Potency Assays for Cell and Gene Therapy / Saggi di potenza per terapia cellulare e genica

Potency Assays for Cell and Gene Therapy / Saggi di potenza per terapia cellulare e genica

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Absorption Systems describes a step-by-step approach to developing GMP-compliant in vitro potency assays 

Approved biological products are required to be accompanied by analytical tests to demonstrate safety, purity and potency. Manufacturing and testing processes for approved products are validated and performed under current Good Manufacturing Processes (cGMP).

Potency is defined as “the specific ability or capacity of the product, as indicated by appropriate laboratory tests or by adequately controlled clinical data obtained through the administration of the product in the manner intended, to effect a given result.”

In vivo models used during proof-of-concept and efficacy studies provide an early readout of potency by measuring a desired physiological response in animals. For product approval, in vitro assays must be developed providing a quantifiable readout that can be validated. The in vitro approach of introducing a gene into a cell line and then demonstrating its expression and functional activity has been used for over a decade in the evaluation of small molecule drug-drug interaction properties. When a small molecule drug is developed, the interaction potential of the molecule as a substrate, inhibitor, or inducer of specific drug transporters is evaluated. The U.S. Food and Drug Administration (FDA) issued the first drug transporter concept paper in 2004, and it issued draft guidance in 2006. This draft guidance was most recently updated in 2017.

Two-step procedure for developing in vitro potency assays for cell and gene therapy products: 1) Demonstrate that the vector can transfer genetic material into a cell. 2) Demonstrate that the transferred genetic material has the desired biological effect. / Procedura in due fasi per lo sviluppo di saggi di potenza in vitro per prodotti di terapia cellulare e genica: 1) Dimostrare che il vettore può trasferire materiale genetico in una cellula. 2) Dimostrare che il materiale genetico trasferito ha l'effetto biologico desiderato.

Principal of potency assay development for cell and gene therapy products

Although in vitro potency assays have been used in small molecule and monoclonal antibody drug development for more than a decade, applications in cell and gene therapy (CGT) product development are more recent. CGT products present specific challenges for developing in vitro potency assays due to:

• complex and/or unclear mechanisms of action
• complicated manufacturing processes
• variable critical quality attributes (CQAs)
• reduced preclinical and early-stage clinical data with which to inform development

The development of in vitro potency assays for CGT products includes at least two steps. First: It must be demonstrated that the vector can transfer genetic material into a cell. Second: It must be demonstrated that the transferred genetic material has the desired biological effect in the transduced cells.

Due to the complexity of some CGT products’ mechanisms of action, more than one assay may be required to characterize different aspects of potency. The challenges related to developing in vitro potency assays for CGT products extend to later-stage considerations for validation and routine testing such as supply chain, assay automation, and the development of reference standards. As more products come to market, the demand to overcome these challenges and improve efficiencies will grow.

Developing in vitro potency assays for cGMP settings

Validating biologically relevant cell lines as in vitro models of therapeutic potency is an approach that is recognized by regulatory authorities. Since 2000, the FDA has accepted in vitro epithelial cell culture systems to waive clinical trials. The FDA Biopharmaceutics Classification System (BCS)-based biowaiver guidance outlines the cell line characteristics and requirements for demonstrating suitability of a test system.3

The development of an in vitro potency assay to accompany an approved CGT product involves a series of activities that can be divided into four key stages.

Stage 1: Establish optimum assay profile

It is important to establish an assay profile and feasibility criteria early in the development process. This includes scientific considerations for the gene of interest, mechanisms of action, relevant biological functions, and whether multiple assays are required to demonstrate these activities. The assay design should account for limited understanding of the final manufacturing processes, as well as for potential differences between drug substance and drug product. It should also limit the amount of testing material required.

Key questions include:

• Should expression and functional activity both be considered within a single assay?
• Will the assay be used for characterizing both the drug substance and drug product?
• Are there preexisting assays that can meet some of these objectives?
• What considerations for the capsid, gene, enzyme, or protein of interest need to be made?
• What requirements for time, cost, and compliance occur at each stage of assay development?
• What level of tolerance for assay sensitivity, specificity, and variability will be acceptable?

A common approach is to employ a relative potency assay to combat inherent assay variability. The response of a test sample is compared to that of a designated reference standard tested in parallel. The potency is reported as relative to the reference standard, rather than an absolute response. Identifying a biologically active reference standard is critical to the final assay design. Once the ideal profile is established, it can be used to guide assay development and ensure that the appropriate controls, replicates, and statistics are established to demonstrate all required assay parameters.

One of the key reagents of the potency assay is the biorelevant test system (target cell) that can accept the gene and support the desired mechanism of action. Identifying the target cell profile for the potency assay is an important step, and considerations include:

• general cell culture considerations such as availability, growth, and morphology
• product-specific characteristics such as compatibility with the capsid, promoter, and any interacting enzymes or proteins
• characterization of the cell line to facilitate expression and functional assays

Several cell lines may need to be screened to determine the optimum test system. The creation of custom stably transfected cell lines may be required to achieve the desired profile.

Expression of (A) mRNA and (B) protein for P-gp, BCRP, and MRP2 in parental and cultured call lines. In A, the column headings indicate clones. In B, the column headings indicate knockdown cell lines. Notice that in P-gp knockdown cells, expression of P-gp (MDR1) is reduced by more than 50%, whereas expression of MRP2 is unchanged. In MRP2 knockdown cells, MRP2 expression is reduced by more than 50%, but P-gp expression remains constant. / Espressione delle proteine (A) mRNA e (B) per P-gp, BCRP e MRP2 nelle linee parentali e in coltura. In A, le intestazioni di colonna indicano i cloni. In B, le intestazioni di colonna indicano le linee cellulari knockdown. Si noti che nelle cellule knockdown di P-gp, l'espressione di P-gp (MDR1) è ridotta di oltre il 50%, mentre l'espressione di MRP2 è invariata. Nelle celle knockdown di MRP2, l'espressione di MRP2 è ridotta di oltre il 50%, ma l'espressione di P-gp rimane costante.

Assay optimization

During this stage, each independent step of the assay is optimized with respect to the overall potency assay. Process optimization may include:

• fine-tuning of cell culture conditions such as the cell density, plating format, and time for transduction
• production, handling, and stability of transduced cell lysate to form a functional reagent
• functional assay parameters including substrate concentration, solvent, and stability; incubation time and temperature; performance of reference standard; and specificity of positive and negative controls
• detection method used to quantify the output from the functional assay (extraction, linearity, specificity, accuracy, and precision for the analyte of interest)

At this stage, it is recommended to use statistics to guide assay design using multifactorial design of experiments and an appropriate replication strategy based on known or expected sources of variability. Statistical analysis should be used throughout assay optimization to determine acceptance criteria for control treatments, reference standard and test samples; data distribution and transformation to fit the appropriate statistical model; and procedures for identifying and managing outliers.

Each step of the assay should have its own system suitability and acceptance criteria to ensure the inclusion of reliable data. There are several guidelines available for the design and validation of bioassays for general application, and those specific to potency assays for CGT products have been promulgated by several authorities:

• The FDA
• The European Medicines Agency
• The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (validation guidelines)5
• United States Pharmacopeia (chapters for bioassay design and validation)6–9

The guidelines agree on the relevant parameters required for assay validation, such as accuracy, precision, linearity, and specificity. However, the assessment of parameters is specific to each product type. This is due to the interdependency of many methods and reagents commonly used in assay development.

Stage 4: Long-term program management

The potency assay development process follows the life cycle of the CGT product. At different stages of product development, the approach, design, and refinement of the assay may change. From an analytical testing perspective, the labs performing these complex assays must be able to operate within a GMP-compliant facility while satisfying CFR Part 11 and Annex 11 guidelines for data integrity.

Critical reagents must be characterized for grade and qualification criteria with a well-defined supply chain and built-in redundancy. Redundancy is also necessary for trained personnel and specialized equipment for successful implementation in a GMP setting. Statistical design and analysis approaches may be customized to adapt traditional United States Pharmacopeia guidelines to the complex nature of CGT products. Finally, from a commercial standpoint, the intended lot release schedule and product availability may shape the final potency assay design, along with any regulatory feedback on the potency assay approach. It is important to have discussions with the FDA early and often to communicate the intended potency assay approach.

ITALIANO

I sistemi di assorbimento descrivono un approccio graduale allo sviluppo di saggi di potenza in vitro conformi alle GMP

I prodotti biologici approvati devono essere accompagnati da test analitici per dimostrare sicurezza, purezza e potenza. I processi di fabbricazione e test per i prodotti approvati sono validati ed eseguiti in base agli attuali Processi di buona fabbricazione (cGMP).

La potenza è definita come "l'abilità o la capacità specifica del prodotto, come indicato da appropriati test di laboratorio o da dati clinici adeguatamente controllati ottenuti attraverso la somministrazione del prodotto nel modo previsto, per ottenere un determinato risultato."

I modelli in vivo utilizzati durante gli studi di prova e di efficacia forniscono una lettura precoce della potenza misurando la risposta fisiologica desiderata negli animali. Per l'approvazione del prodotto, i test in vitro devono essere sviluppati fornendo una lettura quantificabile che può essere validata. L'approccio in vitro dell'introduzione di un gene in una linea cellulare e quindi la dimostrazione della sua espressione e attività funzionale è stato utilizzato per oltre un decennio nella valutazione delle proprietà di interazione farmaco-farmaco di piccole molecole. Quando viene sviluppato un farmaco a piccole molecole, viene valutato il potenziale di interazione della molecola come substrato, inibitore o induttore di specifici trasportatori di farmaci. La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha pubblicato il primo documento di concetto sul trasportatore di droghe nel 2004 e ha pubblicato la bozza di guida nel 2006. Questa bozza di guida è stata aggiornata di recente nel 2017.

Principali dello sviluppo di saggi di potenza per prodotti di terapia cellulare e genica

Sebbene i test di potenza in vitro siano stati utilizzati per lo sviluppo di farmaci a piccole molecole e anticorpi monoclonali per più di un decennio, le applicazioni nello sviluppo di prodotti di terapia cellulare e genica (CGT) sono più recenti. I prodotti CGT presentano sfide specifiche per lo sviluppo di test di potenza in vitro dovuti a:

meccanismi d'azione complessi e / o poco chiari

complicati processi produttivi

attributi di qualità critica variabile (CQA)

dati clinici preclinici e precoci ridotti con cui informare lo sviluppo

Lo sviluppo di saggi di potenza in vitro per i prodotti CGT comprende almeno due passaggi. Primo: deve essere dimostrato che il vettore può trasferire materiale genetico in una cellula. Secondo: deve essere dimostrato che il materiale genetico trasferito ha l'effetto biologico desiderato nelle cellule trasdotte.

A causa della complessità dei meccanismi d'azione di alcuni prodotti CGT, potrebbe essere necessario più di un dosaggio per caratterizzare diversi aspetti della potenza. Le sfide legate allo sviluppo di test di potenza in vitro per i prodotti CGT si estendono a considerazioni di fase successiva per la validazione e i test di routine come la catena di approvvigionamento, l'automazione dei test e lo sviluppo di standard di riferimento. Man mano che un numero maggiore di prodotti arriva sul mercato, la domanda per superare queste sfide e migliorare l'efficienza aumenterà.

Sviluppo di saggi di potenza in vitro per impostazioni cGMP

La convalida di linee cellulari biologicamente rilevanti come modelli in vitro di potenza terapeutica è un approccio riconosciuto dalle autorità regolatorie. Dal 2000, la FDA ha accettato i sistemi di coltura cellulare epiteliale in vitro per rinunciare agli studi clinici. La guida del biowaiver basata su BCS (FDA Biopharmaceutics Classification System) delinea le caratteristiche e i requisiti della linea cellulare per dimostrare l'idoneità di un sistema di test.3

Lo sviluppo di un test di potenza in vitro per accompagnare un prodotto CGT approvato comporta una serie di attività che possono essere suddivise in quattro fasi chiave.

Fase 1: stabilire un profilo di dosaggio ottimale

È importante stabilire un profilo di saggio e criteri di fattibilità nelle prime fasi del processo di sviluppo. Ciò include considerazioni scientifiche per il gene di interesse, meccanismi di azione, funzioni biologiche rilevanti e se sono necessari più test per dimostrare queste attività. La progettazione del dosaggio dovrebbe tenere conto della comprensione limitata dei processi di fabbricazione finali, nonché delle potenziali differenze tra la sostanza e il prodotto. Dovrebbe anche limitare la quantità di materiale di prova richiesto.

Le domande chiave includono:

L'espressione e l'attività funzionale dovrebbero essere entrambe considerate in un singolo test?

Il test verrà utilizzato per caratterizzare sia la sostanza che il prodotto farmaceutico?

Esistono analisi preesistenti che possono raggiungere alcuni di questi obiettivi?

Quali considerazioni sul capside, sul gene, sull'enzima o sulla proteina di interesse devono essere fatte?

Quali requisiti di tempo, costi e conformità si verificano in ogni fase dello sviluppo del dosaggio?

Quale livello di tolleranza per la sensibilità, la specificità e la variabilità del dosaggio sarà accettabile?

Un approccio comune è quello di utilizzare un dosaggio di potenza relativa per combattere la variabilità intrinseca del dosaggio. La risposta di un campione di prova viene confrontata con quella di uno standard di riferimento designato testato in parallelo. La potenza è riportata come relativa allo standard di riferimento, piuttosto che una risposta assoluta. L'identificazione di uno standard di riferimento biologicamente attivo è fondamentale per la progettazione del dosaggio finale. Una volta stabilito il profilo ideale, può essere utilizzato per guidare lo sviluppo del dosaggio e garantire che vengano stabiliti i controlli, le repliche e le statistiche appropriate per dimostrare tutti i parametri del dosaggio richiesti.

Uno dei reagenti chiave del test di potenza è il biorilevante sistema di test (cellula bersaglio) che può accettare il gene e supportare il meccanismo d'azione desiderato. L'identificazione del profilo della cella target per il test di potenza è un passaggio importante e le considerazioni includono:

considerazioni generali sulla coltura cellulare come disponibilità, crescita e morfologia

caratteristiche specifiche del prodotto come la compatibilità con il capside, il promotore e qualsiasi enzima o proteina interagente

caratterizzazione della linea cellulare per facilitare l'espressione e saggi funzionali

Potrebbe essere necessario selezionare diverse linee cellulari per determinare il sistema di test ottimale. La creazione di linee cellulari trasfettate stabilmente personalizzate può essere richiesta per ottenere il profilo desiderato.

Ottimizzazione del dosaggio

Durante questa fase, ogni fase indipendente del dosaggio viene ottimizzata rispetto al dosaggio di potenza complessivo. L'ottimizzazione del processo può includere:

messa a punto di condizioni di coltura cellulare come densità cellulare, formato di placcatura e tempo di trasduzione

produzione, manipolazione e stabilità del lisato cellulare trasdotto per formare un reagente funzionale

parametri del dosaggio funzionale tra cui concentrazione del substrato, solvente e stabilità; tempo e temperatura di incubazione; prestazione della norma di riferimento; e specificità dei controlli positivi e negativi

metodo di rilevazione utilizzato per quantificare l'output dal test funzionale (estrazione, linearità, specificità, accuratezza e precisione per l'analita di interesse)

In questa fase, si consiglia di utilizzare le statistiche per guidare la progettazione del dosaggio utilizzando la progettazione multifattoriale di esperimenti e un'adeguata strategia di replica basata su fonti di variabilità note o attese. L'analisi statistica dovrebbe essere utilizzata durante l'ottimizzazione del dosaggio per determinare i criteri di accettazione per i trattamenti di controllo, standard di riferimento e campioni di prova; distribuzione e trasformazione dei dati per adattarsi al modello statistico appropriato; e procedure per identificare e gestire i valori anomali.

Ogni fase del dosaggio deve avere i propri criteri di idoneità e accettazione del sistema per garantire l'inclusione di dati affidabili. Esistono diverse linee guida disponibili per la progettazione e la validazione di saggi biologici per applicazioni generali e quelle specifiche per i test di potenza per i prodotti CGT sono state promulgate da diverse autorità:

La FDA

Agenzia europea per i medicinali 

Il Consiglio internazionale per l'armonizzazione dei requisiti tecnici per i prodotti farmaceutici per uso umano (linee guida di validazione) 5

Farmacopea degli Stati Uniti (capitoli per la progettazione e la validazione di saggi biologici) 6–9

Le linee guida concordano i parametri rilevanti richiesti per la validazione del dosaggio, come accuratezza, precisione, linearità e specificità. Tuttavia, la valutazione dei parametri è specifica per ciascun tipo di prodotto. Ciò è dovuto all'interdipendenza di molti metodi e reagenti comunemente usati nello sviluppo del test.

Fase 4: gestione del programma a lungo termine

Il processo di sviluppo del dosaggio di potenza segue il ciclo di vita del prodotto CGT. Nelle diverse fasi dello sviluppo del prodotto, l'approccio, la progettazione e il perfezionamento del dosaggio possono cambiare. Dal punto di vista dei test analitici, i laboratori che eseguono questi saggi complessi devono essere in grado di operare all'interno di una struttura conforme a GMP soddisfacendo le linee guida CFR Parte 11 e Allegato 11 per l'integrità dei dati.

I reagenti critici devono essere caratterizzati per criteri di qualità e qualificazione con una catena di approvvigionamento ben definita e ridondanza integrata. La ridondanza è inoltre necessaria per il personale addestrato e le attrezzature specializzate per una corretta attuazione in ambito GMP. Gli approcci statistici di progettazione e analisi possono essere personalizzati per adattare le linee guida tradizionali della farmacopea degli Stati Uniti alla complessa natura dei prodotti CGT. Infine, da un punto di vista commerciale, il programma di rilascio del lotto e la disponibilità del prodotto previsti possono modellare il progetto del dosaggio finale di potenza, insieme a qualsiasi feedback normativo sull'approccio del dosaggio di potenza. È importante discutere anticipatamente con la FDA e spesso comunicare l'approccio del dosaggio di potenza previsto.

Da:

https://www.genengnews.com/insights/potency-assays-for-cell-and-gene-therapy/