptidi, una facile selezione del CQA e una quantificazione accurata in un ambiente non conforme. La transizione senza soluzione di continuità dal software BioPharma Finder al software Chromeleon attraverso una cartella di lavoro, consente la quantificazione e il monitoraggio CQA, nonché NPD, da eseguire in un ambiente GMP conforme. Questa combinazione di utilizzo del software offre flessibilità nelle diverse fasi di sviluppo e rilascio dei farmaci. Va sottolineato che il software Chromeleon offre un ambiente completo e pienamente conforme a GMP; dalla configurazione dello strumento, calibrazione e messa a punto attraverso l'acquisizione, l'elaborazione e il reporting dei dati è completamente verificato con ruoli utente e requisiti di firma limitati. Man mano che il MAM guadagna popolarità e riconoscimento nell'industria biofarmaceutica e con le agenzie di regolamentazione, il flusso di lavoro qui descritto può servire come guida utile per coloro che utilizzano o desiderano utilizzare questa tecnologia in diverse fasi di sviluppo di farmaci e controllo di qualità.
Da:
https://cdn2.hubspot.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Kris/Dec2019/TechNet%20Nov%20Landing%20Page%20App%20Note%20(NPI%20Umbrella%20Campaign-Pharma).pdf?__hssc=8807082.1.1577725871945&__hstc=8807082.558ad6d71c3ee064f4b96870056cb835.1567813370466.1577719094455.1577725871945.117&__hsfp=2895542814&hsCtaTracking=ab3f4725-73a4-4e01-8111-e8dc87d08111%7C4d9e3190-74fa-4ec2-8542-c82fb7418fbd
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
The aim is to develop a high-resolution accurate mass (HRAM) multi-attribute method (MAM) for the analysis of monoclonal antibody (mAb) critical quality attributes (CQAs).We will describe the optimization and application of the Thermo Scientific™ HR MultiAttribute Method as a complete workflow to monitor CQAs of the NISTmAb standard, including glycosylation, deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, C-terminal lysine truncation, N-terminal pyroglutamate, and glycation, under normal and stressed conditions. In addition, we will demonstrate the capability of the HR MAM workflow for new peak detection (NPD) using spiked and stressed samples. The importance of HRAM in CQA quantitation and NPD will be discussed. Introduction In accordance with Quality by Design (QbD) principles outlined by regulatory agencies, it is essential for the biopharmaceutical industry to identify, quantify, and monitor potential CQAs and impurities of protein therapeutics during process development and lot release. Traditionally, a variety of separation techniques such as hydrophilic-interaction liquid chromatography (HILIC), size-exclusion chromatography (SEC), cation-exchange chromatography (CEX), capillary electrophoresis (CE), and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) are used in conjunction with ultraviolet (UV) spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to comprehensively measure these attributes and assess purity. In 2015, Rogers et al.1 developed the MAM, taking advantage of the HRAM capabilities of Orbitrap-based MS detection for simultaneous identification, quantitation, and monitoring of product quality attributes (PQAs) of two antibodies, Mab1 (IgG1) and anti-streptavidin IgG2. It was also demonstrated that MAM is well suited for NPD, enabling new peaks (“impurities”) to be identified when comparing to a reference.2 It was proposed that MAM could replace several conventional methods used in quality control (QC) for lot release of drugs. Since MAM was introduced, it has gained popularity and acceptance in the biopharma industry, featuring as a hot topic in many recent conferences. In this application note, we describe the HR MAM workflow developed using the Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus hybrid quadrupole-Orbitrap™ mass spectrometer and Thermo Scientific™ Vanquish™ Horizon UHPLC system combined with Thermo Scientific™ Chromeleon™ 7.2.10 Chromatography Data System (CDS) and Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 3.1 software for user intuitive data processing and reporting.
The HRAM capability of Orbitrap mass spectrometers promotes resolution of overlapping peaks, ensures precise peak integration, and enables accurate CQA quantitation using MS full scan data. At a resolution setting of <140,000, ions with similar m/z, for example, the monoisotopic peak of a deamidated peptide and the C13 peak of the wild type form, may overlap or even merge into a single peak. This negatively influences mass accuracy and results in incorrect peak integration. At a resolution setting of 70,000, the B0 peak of deamidated HYNPSLK completely overlaps with the A1 peak of the wild type form, resulting in the absence of this isotope in the peak integration window. At even lower resolution setting of 35,000, all three isotopes of the deamidated peptide (B0-B2) overlap with the neighboring isotopes of the wild type form (A1-A3). Only the very low abundant fourth isotope of the deamidated form was integrated. An Orbitrap resolution setting of 140,000, however, can resolve the isotopes of the low abundance deamidated peptide from the abundant native form. Therefore, the first four isotopes of the deamidated peptide generated suitable XICs, using an 8 ppm mass tolerance, enabling accurate quantitation of this CQA Due to significant increase in the level of deamidation, it is more obvious to see the isotopes of the deamidated forms (B0-B2) that are resolved from the neighboring isotopes (A1-A3) of the wild type form. This is an excellent example that highlights the importance of high resolution in CQA quantitation. There were also other examples in the NISTmAb digest where the isotopes of two peptides have very close m/z. In such cases, inaccurate quantitation was obtained for the data acquired at a resolution setting of <140,000 because the overlapped isotopes could not be resolved and extracted properly. High mass accuracy also serves to improve peak extraction and integration In the case of 10 ppm extraction, the wild type form of this peptide dominated the XIC, which led to an incorrect peak integration when the Component Match was set to Greatest. By comparison, the wild type form was not evident in the XIC of the deamidated form when a 5 ppm extraction was used. It should be noted that Peak A in the 10 ppm XIC can be correctly integrated in the presence of abundant Peak B by using the Component Match = Nearest or by setting a narrow RT window, again demonstrating the versatility of peak integration in Chromeleon software.
New Peak Detection (NPD)
In addition to detection and quantitation of known quality attributes, an essential component of the HR MAM workflow is detection of new features, including potential unknowns and impurities.. Generally, the maximum number of frames (potential new features) can be set to the maximum value of 16,000 with minimal impact on computing duty cycle. The frame width in mass accuracy (ppm) can be set to 10 ppm (±5 ppm) given the observed Orbitrap mass accuracy, while the width in RT (min) depends upon the chromatographic performance. The most critical parameter is the Peak Intensity Threshold. This value must be carefully chosen based on not only the intensity of the total ion or base peak chromatogram but also on the question to be answered. Setting a very low threshold may greatly increase the chance of finding false positives. With careful testing and benchmarking, this threshold value could be used for purity test and lot release. The detected features were filtered with the settings shown in Table 4. Briefly, only features with an identified monoisotopic mass (PR Element = 0) and at least one additional isotope (PR Size > 1) for charge state +2 were considered. Finally, those features not showing significant change relative to the reference injection were filtered out.
A ratio of 1000 was used to filter the result of the NISTmAb + PRTC data as PRTC peptides were absent in the reference data (control). For stressed samples, a minimum ratio of 20 was applied to the result to identify the features with a significant fold change from the reference. Among the control samples, both replicate digests and replicate injections (using the first injection from the first digest as the reference) revealed no significant changes, as expected. To act as a positive control for NPD, the PRTC was spiked into NISTmAb digest at a concentration of 500 fmol/µL. All 15 PRTC peptides were detected using the non-targeted MS processing feature in Chromeleon software. The ratio of all PRTC peptides in the spiked vs. control samples were >10,000, except SAAGAFGPELSR, whose abundance was ~1000 times higher in the spiked sample than in the control. The second isotope of a low abundant +5 peak with an m/z nearly identical to SAAGAFGPELSR was present in the control sample, making the measured ratio lower than it should be. This indicates that caution must be taken to set the threshold for NPD, as some ratios may be under-represented due to interfering peaks. This is particularly concerning with low resolution, low mass. D315 isomerization of VVSVLTVLHQDWLNGK in the control (top panels) and thermally stressed (bottom panels) NISTmAb digests. XICs (left panels) are shown at the same scale. Mass spectra (right panels) as recorded at apex RT. D315 isomerization was negligible in the control sample (top panels). By contrast, its abundance was significantly increased under a thermally stressed condition (bottom panels). Control Thermal Stress Retention Time (min) Intensity (counts) m/z (Da) Relative Intensity Retention Time (min) Intensity (counts) m/z (Da) Relative Intensity 19 accuracy instruments. However, the HRAM feature of the Thermo Scientific HR MAM workflow helps minimize the occurrence of any interferences, thus improving the confidence in NPD. It should be noted that some impurities already present in PRTC were also detected as new peaks.
The NPD strategy described above can be applied to the stressed NISTmAb samples to detect “new” or dramatically changing peptides. Most of these correspond to deamidation and isomerization in the thermally stressed sample and oxidation in the oxidatively stressed sample.
The Thermo Scientific HR MAM workflow provides the robustness, flexibility, specificity, and sensitivity to not only identify PQAs and quantify multiple CQAs simultaneously, but also detect new features associated with changes induced by sample preparation, storage, and processing. The HRAM ability of the Q Exactive Plus mass spectrometer makes it possible to resolve species that would otherwise be overlapped, leading to accurate CQA quantitation and reliable NPD. This, combined with the robust separation offered by the Vanquish Horizon UHPLC system and Accucore Vanquish C18+ column, produces reproducible results that can be confidently submitted for review by regulatory agencies. BioPharma Finder software offers rapid peptide mapping, easy CQA selection, and accurate quantitation in a non-compliant environment. The seamless transition from BioPharma Finder software to Chromeleon software through a workbook, enables CQA quantitation and monitoring, as well as NPD, to be performed within a compliant GMP environment. This combination of software utilization provides flexibility in the different phases of drug development and release. It should be emphasized that Chromeleon software affords a comprehensive and fully realized GMP-compliant environment; from instrument configuration, calibration, and tuning through data acquisition, processing and reporting is fully audited with restricted user roles and signatory requirements. As the MAM gains in popularity and recognition within the biopharmaceutical industry and with the regulatory agencies, the workflow described herein can serve as useful guidance for those who are using, or wish to use, this technology in different phases of drug development and QC.
ITALIANO
L'obiettivo è sviluppare un metodo multi-attributo di massa accurata (HRAM) ad alta risoluzione (MAM) per l'analisi degli attributi di qualità critica (CQA) di anticorpi monoclonali (mAb). Descriveremo l'ottimizzazione e l'applicazione di Thermo Scientific ™ HR Metodo MultiAttribute come flusso di lavoro completo per monitorare i CQA dello standard NISTmAb, tra cui glicosilazione, deamidazione, isomerizzazione, formazione di succinimide, ossidazione, lisina C-terminale, pirocutammato N-terminale e glicazione, in condizioni normali e stressate. Inoltre, dimostreremo la capacità del flusso di lavoro MAM delle risorse umane per il nuovo rilevamento di picco (NPD) utilizzando campioni a spillo e stressati. Verrà discussa l'importanza di HRAM nella quantificazione CQA e NPD. Introduzione In conformità con i principi di Quality by Design (QbD) delineati dalle agenzie di regolamentazione, è essenziale per l'industria biofarmaceutica identificare, quantificare e monitorare i potenziali CQA e le impurità delle terapie proteiche durante lo sviluppo del processo e il rilascio dei lotti. Tradizionalmente, un varietà di tecniche di separazione come cromatografia liquida ad interazione idrofila (HILIC), cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), cromatografia a scambio cationico (CEX), elettroforesi capillare (CE) e cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) sono usati in combinazione con la spettroscopia ultravioletta (UV), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per misurare in modo completo questi attributi e valutare la purezza. Nel 2015, Rogers et al.1 hanno sviluppato il MAM, sfruttando le capacità HRAM del rilevamento MS basato su Orbitrap per l'identificazione simultanea, la quantificazione e il monitoraggio degli attributi di qualità del prodotto (PQA) di due anticorpi, Mab1 (IgG1) e anti- streptavidina IgG2. È stato anche dimostrato che MAM è adatto per NPD, consentendo di identificare nuovi picchi ("impurità") quando si confronta con un riferimento.2 È stato proposto che MAM potesse sostituire diversi metodi convenzionali utilizzati nel controllo di qualità (QC) per il rilascio dei lotti di droghe. Da quando è stato introdotto il MAM, ha guadagnato popolarità e accettazione nel settore biofarmaceutico, presentandosi come argomento caldo in molte recenti conferenze. In questa nota di applicazione, descriviamo il flusso di lavoro MAM delle risorse umane sviluppato utilizzando lo spettrometro di massa ibrido quadrupolo-Orbitrap ™ Thermo Scientific ™ Q Exactive ™ Plus e il sistema Thermo Scientific ™ Vanquish ™ Horizon UHPLC combinato con il sistema di dati cromatografici Thermo Scientific ™ Chromeleon ™ 7.2.10 (CDS) e il software Thermo Scientific ™ BioPharma Finder ™ 3.1 per l'elaborazione e la reportistica intuitiva dell'utente.
La capacità HRAM degli spettrometri di massa Orbitrap promuove la risoluzione di picchi sovrapposti, garantisce una precisa integrazione dei picchi e consente una quantificazione accurata del CQA utilizzando i dati di scansione completa MS. Con un'impostazione di risoluzione <140.000, ioni con m / z simili, ad esempio, il picco monoisotopico di un peptide deamidato e il picco C13 nella forma di tipo selvaggio, possono sovrapporsi o persino fondersi in un singolo picco. Ciò influenza negativamente l'accuratezza della massa e si traduce in un'integrazione di picco errata. Con un'impostazione di risoluzione di 70.000, il picco B0 di HYNPSLK deamidato si sovrappone completamente al picco A1 nella forma di tipo selvaggio, causando l'assenza di questo isotopo nella finestra di integrazione del picco. Con una risoluzione ancora più bassa di 35.000, tutti e tre gli isotopi del peptide deamidato (B0-B2) si sovrappongono agli isotopi vicini della forma selvaggia (A1-A3). È stato integrato solo il quarto isotopo abbondante molto basso della forma deamidata. Un'impostazione di risoluzione Orbitrap di 140.000, tuttavia, può risolvere gli isotopi del peptide deamidato a bassa abbondanza dalla forma nativa abbondante. Pertanto, i primi quattro isotopi del peptide deamidato hanno generato XIC adatti, usando una tolleranza di massa di 8 ppm, consentendo una quantificazione accurata di questo CQA A causa del significativo aumento del livello di deamidazione, è più ovvio vedere gli isotopi delle forme deamidate ( B0-B2) che vengono risolti dagli isotopi vicini (A1-A3) della forma wild type. Questo è un eccellente esempio che evidenzia l'importanza dell'alta risoluzione nella quantificazione del CQA. C'erano anche altri esempi nel digest NISTmAb in cui gli isotopi di due peptidi hanno m / z molto vicini. In tali casi, è stata ottenuta una quantificazione imprecisa per i dati acquisiti con una risoluzione <140.000 perché gli isotopi sovrapposti non potevano essere risolti ed estratti correttamente. L'elevata precisione di massa serve anche a migliorare l'estrazione e l'integrazione del picco Nel caso dell'estrazione di 10 ppm, la forma selvaggia di questo peptide dominava l'XIC, il che portava a un'integrazione di picco errata quando Component Match era impostato su Greatest.
In confronto, la forma di tipo selvaggio non era evidente nell'XIC della forma deamidata quando veniva usata un'estrazione di 5 ppm. Va notato che il picco A nella XIC a 10 ppm può essere correttamente integrato in presenza di un picco B abbondante utilizzando Component Match = più vicino o impostando una finestra RT stretta, dimostrando ancora una volta la versatilità dell'integrazione dei picchi nel software Chromeleon.
New Peak Detection (NPD)
Oltre al rilevamento e alla quantificazione di attributi di qualità noti, un componente essenziale del flusso di lavoro di HR MAM è il rilevamento di nuove funzionalità, tra cui potenziali incognite e impurità. Generalmente, il numero massimo di frame (potenziali nuove funzionalità) può essere impostato al massimo valore di 16.000 con un impatto minimo sul duty cycle informatico. La larghezza del fotogramma in precisione di massa (ppm) può essere impostata su 10 ppm (± 5 ppm) data l'accuratezza di massa osservata di Orbitrap, mentre la larghezza in RT (min) dipende dalle prestazioni cromatografiche. Il parametro più critico è la soglia di intensità di picco. Questo valore deve essere scelto con cura in base non solo all'intensità del cromatogramma di picco ionico o di base, ma anche alla domanda a cui rispondere. Impostare una soglia molto bassa può aumentare notevolmente la possibilità di trovare falsi positivi. Con test e benchmarking accurati, questo valore di soglia potrebbe essere utilizzato per il test di purezza e il rilascio dei lotti. Le caratteristiche rilevate sono state filtrate con le impostazioni mostrate nella Tabella 4. In breve, sono state considerate solo le caratteristiche con una massa monoisotopica identificata (elemento PR = 0) e almeno un isotopo aggiuntivo (dimensione PR> 1) per lo stato di carica +2. Infine, sono state filtrate quelle caratteristiche che non mostravano cambiamenti significativi rispetto all'iniezione di riferimento.
È stato utilizzato un rapporto di 1000 per filtrare il risultato dei dati NISTmAb + PRTC poiché i peptidi PRTC erano assenti nei dati di riferimento (controllo). Per i campioni sottoposti a stress, è stato applicato un rapporto minimo di 20 al risultato per identificare le caratteristiche con una variazione significativa della piega rispetto al riferimento. Tra i campioni di controllo, sia replicare i digest che replicare le iniezioni (usando la prima iniezione dal primo digest come riferimento) non hanno rivelato cambiamenti significativi, come previsto. Per agire come controllo positivo per NPD, il PRTC è stato aggiunto al digest NISTmAb ad una concentrazione di 500 fmol / µL. Tutti e 15 i peptidi PRTC sono stati rilevati utilizzando la funzionalità di elaborazione MS non mirata nel software Chromeleon. Il rapporto di tutti i peptidi PRTC nei campioni addizionati rispetto al controllo era> 10.000, ad eccezione di SAAGAFGPELSR, la cui abbondanza era ~ 1000 volte superiore nel campione addizionato rispetto al controllo. Il secondo isotopo di un picco +5 basso e abbondante con un m / z quasi identico a SAAGAFGPELSR era presente nel campione di controllo, rendendo il rapporto misurato inferiore a quello che dovrebbe essere. Ciò indica che è necessario prestare attenzione per impostare la soglia per NPD, poiché alcuni rapporti potrebbero essere sottorappresentati a causa di picchi interferenti. Ciò riguarda in particolare la bassa risoluzione, la massa ridotta. . Isomerizzazione D315 di VVSVLTVLHQDWLNGK nei digest NISTmAb di controllo (pannelli superiori) e sollecitati termicamente (pannelli inferiori). Gli XIC (pannelli di sinistra) sono mostrati sulla stessa scala. Spettri di massa (pannelli di destra) registrati all'apice RT. L'isomerizzazione D315 era trascurabile nel campione di controllo (pannelli superiori). Al contrario, la sua abbondanza è stata notevolmente aumentata in condizioni di stress termico (pannelli inferiori). Controllo del tempo di ritenzione dello stress termico (min) Intensità (conteggi) m / z (Da) Tempo di ritenzione dell'intensità relativa (min) Intensità (conteggi) m / z (Da) Strumenti di precisione dell'intensità relativa 19. Tuttavia, la funzionalità HRAM del flusso di lavoro MAM Thermo Scientific HR aiuta a ridurre al minimo l'insorgenza di eventuali interferenze, migliorando così la fiducia nel NPD. Va notato che alcune impurità già presenti nel PRTC sono state rilevate anche come nuovi picchi.
La strategia NPD sopra descritta può essere applicata ai campioni NISTmAb stressati per rilevare peptidi "nuovi" o che cambiano drasticamente. La maggior parte di questi corrisponde alla deamidazione e all'isomerizzazione nel campione sottoposto a stress termico e all'ossidazione nel campione sottoposto a stress ossidativo.
l flusso di lavoro HR MAM di Thermo Scientific HR offre la robustezza, la flessibilità, la specificità e la sensibilità non solo per identificare i PQA e quantificare simultaneamente più CQA, ma anche per rilevare nuove funzionalità associate alle modifiche indotte dalla preparazione, conservazione ed elaborazione dei campioni. La capacità HRAM dello spettrometro di massa Q Exactive Plus consente di risolvere specie che altrimenti sarebbero sovrapposte, portando a un'accurata quantificazione CQA e NPD affidabile. Questo, combinato con la solida separazione offerta dal sistema UHPLC di Vanquish Horizon e dalla colonna Accucore Vanquish C18 +, produce risultati riproducibili che possono essere sottoposti con fiducia alla revisione da parte delle agenzie di regolamentazione. Il software BioPharma Finder offre una rapida mappatura dei peptidi, una facile selezione del CQA e una quantificazione accurata in un ambiente non conforme. La transizione senza soluzione di continuità dal software BioPharma Finder al software Chromeleon attraverso una cartella di lavoro, consente la quantificazione e il monitoraggio CQA, nonché NPD, da eseguire in un ambiente GMP conforme. Questa combinazione di utilizzo del software offre flessibilità nelle diverse fasi di sviluppo e rilascio dei farmaci. Va sottolineato che il software Chromeleon offre un ambiente completo e pienamente conforme a GMP; dalla configurazione dello strumento, calibrazione e messa a punto attraverso l'acquisizione, l'elaborazione e il reporting dei dati è completamente verificato con ruoli utente e requisiti di firma limitati. Man mano che il MAM guadagna popolarità e riconoscimento nell'industria biofarmaceutica e con le agenzie di regolamentazione, il flusso di lavoro qui descritto può servire come guida utile per coloro che utilizzano o desiderano utilizzare questa tecnologia in diverse fasi di sviluppo di farmaci e controllo di qualità.
Da:
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