Beyond the Surface. Uncovering the layers of immune cell complexity / Oltre la superficie. Scoprire gli strati della complessità delle cellule immunitarie
Beyond the
Surface. Uncovering the layers
of immune cell complexity / Oltre la superficie. Scoprire gli strati della complessità delle cellule immunitarie
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Today, immunology and infectious disease researchers continue to advance our understanding of significant health issues including cancer, autoimmune diseases, and emerging pathogens.
Gain a Holistic View of the Immune System
Immunology research has been at the forefront of many important scientific and medical breakthroughs in the past century, including vaccine development, tissue matching for safe organ transplantation, and immuno-oncology therapies. Today, immunology and infectious disease researchers continue to advance our understanding of significant health issues including cancer, autoimmune diseases, and emerging pathogens. However, their efforts face significant challenges due to the complex, dynamic, and heterogeneous nature of the immune system and the limitations of prevailing research tools. In order to comprehensively monitor and understand an immune response, scientists need the ability to characterize cell types and functional states in individual cells at high throughput. To this end, techniques such as flow cytometry (Flow) and mass cytometry (cytometry by time of flight, or CyTOF) have enabled immunologists to sort and classify cells into distinct types and states based on cell surface proteins. However, relying on cell surface markers alone leaves most of a cell’s molecular characteristics hidden and fails to further differentiate cells that express the same surface proteins or between different clonotypes of T or B cells.
Combine Gene and Cell Surface Marker Measurements for Improved Subtype and Cell State Identification High throughput single cell RNA sequencing technologies have enabled important advances in the understanding of innate and adaptive immunity. For example, using the Chromium Single Cell Gene Expression Solution, researchers have discovered evidence for the generation of memory-like CD4+ T cells in the human fetal intestine, charted the evolutionary architecture of the innate immune response , and unveiled previously unappreciated levels of heterogeneity in the bone marrow microenvironment. However, while gene expression profiling provides information about the type and quantity of mRNA transcripts produced, the abundance and isoforms of expressed proteins cannot always be inferred directly from mRNA readout alone. Likewise, relying on cell surface markers alone will leave much of the dynamic biology of immune cells undiscovered, and it is well understood that extensive heterogeneity exists even within immune cell populations classified as a single lineage based on surface markers .
Unlock the True Diversity of the Immune Repertoire for the Identification of Functional Phenotype and Clonality The specificity of adaptive immunity relies on a vast repertoire of T- and B-cell receptors generated through somatic recombination of multiple possible gene segments, which results in unique antigen receptor expression on a cell-by-cell basis. Our Chromium Single Cell Immune Profiling Solution can also be used to simultaneously profile gene expression and examine paired full-length receptor sequencing for unbiased clonotype analysis of T- and B-cell populations in individual cells. We used this solution to investigate the tumor microenvironment (TME) as well as the adaptive immune phenotype in tumor samples from a colorectal cancer (CRC) and a squamous cell non-small cell lung carcinoma (NSCLC). In the first step of this analysis, we examined gene expression profiles in each sample to characterize the heterogeneous cell populations. Both tumors showed significant populations of immune cell types, such as tumor infiltrating lymphocytes (TILs), including T cells, B cells, and plasma cells. While the presence of these immune cell populations in the tumor could be indicative of an active immune response, without examining the lymphocyte receptor sequences it is difficult to obtain a true understanding of the adaptive immune response in these tumors. In the CRC tumor, the top T-cell clonotype displayed limited expansion (<1% of all T-cell clonotypes). However, when the Ig repertoire of the plasma cell cluster was examined, the dominant clonotype made up >4% of all B-cell clonotypes. Overlaying the clonotype Ig data on gene expression based cell cluster projections revealed that the dominant clonotype occurs within the plasma cell cluster. This striking clonal expansion suggests that these plasma cells were generating tumor-specific antibodies. In the NSCLC tumor, the most abundant Ig clonotype showed limited clonal expansion. The top paired clonotype contributed to just over 1% of all clonotypes and was not localized to a specific cluster. Examining the TCR sequencing data in conjunction with the gene expression data revealed that the top two clonotypes identified were cytotoxic T cells (CD8+), although limited expansion of these clones was seen (~1% of all clonotypes). Thus, we observed no evidence of a tumorspecific immune response in the lung cancer tumor. Using the Chromium Single Cell Immune Profiling Solution to combine gene expression and immune repertoire sequencing data for the same single cells, we were able to deduce both the functional phenotype of the immune cells that infiltrated the tumor and the clonality of these cells. While a large immune cell infiltrate was observed in gene expression data from both tumors, only by coupling this to immune cell clonotypes were we able to observe the extent of expansion and, by implication, the presence or absence of a tumor-specific immune response.
Understand the Impact of Epigenetics for Subtype Classification and Lineage Determination While assaying RNA and protein expression at single cell resolution has improved the ability to classify cell types and measure cell-to-cell phenotypic variation, the underlying epigenetic changes that drive lineage commitment and regulate gene expression are still not well known. Understanding the epigenetic relationships between the various cell lineages that emerge during hematopoietic differentiation, as well as the molecular pathways that regulate gene expression during transitions between distinct lymphocyte activation states, is essential for understanding the immune response and developing new immune-therapeutic protocols. Recent innovations have enabled researchers to begin studying the epigenetic landscape at the single cell level by measuring cell-to-cell variations in the open chromatin landscape. The Chromium Single Cell Assay for Transposase Accessible Chromatin (ATAC) Solution provides a robust approach to profile the chromatin landscape in hundreds to tens of thousands of cells in parallel. Using this solution, we profiled >9,000 nuclei from PBMCs and clustered the single nuclei accessibility profiles with Cell Ranger ATAC, our turnkey analysis software for analyzing single cell epigenetic data. This analysis identified nine distinct functional cell types and enabled clear distinction between effector, memory, and naïve T cells. Next, we examined chromatin accessibility at known marker loci by aggregating reads from all cells within a cluster and demonstrated that the accessibility of chromatin at each cell surface marker gene examined was associated with the cell type. For example, monocytes and dendritic cells showed open chromatin at the CD33 locus while all lymphoid lineage clusters shared a common pattern of open chromatin around the CD79A locus. Importantly, chromatin accessibility at memory-associated loci, such as LEF1 (a lineage determining transcription factor), and effector function loci, such as Gzmb (a serine protease), could be used to distinguish cell activation states within cell types. Thus, assaying chromatin accessibility at single cell resolution enabled us to dissect cellular heterogeneity and identify cell-type-specific gene regulatory patterns. Although single cell epigenetic profiling techniques have only been available for a short time, they have already made a mark in immunology research. Using various single cell ATAC protocols, researchers have characterized leukemic and nonleukemic regulatory pathways in patient T cells, observed cis and trans regulators of naïve and memory T cell states, and identified epigenetic biomarkers for T cell exhaustion. Most recently, researchers used the Chromium Single Cell ATAC Solution to profile chromatin in the development of human immune cells and T cell exhaustion in tumors.
Furthering the Study of Infectious Disease, Autoimmunity, and Cancer with Single Cell Sequencing Tools and Multiomics
Developing an extensive understanding of the immune system, both innate and adaptive, requires the proper tools to further dissect the complex orchestration of the immunological response to infections, autoimmunity, cancer, and other pathologies. Single cell sequencing technologies can be used to profile tissues and identify the molecular drivers of disease, study immune function, and identify developmental trajectories. Methods such as the Single Cell Solutions from 10x Genomics are the only way to directly observe antigen binding to T cells while, at the same time, generating sequences of paired and recombined alpha and beta TCR genes, measuring gene and cell surface protein expression, and directly linking all of these outputs together. Single Cell ATAC will provide even more improvements to immune phenotyping and enable researchers to study the epigenetic pathways underlying allergies, autoimmune disorders, and immunotherapy resistance. The insights gained can be applied to identify functional states and discover neo-antigens, or, in therapeutic applications, to significantly impact the study of human health and disease.
ITALIANO
Oggi, i ricercatori di immunologia e malattie infettive continuano a migliorare la nostra comprensione di importanti problemi di salute tra cui cancro, malattie autoimmuni e agenti patogeni emergenti.
Ottieni una visione olistica del sistema immunitario.
La ricerca sull'immunologia è stata in prima linea in molte importanti scoperte scientifiche e mediche nel secolo scorso, tra cui lo sviluppo di vaccini, la corrispondenza dei tessuti per il trapianto di organi sicuro e le terapie di immuno-oncologia. Oggi, i ricercatori di immunologia e malattie infettive continuano a migliorare la nostra comprensione di importanti problemi di salute tra cui cancro, malattie autoimmuni e agenti patogeni emergenti. Tuttavia, i loro sforzi affrontano sfide significative a causa della natura complessa, dinamica ed eterogenea del sistema immunitario e dei limiti degli strumenti di ricerca prevalenti. Al fine di monitorare e comprendere in modo completo una risposta immunitaria, gli scienziati hanno bisogno della capacità di caratterizzare i tipi di cellule e gli stati funzionali nelle singole cellule ad alto rendimento. A tal fine, tecniche come la citometria a flusso (Flow) e la citometria di massa (citometria per tempo di volo o CyTOF) hanno consentito agli immunologi di ordinare e classificare le cellule in tipi e stati distinti in base alle proteine della superficie cellulare. Tuttavia, basarsi solo sui marcatori della superficie cellulare lascia nascosta la maggior parte delle caratteristiche molecolari di una cellula e non riesce a differenziare ulteriormente le cellule che esprimono le stesse proteine di superficie o tra clonotipi diversi di cellule T o B.
Combina misurazioni di marcatori di superficie genica e cellulare per una migliore identificazione del sottotipo e dello stato della cellula Le tecnologie di sequenziamento dell'RNA a singola cellula ad alto rendimento hanno consentito importanti progressi nella comprensione dell'immunità innata e adattativa. Ad esempio, usando la soluzione di espressione genica a singola cellula al cromo, i ricercatori hanno scoperto prove per la generazione di cellule T CD4 + simili alla memoria nell'intestino fetale umano, tracciato l'architettura evolutiva della risposta immunitaria innata e svelato livelli di eterogeneità precedentemente non apprezzati nel microambiente del midollo osseo. Tuttavia, mentre la profilazione dell'espressione genica fornisce informazioni sul tipo e sulla quantità di trascrizioni di mRNA prodotte, l'abbondanza e le isoforme delle proteine espresse non possono sempre essere dedotte direttamente dalla sola lettura dell'mRNA. Allo stesso modo, basarsi solo sui marcatori della superficie cellulare lascerà inesplorata gran parte della biologia dinamica delle cellule immunitarie ed è ben noto che esiste un'ampia eterogeneità anche all'interno delle popolazioni di cellule immunitarie classificate come una singola discendenza basata su marcatori di superficie.
Sblocca la vera diversità del repertorio immunitario per l'identificazione del fenotipo funzionale e della clonalità.
La specificità dell'immunità adattativa si basa su un vasto repertorio di recettori delle cellule T e B generati attraverso la ricombinazione somatica di molteplici possibili segmenti genici, che si traduce in un unico recettore dell'antigene espressione su base cellula per cellula. La nostra soluzione di profilatura immunitaria a singola cellula al cromo può anche essere utilizzata per profilare simultaneamente l'espressione genica ed esaminare il sequenziamento dei recettori a lunghezza intera accoppiato per l'analisi del clonotipo imparziale delle popolazioni di cellule T e B nelle singole cellule. Abbiamo usato questa soluzione per studiare il microambiente tumorale (TME) e il fenotipo immunitario adattativo nei campioni di tumore da un carcinoma del colon-retto (CRC) e un carcinoma polmonare non a piccole cellule a cellule squamose (NSCLC). Nella prima fase di questa analisi, abbiamo esaminato i profili di espressione genica in ciascun campione per caratterizzare le popolazioni cellulari eterogenee. Entrambi i tumori hanno mostrato popolazioni significative di tipi di cellule immunitarie, come linfociti infiltranti il tumore (TIL), tra cui cellule T, cellule B e plasmacellule. Mentre la presenza di queste popolazioni di cellule immunitarie nel tumore potrebbe essere indicativa di una risposta immunitaria attiva, senza esaminare le sequenze del recettore dei linfociti, è difficile ottenere una vera comprensione della risposta immunitaria adattativa in questi tumori. Nel tumore CRC, il clonotipo di cellula T superiore ha mostrato un'espansione limitata (<1% di tutti i clonotipi di cellule T). Tuttavia, quando è stato esaminato il repertorio Ig del cluster di plasmacellule, il clonotipo dominante costituiva> 4% di tutti i clonotipi di cellule B. Sovrapponendo i dati di clonotipo Ig su proiezioni di cluster cellulari basati sull'espressione genica, è emerso che il clonotipo dominante si verifica all'interno del cluster di cellule plasmatiche. Questa sorprendente espansione clonale suggerisce che queste plasmacellule stessero generando anticorpi specifici per il tumore. Nel tumore NSCLC, il clonotipo di Ig più abbondante ha mostrato un'espansione clonale limitata. Il clonotipo associato ha contribuito a poco più dell'1% di tutti i clonotipi e non è stato localizzato in un cluster specifico.
L'esame dei dati di sequenziamento del TCR insieme ai dati di espressione genica ha rivelato che i primi due clonotipi identificati erano cellule T citotossiche (CD8 +), sebbene sia stata osservata un'espansione limitata di questi cloni (~ 1% di tutti i clonotipi). Pertanto, non abbiamo osservato alcuna evidenza di una risposta immunitaria specifica per tumore nel tumore polmonare. Utilizzando la soluzione di profilatura immunitaria a singola cellula al cromo per combinare i dati di sequenziamento dell'espressione genica e del repertorio immunitario per le stesse singole cellule, siamo stati in grado di dedurre sia il fenotipo funzionale delle cellule immunitarie che si sono infiltrate nel tumore sia la clonalità di queste cellule. Mentre un grande infiltrato di cellule immunitarie è stato osservato nei dati di espressione genica di entrambi i tumori, solo accoppiandolo ai clonotipi di cellule immunitarie siamo stati in grado di osservare l'entità dell'espansione e, implicitamente, la presenza o l'assenza di una risposta immunitaria specifica del tumore.
Comprendere l'impatto dell'epigenetica per la classificazione dei sottotipi e la determinazione del lignaggio
Mentre il dosaggio dell'RNA e dell'espressione proteica alla risoluzione di singola cellula ha migliorato la capacità di classificare i tipi di cellule e misurare la variazione fenotipica cellula-cellula, i cambiamenti epigenetici sottostanti che guidano l'impegno del lignaggio e regolano il gene l'espressione non è ancora ben nota. Comprendere le relazioni epigenetiche tra i vari lignaggi cellulari che emergono durante la differenziazione ematopoietica, nonché i percorsi molecolari che regolano l'espressione genica durante le transizioni tra stati distinti di attivazione dei linfociti, è essenziale per comprendere la risposta immunitaria e sviluppare nuovi protocolli immunoterapici. Le recenti innovazioni hanno permesso ai ricercatori di iniziare a studiare il paesaggio epigenetico a livello di singola cellula misurando le variazioni da cellula a cellula nel panorama cromatinico aperto. La soluzione di analisi di singole cellule di cromo per la trasposizione di cromatina accessibile (ATAC) fornisce un approccio solido per profilare il panorama della cromatina in centinaia o decine di migliaia di cellule in parallelo. Utilizzando questa soluzione, abbiamo profilato> 9.000 nuclei dai PBMC e raggruppato i profili di accessibilità dei singoli nuclei con Cell Ranger ATAC, il nostro software di analisi chiavi in mano per l'analisi dei dati epigenetici a singola cellula. Questa analisi ha identificato nove tipi di cellule funzionali distinte e ha consentito una chiara distinzione tra cellule T effettrici, di memoria e naïve. Successivamente, abbiamo esaminato l'accessibilità della cromatina in loci marker noti aggregando le letture da tutte le cellule all'interno di un cluster e dimostrato che l'accessibilità della cromatina in ciascun gene marcatore della superficie cellulare esaminato era associata al tipo di cellula. Ad esempio, i monociti e le cellule dendritiche hanno mostrato cromatina aperta nel locus CD33 mentre tutti i gruppi di lignaggio linfoide condividevano un modello comune di cromatina aperta attorno al locus CD79A. È importante sottolineare che l'accessibilità della cromatina in loci associati alla memoria, come LEF1 (un fattore di trascrizione determinante lineare), e loci di funzione effettrice, come Gzmb (una proteasi serinica), potrebbero essere utilizzati per distinguere gli stati di attivazione cellulare all'interno dei tipi di cellule. Pertanto, l'analisi dell'accessibilità della cromatina alla risoluzione di una singola cellula ci ha permesso di sezionare l'eterogeneità cellulare e identificare i modelli regolatori genetici specifici del tipo di cellula. Sebbene le tecniche di profilazione epigenetica a singola cellula siano disponibili solo da poco tempo, hanno già lasciato un segno nella ricerca immunologica. Utilizzando vari protocolli ATAC a singola cellula, i ricercatori hanno caratterizzato i percorsi regolatori leucemici e non leucemici nelle cellule T dei pazienti, hanno osservato regolatori cis e trans di stati delle cellule T naïve e di memoria e hanno identificato biomarcatori epigenetici per l'esaurimento delle cellule T. Più recentemente, i ricercatori hanno utilizzato la soluzione ATAC a singola cellula di cromo per profilare la cromatina nello sviluppo delle cellule immunitarie umane e l'esaurimento delle cellule T nei tumori.
Promuovere lo studio delle malattie infettive, dell'autoimmunità e del cancro con singola cellula
Strumenti di sequenziamento e multiomica
Lo sviluppo di una vasta conoscenza del sistema immunitario, sia innato che adattivo, richiede gli strumenti adeguati per sezionare ulteriormente la complessa orchestrazione della risposta immunologica a infezioni, autoimmunità, cancro e altre patologie. Le tecnologie di sequenziamento di singole cellule possono essere utilizzate per profilare i tessuti e identificare i driver molecolari della malattia, studiare la funzione immunitaria e identificare traiettorie di sviluppo. Metodi come Single Cell Solutions di 10x Genomics sono l'unico modo per osservare direttamente il legame dell'antigene con le cellule T mentre, allo stesso tempo, generano sequenze di geni TCR alfa e beta accoppiati e ricombinati, misurando l'espressione di proteine genetiche e di superficie cellulare e collegando direttamente tutti questi output insieme.
L'ATAC a singola cellula fornirà ancora più miglioramenti alla fenotipizzazione immunitaria e consentirà ai ricercatori di studiare le vie epigenetiche alla base di allergie, disturbi autoimmuni e resistenza immunitaria. Le intuizioni acquisite possono essere applicate per identificare stati funzionali e scoprire neo-antigeni o, in applicazioni terapeutiche, per avere un impatto significativo sullo studio della salute umana e delle malattie.
Da:
https://cdn2.hubspot.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/10x%20Genomics/Immunology/Immunology_Capabilities_BeyondtheSurface.pdf?__hssc=8807082.3.1585610658775&__hstc=8807082.0a28891375176ecae92a4c27c0b0dcf2.1582928767263.1585404674558.1585610658775.27&__hsfp=1540939675&hsCtaTracking=87976a60-9df2-4c3b-8cd0-37c425708c84%7C46133000-6be4-44f1-9995-67629dbf3425
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Today, immunology and infectious disease researchers continue to advance our understanding of significant health issues including cancer, autoimmune diseases, and emerging pathogens.
Gain a Holistic View of the Immune System
Immunology research has been at the forefront of many important scientific and medical breakthroughs in the past century, including vaccine development, tissue matching for safe organ transplantation, and immuno-oncology therapies. Today, immunology and infectious disease researchers continue to advance our understanding of significant health issues including cancer, autoimmune diseases, and emerging pathogens. However, their efforts face significant challenges due to the complex, dynamic, and heterogeneous nature of the immune system and the limitations of prevailing research tools. In order to comprehensively monitor and understand an immune response, scientists need the ability to characterize cell types and functional states in individual cells at high throughput. To this end, techniques such as flow cytometry (Flow) and mass cytometry (cytometry by time of flight, or CyTOF) have enabled immunologists to sort and classify cells into distinct types and states based on cell surface proteins. However, relying on cell surface markers alone leaves most of a cell’s molecular characteristics hidden and fails to further differentiate cells that express the same surface proteins or between different clonotypes of T or B cells.
Combine Gene and Cell Surface Marker Measurements for Improved Subtype and Cell State Identification High throughput single cell RNA sequencing technologies have enabled important advances in the understanding of innate and adaptive immunity. For example, using the Chromium Single Cell Gene Expression Solution, researchers have discovered evidence for the generation of memory-like CD4+ T cells in the human fetal intestine, charted the evolutionary architecture of the innate immune response , and unveiled previously unappreciated levels of heterogeneity in the bone marrow microenvironment. However, while gene expression profiling provides information about the type and quantity of mRNA transcripts produced, the abundance and isoforms of expressed proteins cannot always be inferred directly from mRNA readout alone. Likewise, relying on cell surface markers alone will leave much of the dynamic biology of immune cells undiscovered, and it is well understood that extensive heterogeneity exists even within immune cell populations classified as a single lineage based on surface markers .
Unlock the True Diversity of the Immune Repertoire for the Identification of Functional Phenotype and Clonality The specificity of adaptive immunity relies on a vast repertoire of T- and B-cell receptors generated through somatic recombination of multiple possible gene segments, which results in unique antigen receptor expression on a cell-by-cell basis. Our Chromium Single Cell Immune Profiling Solution can also be used to simultaneously profile gene expression and examine paired full-length receptor sequencing for unbiased clonotype analysis of T- and B-cell populations in individual cells. We used this solution to investigate the tumor microenvironment (TME) as well as the adaptive immune phenotype in tumor samples from a colorectal cancer (CRC) and a squamous cell non-small cell lung carcinoma (NSCLC). In the first step of this analysis, we examined gene expression profiles in each sample to characterize the heterogeneous cell populations. Both tumors showed significant populations of immune cell types, such as tumor infiltrating lymphocytes (TILs), including T cells, B cells, and plasma cells. While the presence of these immune cell populations in the tumor could be indicative of an active immune response, without examining the lymphocyte receptor sequences it is difficult to obtain a true understanding of the adaptive immune response in these tumors. In the CRC tumor, the top T-cell clonotype displayed limited expansion (<1% of all T-cell clonotypes). However, when the Ig repertoire of the plasma cell cluster was examined, the dominant clonotype made up >4% of all B-cell clonotypes. Overlaying the clonotype Ig data on gene expression based cell cluster projections revealed that the dominant clonotype occurs within the plasma cell cluster. This striking clonal expansion suggests that these plasma cells were generating tumor-specific antibodies. In the NSCLC tumor, the most abundant Ig clonotype showed limited clonal expansion. The top paired clonotype contributed to just over 1% of all clonotypes and was not localized to a specific cluster. Examining the TCR sequencing data in conjunction with the gene expression data revealed that the top two clonotypes identified were cytotoxic T cells (CD8+), although limited expansion of these clones was seen (~1% of all clonotypes). Thus, we observed no evidence of a tumorspecific immune response in the lung cancer tumor. Using the Chromium Single Cell Immune Profiling Solution to combine gene expression and immune repertoire sequencing data for the same single cells, we were able to deduce both the functional phenotype of the immune cells that infiltrated the tumor and the clonality of these cells. While a large immune cell infiltrate was observed in gene expression data from both tumors, only by coupling this to immune cell clonotypes were we able to observe the extent of expansion and, by implication, the presence or absence of a tumor-specific immune response.
Understand the Impact of Epigenetics for Subtype Classification and Lineage Determination While assaying RNA and protein expression at single cell resolution has improved the ability to classify cell types and measure cell-to-cell phenotypic variation, the underlying epigenetic changes that drive lineage commitment and regulate gene expression are still not well known. Understanding the epigenetic relationships between the various cell lineages that emerge during hematopoietic differentiation, as well as the molecular pathways that regulate gene expression during transitions between distinct lymphocyte activation states, is essential for understanding the immune response and developing new immune-therapeutic protocols. Recent innovations have enabled researchers to begin studying the epigenetic landscape at the single cell level by measuring cell-to-cell variations in the open chromatin landscape. The Chromium Single Cell Assay for Transposase Accessible Chromatin (ATAC) Solution provides a robust approach to profile the chromatin landscape in hundreds to tens of thousands of cells in parallel. Using this solution, we profiled >9,000 nuclei from PBMCs and clustered the single nuclei accessibility profiles with Cell Ranger ATAC, our turnkey analysis software for analyzing single cell epigenetic data. This analysis identified nine distinct functional cell types and enabled clear distinction between effector, memory, and naïve T cells. Next, we examined chromatin accessibility at known marker loci by aggregating reads from all cells within a cluster and demonstrated that the accessibility of chromatin at each cell surface marker gene examined was associated with the cell type. For example, monocytes and dendritic cells showed open chromatin at the CD33 locus while all lymphoid lineage clusters shared a common pattern of open chromatin around the CD79A locus. Importantly, chromatin accessibility at memory-associated loci, such as LEF1 (a lineage determining transcription factor), and effector function loci, such as Gzmb (a serine protease), could be used to distinguish cell activation states within cell types. Thus, assaying chromatin accessibility at single cell resolution enabled us to dissect cellular heterogeneity and identify cell-type-specific gene regulatory patterns. Although single cell epigenetic profiling techniques have only been available for a short time, they have already made a mark in immunology research. Using various single cell ATAC protocols, researchers have characterized leukemic and nonleukemic regulatory pathways in patient T cells, observed cis and trans regulators of naïve and memory T cell states, and identified epigenetic biomarkers for T cell exhaustion. Most recently, researchers used the Chromium Single Cell ATAC Solution to profile chromatin in the development of human immune cells and T cell exhaustion in tumors.
Furthering the Study of Infectious Disease, Autoimmunity, and Cancer with Single Cell Sequencing Tools and Multiomics
Developing an extensive understanding of the immune system, both innate and adaptive, requires the proper tools to further dissect the complex orchestration of the immunological response to infections, autoimmunity, cancer, and other pathologies. Single cell sequencing technologies can be used to profile tissues and identify the molecular drivers of disease, study immune function, and identify developmental trajectories. Methods such as the Single Cell Solutions from 10x Genomics are the only way to directly observe antigen binding to T cells while, at the same time, generating sequences of paired and recombined alpha and beta TCR genes, measuring gene and cell surface protein expression, and directly linking all of these outputs together. Single Cell ATAC will provide even more improvements to immune phenotyping and enable researchers to study the epigenetic pathways underlying allergies, autoimmune disorders, and immunotherapy resistance. The insights gained can be applied to identify functional states and discover neo-antigens, or, in therapeutic applications, to significantly impact the study of human health and disease.
ITALIANO
Oggi, i ricercatori di immunologia e malattie infettive continuano a migliorare la nostra comprensione di importanti problemi di salute tra cui cancro, malattie autoimmuni e agenti patogeni emergenti.
Ottieni una visione olistica del sistema immunitario.
La ricerca sull'immunologia è stata in prima linea in molte importanti scoperte scientifiche e mediche nel secolo scorso, tra cui lo sviluppo di vaccini, la corrispondenza dei tessuti per il trapianto di organi sicuro e le terapie di immuno-oncologia. Oggi, i ricercatori di immunologia e malattie infettive continuano a migliorare la nostra comprensione di importanti problemi di salute tra cui cancro, malattie autoimmuni e agenti patogeni emergenti. Tuttavia, i loro sforzi affrontano sfide significative a causa della natura complessa, dinamica ed eterogenea del sistema immunitario e dei limiti degli strumenti di ricerca prevalenti. Al fine di monitorare e comprendere in modo completo una risposta immunitaria, gli scienziati hanno bisogno della capacità di caratterizzare i tipi di cellule e gli stati funzionali nelle singole cellule ad alto rendimento. A tal fine, tecniche come la citometria a flusso (Flow) e la citometria di massa (citometria per tempo di volo o CyTOF) hanno consentito agli immunologi di ordinare e classificare le cellule in tipi e stati distinti in base alle proteine della superficie cellulare. Tuttavia, basarsi solo sui marcatori della superficie cellulare lascia nascosta la maggior parte delle caratteristiche molecolari di una cellula e non riesce a differenziare ulteriormente le cellule che esprimono le stesse proteine di superficie o tra clonotipi diversi di cellule T o B.
Combina misurazioni di marcatori di superficie genica e cellulare per una migliore identificazione del sottotipo e dello stato della cellula Le tecnologie di sequenziamento dell'RNA a singola cellula ad alto rendimento hanno consentito importanti progressi nella comprensione dell'immunità innata e adattativa. Ad esempio, usando la soluzione di espressione genica a singola cellula al cromo, i ricercatori hanno scoperto prove per la generazione di cellule T CD4 + simili alla memoria nell'intestino fetale umano, tracciato l'architettura evolutiva della risposta immunitaria innata e svelato livelli di eterogeneità precedentemente non apprezzati nel microambiente del midollo osseo. Tuttavia, mentre la profilazione dell'espressione genica fornisce informazioni sul tipo e sulla quantità di trascrizioni di mRNA prodotte, l'abbondanza e le isoforme delle proteine espresse non possono sempre essere dedotte direttamente dalla sola lettura dell'mRNA. Allo stesso modo, basarsi solo sui marcatori della superficie cellulare lascerà inesplorata gran parte della biologia dinamica delle cellule immunitarie ed è ben noto che esiste un'ampia eterogeneità anche all'interno delle popolazioni di cellule immunitarie classificate come una singola discendenza basata su marcatori di superficie.
Sblocca la vera diversità del repertorio immunitario per l'identificazione del fenotipo funzionale e della clonalità.
La specificità dell'immunità adattativa si basa su un vasto repertorio di recettori delle cellule T e B generati attraverso la ricombinazione somatica di molteplici possibili segmenti genici, che si traduce in un unico recettore dell'antigene espressione su base cellula per cellula. La nostra soluzione di profilatura immunitaria a singola cellula al cromo può anche essere utilizzata per profilare simultaneamente l'espressione genica ed esaminare il sequenziamento dei recettori a lunghezza intera accoppiato per l'analisi del clonotipo imparziale delle popolazioni di cellule T e B nelle singole cellule. Abbiamo usato questa soluzione per studiare il microambiente tumorale (TME) e il fenotipo immunitario adattativo nei campioni di tumore da un carcinoma del colon-retto (CRC) e un carcinoma polmonare non a piccole cellule a cellule squamose (NSCLC). Nella prima fase di questa analisi, abbiamo esaminato i profili di espressione genica in ciascun campione per caratterizzare le popolazioni cellulari eterogenee. Entrambi i tumori hanno mostrato popolazioni significative di tipi di cellule immunitarie, come linfociti infiltranti il tumore (TIL), tra cui cellule T, cellule B e plasmacellule. Mentre la presenza di queste popolazioni di cellule immunitarie nel tumore potrebbe essere indicativa di una risposta immunitaria attiva, senza esaminare le sequenze del recettore dei linfociti, è difficile ottenere una vera comprensione della risposta immunitaria adattativa in questi tumori. Nel tumore CRC, il clonotipo di cellula T superiore ha mostrato un'espansione limitata (<1% di tutti i clonotipi di cellule T). Tuttavia, quando è stato esaminato il repertorio Ig del cluster di plasmacellule, il clonotipo dominante costituiva> 4% di tutti i clonotipi di cellule B. Sovrapponendo i dati di clonotipo Ig su proiezioni di cluster cellulari basati sull'espressione genica, è emerso che il clonotipo dominante si verifica all'interno del cluster di cellule plasmatiche. Questa sorprendente espansione clonale suggerisce che queste plasmacellule stessero generando anticorpi specifici per il tumore. Nel tumore NSCLC, il clonotipo di Ig più abbondante ha mostrato un'espansione clonale limitata. Il clonotipo associato ha contribuito a poco più dell'1% di tutti i clonotipi e non è stato localizzato in un cluster specifico.
L'esame dei dati di sequenziamento del TCR insieme ai dati di espressione genica ha rivelato che i primi due clonotipi identificati erano cellule T citotossiche (CD8 +), sebbene sia stata osservata un'espansione limitata di questi cloni (~ 1% di tutti i clonotipi). Pertanto, non abbiamo osservato alcuna evidenza di una risposta immunitaria specifica per tumore nel tumore polmonare. Utilizzando la soluzione di profilatura immunitaria a singola cellula al cromo per combinare i dati di sequenziamento dell'espressione genica e del repertorio immunitario per le stesse singole cellule, siamo stati in grado di dedurre sia il fenotipo funzionale delle cellule immunitarie che si sono infiltrate nel tumore sia la clonalità di queste cellule. Mentre un grande infiltrato di cellule immunitarie è stato osservato nei dati di espressione genica di entrambi i tumori, solo accoppiandolo ai clonotipi di cellule immunitarie siamo stati in grado di osservare l'entità dell'espansione e, implicitamente, la presenza o l'assenza di una risposta immunitaria specifica del tumore.
Comprendere l'impatto dell'epigenetica per la classificazione dei sottotipi e la determinazione del lignaggio
Mentre il dosaggio dell'RNA e dell'espressione proteica alla risoluzione di singola cellula ha migliorato la capacità di classificare i tipi di cellule e misurare la variazione fenotipica cellula-cellula, i cambiamenti epigenetici sottostanti che guidano l'impegno del lignaggio e regolano il gene l'espressione non è ancora ben nota. Comprendere le relazioni epigenetiche tra i vari lignaggi cellulari che emergono durante la differenziazione ematopoietica, nonché i percorsi molecolari che regolano l'espressione genica durante le transizioni tra stati distinti di attivazione dei linfociti, è essenziale per comprendere la risposta immunitaria e sviluppare nuovi protocolli immunoterapici. Le recenti innovazioni hanno permesso ai ricercatori di iniziare a studiare il paesaggio epigenetico a livello di singola cellula misurando le variazioni da cellula a cellula nel panorama cromatinico aperto. La soluzione di analisi di singole cellule di cromo per la trasposizione di cromatina accessibile (ATAC) fornisce un approccio solido per profilare il panorama della cromatina in centinaia o decine di migliaia di cellule in parallelo. Utilizzando questa soluzione, abbiamo profilato> 9.000 nuclei dai PBMC e raggruppato i profili di accessibilità dei singoli nuclei con Cell Ranger ATAC, il nostro software di analisi chiavi in mano per l'analisi dei dati epigenetici a singola cellula. Questa analisi ha identificato nove tipi di cellule funzionali distinte e ha consentito una chiara distinzione tra cellule T effettrici, di memoria e naïve. Successivamente, abbiamo esaminato l'accessibilità della cromatina in loci marker noti aggregando le letture da tutte le cellule all'interno di un cluster e dimostrato che l'accessibilità della cromatina in ciascun gene marcatore della superficie cellulare esaminato era associata al tipo di cellula. Ad esempio, i monociti e le cellule dendritiche hanno mostrato cromatina aperta nel locus CD33 mentre tutti i gruppi di lignaggio linfoide condividevano un modello comune di cromatina aperta attorno al locus CD79A. È importante sottolineare che l'accessibilità della cromatina in loci associati alla memoria, come LEF1 (un fattore di trascrizione determinante lineare), e loci di funzione effettrice, come Gzmb (una proteasi serinica), potrebbero essere utilizzati per distinguere gli stati di attivazione cellulare all'interno dei tipi di cellule. Pertanto, l'analisi dell'accessibilità della cromatina alla risoluzione di una singola cellula ci ha permesso di sezionare l'eterogeneità cellulare e identificare i modelli regolatori genetici specifici del tipo di cellula. Sebbene le tecniche di profilazione epigenetica a singola cellula siano disponibili solo da poco tempo, hanno già lasciato un segno nella ricerca immunologica. Utilizzando vari protocolli ATAC a singola cellula, i ricercatori hanno caratterizzato i percorsi regolatori leucemici e non leucemici nelle cellule T dei pazienti, hanno osservato regolatori cis e trans di stati delle cellule T naïve e di memoria e hanno identificato biomarcatori epigenetici per l'esaurimento delle cellule T. Più recentemente, i ricercatori hanno utilizzato la soluzione ATAC a singola cellula di cromo per profilare la cromatina nello sviluppo delle cellule immunitarie umane e l'esaurimento delle cellule T nei tumori.
Promuovere lo studio delle malattie infettive, dell'autoimmunità e del cancro con singola cellula
Strumenti di sequenziamento e multiomica
Lo sviluppo di una vasta conoscenza del sistema immunitario, sia innato che adattivo, richiede gli strumenti adeguati per sezionare ulteriormente la complessa orchestrazione della risposta immunologica a infezioni, autoimmunità, cancro e altre patologie. Le tecnologie di sequenziamento di singole cellule possono essere utilizzate per profilare i tessuti e identificare i driver molecolari della malattia, studiare la funzione immunitaria e identificare traiettorie di sviluppo. Metodi come Single Cell Solutions di 10x Genomics sono l'unico modo per osservare direttamente il legame dell'antigene con le cellule T mentre, allo stesso tempo, generano sequenze di geni TCR alfa e beta accoppiati e ricombinati, misurando l'espressione di proteine genetiche e di superficie cellulare e collegando direttamente tutti questi output insieme.
L'ATAC a singola cellula fornirà ancora più miglioramenti alla fenotipizzazione immunitaria e consentirà ai ricercatori di studiare le vie epigenetiche alla base di allergie, disturbi autoimmuni e resistenza immunitaria. Le intuizioni acquisite possono essere applicate per identificare stati funzionali e scoprire neo-antigeni o, in applicazioni terapeutiche, per avere un impatto significativo sullo studio della salute umana e delle malattie.
Da:
https://cdn2.hubspot.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/10x%20Genomics/Immunology/Immunology_Capabilities_BeyondtheSurface.pdf?__hssc=8807082.3.1585610658775&__hstc=8807082.0a28891375176ecae92a4c27c0b0dcf2.1582928767263.1585404674558.1585610658775.27&__hsfp=1540939675&hsCtaTracking=87976a60-9df2-4c3b-8cd0-37c425708c84%7C46133000-6be4-44f1-9995-67629dbf3425
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