Exploring Cell Mechanics – From Ripe Avocados to Sepsis Diagnosis. / Esplorazione della meccanica cellulare: dagli avocado maturi alla diagnosi di sepsi.
Exploring Cell Mechanics – From Ripe Avocados to Sepsis Diagnosis. The principle of the ENEA RM2012A000637 patent process is very useful in this application. / Esplorazione della meccanica cellulare: dagli avocado maturi alla diagnosi di sepsi. Il principio del procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in quest applicazione.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Much can be discovered about a cell’s condition and function by measuring its mechanical properties such as deformability. Technology Networks recently spoke with Daniel Klaue, CEO, ZELLMECHANIK DRESDEN, to learn more about the field of cell mechanics. In this interview, Daniel explains why it is important to measure cell mechanics, discusses a novel method of doing so – real-time deformability cytometry – and highlights how this technology could benefit clinical applications.
Anna MacDonald (AM): What is cell mechanics and why is it so important to measure? What can cell mechanics reveal about a cell?
Daniel Klaue (DK): Imagine ten bananas laying in front of you. They have different degrees of ripeness and you wish to pick a ripe one. Easy: you just look at them and if there are green, yellow and brown fruits you will most likely go with yellow. Now the next level: ten avocados of different ripeness… It is difficult to see a difference. So, most likely you will simply take the fruit and gently press it to feel the resistance of the pulp. With your experience you will intuitively know how much force to apply with your fingers to categorize the avocado unripe (hard), ripe (certain softness), over-ripe (too soft). The mechanical properties of the fruit are determined by complex tissue structures. Sensing these mechanical properties allows us to draw conclusions about the state of the fruit.
Now let’s go to the cellular level and raise the question: can the mechanical properties of a single cell tell me anything about the cells state? Yes! The equivalent of the tissue structure in the fruit is the cytoskeleton of the cell (and to a lesser degree, other structural components like the cytoplasm or membranes). The functional link between this highly dynamic filament structure and mechanical properties of the cell has been known for decades. Cell migration or division for example leads to obvious structural changes in the cytoskeleton. Likewise, malignant modifications of the cell are often accompanied by cytoskeletal remodelling (most cancer cells are softer than healthy ones).
Of course, there are countless established molecular markers to study cells, but you either have to work with labels or you have to interpret the signals the cells are giving. In contrast, the mechanical properties are intrinsic (no label necessary) and you directly assess the cell producing or interpreting signals.
Therefore, cell mechanics constitutes a key scientific target for investigating topics ranging from development to disease.
AM: How can cell mechanics be measured? Can you explain how real-time deformability cytometry works and the advantages this method offers?
DK: There are various methods to measure cell mechanics. It is important to distinguish the approaches, because they address different physical properties. Depending on the duration, scale or location of applied forces one measures more elastic or more viscous components, cytoskeleton or nucleus mechanics, global or local properties. Some methods are measuring the forces created by cells, others analyse the reaction of a cell to applied forces and still others interpret particle motion in the cytoplasm.
Real-time deformability cytometry (RT-DC) measures global, elastic properties of the cytoskeleton. Technically, it is a hybrid of flow cytometry and high-speed video-microscopy. Cells are suspended in a buffer and pumped through a channel with a slightly larger cross section than the cells’ diameter. Like in a river, the fluid moves faster in the centre than at the sides. This difference creates forces acting on the cell and results in deformation. A “stiffer” cell will deform less than a “softer” cell when applying the same kind of force. Deformation is measured by analysing the cell’s contour in an image of it in the channel. When assuming that single cells in suspension without applied forces are spherical, this contour is circular. The deformation is now defined as a deviation from a circular shape of the cell contour.
The “real-time” in RT-DC comes from the instant analysis of the cell’s contour when the image is taken. Immediate calculation of cell area, height, width, aspect-ratio, et cetera allows for on-the-fly observation and gating of the data. The algorithm also calculates parameters such as the brightness and brightness-deviation of the cell, giving insights to morphological properties. The icing on the cake is a saved image of every detected event, making it easy to see if the outlier is debris or the rare cell you were looking for.
The biggest advantage of RT-DC is the 10,000-fold increase of the measurement rate compared to other methods addressing cell mechanics (e.g. micropipette aspiration 100 cells/hour, RT-DC 1,000 cells/second). This facilitates the application of a label-free, non-destructive biomarker as a standard in cell biology and clinical research with statistically meaningful numbers of single cell measurements in a few minutes.
Anna MacDonald (AM): What is cell mechanics and why is it so important to measure? What can cell mechanics reveal about a cell?
Daniel Klaue (DK): Imagine ten bananas laying in front of you. They have different degrees of ripeness and you wish to pick a ripe one. Easy: you just look at them and if there are green, yellow and brown fruits you will most likely go with yellow. Now the next level: ten avocados of different ripeness… It is difficult to see a difference. So, most likely you will simply take the fruit and gently press it to feel the resistance of the pulp. With your experience you will intuitively know how much force to apply with your fingers to categorize the avocado unripe (hard), ripe (certain softness), over-ripe (too soft). The mechanical properties of the fruit are determined by complex tissue structures. Sensing these mechanical properties allows us to draw conclusions about the state of the fruit.
Now let’s go to the cellular level and raise the question: can the mechanical properties of a single cell tell me anything about the cells state? Yes! The equivalent of the tissue structure in the fruit is the cytoskeleton of the cell (and to a lesser degree, other structural components like the cytoplasm or membranes). The functional link between this highly dynamic filament structure and mechanical properties of the cell has been known for decades. Cell migration or division for example leads to obvious structural changes in the cytoskeleton. Likewise, malignant modifications of the cell are often accompanied by cytoskeletal remodelling (most cancer cells are softer than healthy ones).
Of course, there are countless established molecular markers to study cells, but you either have to work with labels or you have to interpret the signals the cells are giving. In contrast, the mechanical properties are intrinsic (no label necessary) and you directly assess the cell producing or interpreting signals.
Therefore, cell mechanics constitutes a key scientific target for investigating topics ranging from development to disease.
AM: How can cell mechanics be measured? Can you explain how real-time deformability cytometry works and the advantages this method offers?
DK: There are various methods to measure cell mechanics. It is important to distinguish the approaches, because they address different physical properties. Depending on the duration, scale or location of applied forces one measures more elastic or more viscous components, cytoskeleton or nucleus mechanics, global or local properties. Some methods are measuring the forces created by cells, others analyse the reaction of a cell to applied forces and still others interpret particle motion in the cytoplasm.
Real-time deformability cytometry (RT-DC) measures global, elastic properties of the cytoskeleton. Technically, it is a hybrid of flow cytometry and high-speed video-microscopy. Cells are suspended in a buffer and pumped through a channel with a slightly larger cross section than the cells’ diameter. Like in a river, the fluid moves faster in the centre than at the sides. This difference creates forces acting on the cell and results in deformation. A “stiffer” cell will deform less than a “softer” cell when applying the same kind of force. Deformation is measured by analysing the cell’s contour in an image of it in the channel. When assuming that single cells in suspension without applied forces are spherical, this contour is circular. The deformation is now defined as a deviation from a circular shape of the cell contour.
The “real-time” in RT-DC comes from the instant analysis of the cell’s contour when the image is taken. Immediate calculation of cell area, height, width, aspect-ratio, et cetera allows for on-the-fly observation and gating of the data. The algorithm also calculates parameters such as the brightness and brightness-deviation of the cell, giving insights to morphological properties. The icing on the cake is a saved image of every detected event, making it easy to see if the outlier is debris or the rare cell you were looking for.
The biggest advantage of RT-DC is the 10,000-fold increase of the measurement rate compared to other methods addressing cell mechanics (e.g. micropipette aspiration 100 cells/hour, RT-DC 1,000 cells/second). This facilitates the application of a label-free, non-destructive biomarker as a standard in cell biology and clinical research with statistically meaningful numbers of single cell measurements in a few minutes.
AM: Can you tell us about the origin and development of this method?
DK: The method was invented in the laboratories of Prof. Jochen Guck at the Technische Universität Dresden. Prof. Guck worked with AFM and optically stretching to reveal correlations between cell mechanics and function (or dysfunction) of cells. One major obstacle of those methods was the low throughput (max. several 100 cells/h). The process of measurement was: find a cell, stop to apply forces, release the cell and analyse the measured parameters after the whole experiment. To overcome the most time-consuming steps they developed a method using a continuous flow with continuous forces and on-the-fly analysis: RT-DC.
Dr. Oliver Otto and Dr. Philipp Rosendahl (both now part of ZELLMECHANIK DRESDEN) implemented the idea around 2013. Since then, numerous high impact scientific papers have been published, our start-up has been founded, technical extensions have been developed and the technology is starting to spread.
It is now possible to simultaneously measure physical properties and fluorescence signals of cells (RT-FDC), thus allowing to compare and correlate physical properties of cells to the gold standard in cell biology (fluorescence flow cytometry). It recently became possible to dynamically track cell deformation along the channel and study the time-dependent dynamics of deformation (dRT-DC). Sorting by mechanical properties is already running in the lab of Prof. Guck and will be commercially available soon. This all shows that the method is well established and we will keep on pushing the technology to further limits and distribute it world-wide.
AM: What applications can this method particularly benefit?
DK: Our mission is to utilize RT-DC in a medical setting. Potential scenarios comprise diagnosis and therapy-monitoring for various disease indications, ranging from inflammatory diseases like pneumonia to leukemic cancers.
ZELLMECHANIK DRESDEN focusses on sepsis. Sepsis is one of the most common causes of death in the industrialized world after heart disease and cancer, although the awareness is not as strong yet. And sepsis kills fast: the mortality risk in sepsis increases by 8% per hour. There is a lot of research and development going on to quickly identify the infection (cause, location, bacteria, virus, fungus, …) to swiftly initiate the matching therapy. However, with the existing methods this still takes up to several days which in many cases is fatal. Meanwhile the patient is treated with broad-spectrum antibiotics (that don´t help in the case of a viral infection). There is a great need for rapid diagnosis and permanent treatment monitoring of the disease.
Therefore, it is indispensable to find a biomarker that a) significantly shortens the time for diagnosis of the sepsis-causing agent (diagnostic marker) and b) that shortens the time from diagnosis to effective verification of the applied therapeutic agent (monitoring marker). We believe that biophysical properties of cells of the immune system can constitute this biomarker. RT-DC allows us to characterise thousands of individual cells from just a drop of blood. Since the different types of blood cells show different properties (size, deformation, brightness, …), it is easy to identify the different populations (without labelling). We call the result a mechanical hemogram.
Specific states of the immune system are reflected in specific patterns of the mechanical hemogram. Thus, also changes in the immune system will reflect in changes of the mechanical hemogram (first confirming experimental results are already published). It is known that e.g. lymphocytes react primarily to viral infection, neutrophil granulocytes react to bacterial infection and that the complications of a sepsis are caused by a strong (over)-reaction of neutrophils. We believe that these cellular reactions happen earlier, than those on a macro level, such as body temperature, heart rate, and physical comfort. Using RT-DC we can quickly access this information for live monitoring of therapeutic success. This will also help to reduce the exhaustive use of antibiotics.
If any of our customers finds another medical application of RT-DC (in cancer, quality control of blood transplantation, infectious diseases, …) we are happy to individually adapt our technology. Our precise mission is to help health care providers to improve their diagnostic and prognostic decisions for sustainable therapies.
AM: Your vision is to turn the technology into a medical device present in all hospitals within 10 years. What challenges do you anticipate along the path to achieving this? What impact could the technology make to the future of diagnostics and healthcare?
DK: It will be difficult to develop a medical device in line with all regulations, for different markets, at an economical price, reimbursable by health insurance. But this is solvable, by working together with experienced partners. Really challenging will be to prove the clinical applicability and increased value in sepsis therapy management. We have to perform clinical trials that convince all the key players such as medical professionals, decision makers for purchases in the hospital and health insurances. And then there is the strong competition in the medical device market. Maybe it will be even more challenging to stand against those established players in the field.
Having a test that reveals a compelling statement on the improved or declined immune status under therapy could greatly impact the outcome of sepsis. It can reduce the tremendous costs of intensive care units for treatment and accommodation of sepsis patients. In addition, improved therapy management of infectious diseases also touches on the subject of unnecessary use of, and development of resistance against, antibiotics.
RT-DC in a medical device will most likely not completely replace other diagnostic technologies. It will improve the overall process. As the differential blood count is standard today, we are going to make it standard to perform a mechanical hemogram… about 10 years from now.
ITALIANO
Molto si può scoprire sulla condizione e sulla funzione di una cellula misurando le sue proprietà meccaniche come la deformabilità. Technology Networks ha recentemente parlato con Daniel Klaue, CEO di ZELLMECHANIK DRESDEN, per saperne di più sul campo della meccanica cellulare. In questa intervista, Daniel spiega perché è importante misurare la meccanica cellulare, discute un nuovo metodo per farlo - la citometria di deformabilità in tempo reale - ed evidenzia come questa tecnologia possa beneficiare delle applicazioni cliniche.
Anna MacDonald (AM): Cos'è la meccanica cellulare e perché è così importante misurare? Cosa può rivelare la meccanica cellulare su una cellula?
Daniel Klaue (DK): Immagina dieci banane distese davanti a te. Hanno diversi gradi di maturità e desideri sceglierne uno maturo. Facile: basta guardarli e se ci sono frutti verdi, gialli e marroni molto probabilmente andrai con il giallo. Ora il livello successivo: dieci avocado di diversa maturità ... È difficile vedere la differenza. Quindi, molto probabilmente prenderete semplicemente il frutto e lo premerete delicatamente per sentire la resistenza della polpa. Con la tua esperienza saprai intuitivamente quanta forza applicare con le dita per classificare l'avocado acerbo (duro), maturo (una certa morbidezza), troppo maturo (troppo morbido). Le proprietà meccaniche del frutto sono determinate da complesse strutture tissutali. Il rilevamento di queste proprietà meccaniche ci consente di trarre conclusioni sullo stato del frutto.
Ora andiamo al livello cellulare e solleviamo la domanda: le proprietà meccaniche di una singola cellula possono dirmi qualcosa sullo stato delle cellule? Sì! L'equivalente della struttura del tessuto nel frutto è il citoscheletro della cellula (e, in misura minore, altri componenti strutturali come il citoplasma o le membrane). Il legame funzionale tra questa struttura di filamento altamente dinamica e le proprietà meccaniche della cellula è noto da decenni. La migrazione o la divisione cellulare, ad esempio, porta a evidenti cambiamenti strutturali nel citoscheletro. Allo stesso modo, le modificazioni maligne della cellula sono spesso accompagnate da rimodellamento citoscheletrico (la maggior parte delle cellule tumorali sono più morbide di quelle sane).
Naturalmente, ci sono innumerevoli marcatori molecolari stabiliti per studiare le cellule, ma o devi lavorare con le etichette o devi interpretare i segnali che le cellule stanno dando. Al contrario, le proprietà meccaniche sono intrinseche (nessuna etichetta necessaria) e si valuta direttamente i segnali di produzione o interpretazione della cella.
Pertanto, la meccanica cellulare costituisce un obiettivo scientifico chiave per lo studio di argomenti che vanno dallo sviluppo alla malattia.
AM: Come si può misurare la meccanica cellulare? Puoi spiegare come funziona la citometria della deformabilità in tempo reale e i vantaggi offerti da questo metodo?
DK: Esistono vari metodi per misurare la meccanica cellulare. È importante distinguere gli approcci, perché affrontano diverse proprietà fisiche. A seconda della durata, della scala o della posizione delle forze applicate si misurano componenti più elastici o più viscosi, la meccanica del citoscheletro o del nucleo, le proprietà globali o locali. Alcuni metodi misurano le forze create dalle cellule, altri analizzano la reazione di una cellula alle forze applicate e altri ancora interpretano il movimento delle particelle nel citoplasma.
La citometria a deformabilità in tempo reale (RT-DC) misura le proprietà globali ed elastiche del citoscheletro. Tecnicamente, è un ibrido di citometria a flusso e video-microscopia ad alta velocità. Le cellule vengono sospese in un buffer e pompate attraverso un canale con una sezione trasversale leggermente più grande del diametro delle celle. Come in un fiume, il fluido si muove più velocemente al centro che ai lati. Questa differenza crea forze che agiscono sulla cellula e provoca deformazioni. Una cellula "più rigida" si deformerà meno di una cella "più morbida" quando si applica lo stesso tipo di forza. La deformazione viene misurata analizzando il contorno della cellula in un'immagine di essa nel canale. Quando si presume che le singole celle in sospensione senza forze applicate siano sferiche, questo contorno è circolare. La deformazione è ora definita come una deviazione da una forma circolare del contorno cellulare.
Il "tempo reale" in RT-DC deriva dall'analisi istantanea del contorno della cellula quando viene scattata l'immagine. Il calcolo immediato di area cellulare, altezza, larghezza, proporzioni, eccetera consente l'osservazione al volo e il gate dei dati. L'algoritmo calcola anche parametri come la luminosità e la deviazione della luminosità della cellula, fornendo informazioni sulle proprietà morfologiche. La ciliegina sulla torta è un'immagine salvata di ogni evento rilevato, che consente di vedere facilmente se il valore anomalo è detriti o la rara cellula che stavi cercando.
Il più grande vantaggio di RT-DC è l'aumento di 10.000 volte della velocità di misurazione rispetto ad altri metodi rivolti alla meccanica cellulare (ad es. Aspirazione di micropipette 100 celle / ora, RT-DC 1.000 cellule / secondo). Ciò facilita l'applicazione di un biomarker senza etichetta e non distruttivo come standard nella biologia cellulare e nella ricerca clinica con numeri statisticamente significativi di misurazioni di singole cellule in pochi minuti.
AM: Puoi parlarci dell'origine e dello sviluppo di questo metodo?
DK: Il metodo è stato inventato nei laboratori del Prof. Jochen Guck alla Technische Universität di Dresda. Il Prof. Guck ha lavorato con AFM e allungando otticamente per rivelare correlazioni tra la meccanica cellulare e la funzione (o disfunzione) delle cellule. Uno dei maggiori ostacoli di questi metodi era il basso rendimento (max. Diverse 100 cellule / h). Il processo di misurazione è stato: trovare una cellula, interrompere l'applicazione delle forze, rilasciare la cellula e analizzare i parametri misurati dopo l'intero esperimento. Per superare le fasi più dispendiose in termini di tempo, hanno sviluppato un metodo utilizzando un flusso continuo con forze continue e analisi al volo: RT-DC.
Il dott. Oliver Otto e il dott. Philipp Rosendahl (entrambi ora parte di ZELLMECHANIK DRESDEN) hanno implementato l'idea intorno al 2013. Da allora sono stati pubblicati numerosi documenti scientifici di grande impatto, è stata fondata la nostra start-up, sono state sviluppate estensioni tecniche e la tecnologia sta iniziando a diffondersi.
È ora possibile misurare simultaneamente le proprietà fisiche e i segnali di fluorescenza delle cellule (RT-FDC), consentendo così di confrontare e correlare le proprietà fisiche delle cellule con il gold standard nella biologia cellulare (citometria a flusso di fluorescenza). Recentemente è diventato possibile tracciare dinamicamente la deformazione cellulare lungo il canale e studiare la dinamica della deformazione dipendente dal tempo (dRT-DC). L'ordinamento per proprietà meccaniche è già in esecuzione nel laboratorio del Prof. Guck e sarà presto disponibile in commercio. Tutto ciò dimostra che il metodo è ben consolidato e continueremo a spingere la tecnologia verso ulteriori limiti e distribuirla in tutto il mondo.
AM: Quali applicazioni possono trarre particolare vantaggio da questo metodo?
DK: La nostra missione è utilizzare RT-DC in ambito medico. I potenziali scenari comprendono la diagnosi e il monitoraggio della terapia per varie indicazioni di malattia, che vanno dalle malattie infiammatorie come la polmonite ai tumori leucemici.
ZELLMECHANIK DRESDEN si concentra sulla sepsi. La sepsi è una delle cause più comuni di morte nel mondo industrializzato dopo malattie cardiache e cancro, sebbene la consapevolezza non sia ancora così forte. E la sepsi uccide velocemente: il rischio di mortalità nella sepsi aumenta dell'8% all'ora. Ci sono molte ricerche e sviluppi in corso per identificare rapidamente l'infezione (causa, posizione, batteri, virus, funghi, ...) per iniziare rapidamente la terapia di abbinamento. Tuttavia, con i metodi esistenti ciò richiede ancora diversi giorni, che in molti casi è fatale. Nel frattempo il paziente viene trattato con antibiotici ad ampio spettro (che non aiutano in caso di infezione virale). Vi è una grande necessità di diagnosi rapide e monitoraggio permanente del trattamento della malattia.
Pertanto, è indispensabile trovare un biomarcatore che a) accorcia significativamente i tempi per la diagnosi dell'agente che causa la sepsi (marker diagnostico) e b) che accorcia i tempi dalla diagnosi all'efficace verifica dell'agente terapeutico applicato (marker di monitoraggio). Crediamo che le proprietà biofisiche delle cellule del sistema immunitario possano costituire questo biomarcatore. RT-DC ci consente di caratterizzare migliaia di singole cellule da una sola goccia di sangue. Poiché i diversi tipi di cellule del sangue mostrano proprietà diverse (dimensioni, deformazione, luminosità, ...), è facile identificare le diverse popolazioni (senza etichettatura). Chiamiamo il risultato un emogramma meccanico.
Stati specifici del sistema immunitario si riflettono in schemi specifici dell'emogramma meccanico. Pertanto, anche i cambiamenti nel sistema immunitario si rifletteranno nei cambiamenti dell'emogramma meccanico (i primi risultati sperimentali di conferma sono già stati pubblicati). È noto che ad es. i linfociti reagiscono principalmente all'infezione virale, i granulociti neutrofili reagiscono all'infezione batterica e che le complicanze di una sepsi sono causate da una forte (eccessiva) reazione dei neutrofili. Crediamo che queste reazioni cellulari avvengano prima di quelle a livello macro, come la temperatura corporea, la frequenza cardiaca e il comfort fisico. Utilizzando RT-DC possiamo accedere rapidamente a queste informazioni per il monitoraggio in tempo reale del successo terapeutico. Ciò contribuirà anche a ridurre l'uso esauriente di antibiotici.
Se qualcuno dei nostri clienti trova un'altra applicazione medica di RT-DC (nel cancro, controllo di qualità del trapianto di sangue, malattie infettive, ...) siamo felici di adattare individualmente la nostra tecnologia. La nostra precisa missione è aiutare gli operatori sanitari a migliorare le loro decisioni diagnostiche e prognostiche per terapie sostenibili.
AM: La tua visione è quella di trasformare la tecnologia in un dispositivo medico presente in tutti gli ospedali entro 10 anni. Quali sfide prevedi lungo il percorso per raggiungere questo obiettivo? Quale impatto potrebbe avere la tecnologia sul futuro della diagnostica e dell'assistenza sanitaria?
DK: Sarà difficile sviluppare un dispositivo medico in linea con tutte le normative, per diversi mercati, a un prezzo economico, rimborsabile con l'assicurazione sanitaria. Ma questo è risolvibile, collaborando con partner esperti. Davvero impegnativo sarà dimostrare l'applicabilità clinica e aumentare il valore nella gestione della terapia sepsi. Dobbiamo eseguire prove cliniche che convincano tutti i principali attori come professionisti medici, decisori per gli acquisti in ospedale e assicurazioni sanitarie. E poi c'è la forte concorrenza nel mercato dei dispositivi medici. Forse sarà ancora più difficile affrontare i giocatori affermati sul campo.
Avere un test che rivela una dichiarazione convincente sullo stato immunitario migliorato o rifiutato durante la terapia potrebbe influire notevolmente sull'esito della sepsi. Può ridurre gli enormi costi delle unità di terapia intensiva per il trattamento e la sistemazione dei pazienti con sepsi. Inoltre, una migliore gestione della terapia delle malattie infettive tocca anche il tema dell'uso non necessario e dello sviluppo di resistenza agli antibiotici.
La RT-DC in un dispositivo medico molto probabilmente non sostituirà completamente altre tecnologie diagnostiche. Migliorerà l'intero processo. Dato che il conteggio del sangue differenziale è oggi standard, lo renderemo standard per eseguire un emogramma meccanico ... tra circa 10 anni.
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