p53’s Multiple Roles Are Acquired during Pluripotent Stem Cell Differentiation / I ruoli multipli di p53 vengono acquisiti durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti
p53’s Multiple Roles Are Acquired during Pluripotent Stem
Cell Differentiation / I ruoli multipli di p53 vengono acquisiti durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
The p53 gene is extremely important in cell biology as its role is to regulate the cell cycle and halt the formation of tumors, leading to its nickname the “tumor suppressor gene.”
However, previous efforts to determine whether p53 is behind apoptosis induced by DNA damage in pluripotent embryonic stem cells (ESCs) produced conflicting results. Initial studies said that it was not; later studies concluded that it was.
Now, researchers at the NIH have published a new report “Cell cycle arrest and apoptosis are not dependent on p53 prior to p53‐dependent embryonic stem cell differentiation” in Stem Cells that they say sorts through this maze of contradictions to finally determine that the multiple roles of p53 in cell cycle regulation and apoptosis are acquired during pluripotent stem cell differentiation.
Melvin L. DePamphilis, PhD, section chief of Eukaryotic DNA Replication at the National Institute of Child Health & Human Development, conducted the study along with his Institute colleagues Sushil K. Jaiswal, PhD, and John J. Oh.
“Previous efforts to determine whether or not the transcription factor and tumor suppressor protein p53 is required for DNA damage‐induced apoptosis in pluripotent embryonic stem cells (ESCs) produced contradictory conclusions. To resolve this issue, p53+/+ and p53−/− ESCs derived by two different methods were used to quantify time‐dependent changes in nuclear DNA content; annexin‐V binding; cell permeabilization; and protein expression, modification, and localization,” write the investigators.
“The results revealed that doxorubicin (Adriamycin [ADR]) concentrations 10 to 40 times less than commonly used in previous studies induced the DNA damage‐dependent G2‐checkpoint and completed apoptosis within the same time frame, regardless of the presence or absence of p53, p21, and PUMA. Increased ADR concentrations delayed initiation of apoptosis in p53−/− ESCs, but the rates of apoptosis remained equivalent. Similar results were obtained by inducing apoptosis with either staurosporine inhibition of kinase activities or WX8 disruption of lysosome homeostasis.”
“Differentiation of ESCs by LIF deprivation revealed p53‐dependent formation of haploid cells, increased genomic stability, and suppression of the G2‐checkpoint. Minimal induction of DNA damage now resulted in p53‐facilitated apoptosis, but regulation of pluripotent gene expression remained p53‐independent. Primary embryonic fibroblasts underwent p53‐dependent total cell cycle arrest (a prelude to cell senescence), and p53‐independent apoptosis occurred in the presence of 10‐fold higher levels of ADR, consistent with previous studies.”
“Taken together, these results reveal that the multiple roles of p53 in cell cycle regulation and apoptosis are first acquired during pluripotent stem cell differentiation.”
“If ESCs are to be used to form the basis of cell replacement therapies, then identifying the role or roles of p53 in pluripotent stem cells is essential,” said DePamphilis. “Our goal was to finally resolve this question of whether p53 is essential for inducing cell cycle arrest and/or apoptosis prior to ESC differentiation.”
The majority of earlier studies used ADR to induce apoptosis. ADR impacts DNA replication and mitosis, resulting in the accumulation of double-stranded DNA breaks in proliferating cells. Damaged DNA can trigger p53 to initiate apoptosis and prevent the duplication of damaged chromosomes.
As the levels of p53 rise, they prompt production of a protein called p21, which enforces a halt in the cycle dictated by p53. It does this by binding to and inhibiting the activity of the Cdk/cyclin complexes, whose job is to switch the cell cycle off and allow time for the damaged DNA to be repaired.
In the current study, the team likewise induced apoptosis using a 40-fold range of ADR concentrations as well as other chemotherapy drugs (staurosporine and WX8), all tested over a 50-fold range of cell seeding densities. To eliminate the possibility that conclusions depended on either the source or derivation of p53-/- ESCs, both wild-type and p53-/- ESCs derived directly from mouse blastocysts were characterized in parallel with ESCs in which the p53 genes were ablated in vitro from ESCs harboring conditional p53 gene knockouts.
“ESCs isolated from p53-/- blastocysts presented a chronic phenotype, whereas p53-/- ESCs engineered in vitro presented an acute phenotype that could be compared directly with their parental ESCs,” Jaiswal explained.
The results showed that regardless of derivation the ESCs did not require p53, p21 or PUMA (another critical protein involved in apoptosis that is induced by p53) either to activate the G2-checkpoint, which ensures that cells don’t initiate mitosis until damaged DNA is repaired, or to undergo apoptosis rapidly and efficiently.
“The effects of ADR concentration and cell confluency were marginal, but the effects of cell differentiation were dramatic; p53 dependent regulation of cell division and apoptosis were acquired during p53-dependent cell differentiation,” Oh said.
These results led the researchers to conclude that the study “unequivocally” demonstrates that the multiple roles of p53 in cell cycle regulation and apoptosis are first acquired during pluripotent stem cell differentiation.
ITALIANO
Il gene p53 è estremamente importante nella biologia cellulare in quanto il suo ruolo è di regolare il ciclo cellulare e arrestare la formazione di tumori, portando al suo soprannome di "gene soppressore del tumore".
Tuttavia, i precedenti sforzi per determinare se la p53 è alla base dell'apoptosi indotta dal danno al DNA nelle cellule staminali embrionali pluripotenti (ESC) ha prodotto risultati contrastanti. Gli studi iniziali hanno detto che non lo era; studi successivi hanno concluso che lo era.
Ora, i ricercatori del NIH hanno pubblicato un nuovo rapporto "L'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi non dipendono dalla p53 prima della differenziazione delle cellule staminali embrionali dipendente dalla p53". Attraverso questo labirinto di contraddizioni determinano infine che il multiplo di ruoli di p53 nella regolazione del ciclo cellulare e nell'apoptosi vengono acquisiti durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti.
Melvin L. DePamphilis, PhD, capo sezione della replicazione del DNA eucariotico presso l'Istituto nazionale per la salute dei bambini e lo sviluppo umano, ha condotto lo studio insieme ai suoi colleghi dell'Istituto Sushil K. Jaiswal, PhD e John J. Oh.
"Precedenti sforzi per determinare se il fattore di trascrizione e la proteina soppressore del tumore p53 sono necessari per l'apoptosi indotta da danno del DNA nelle cellule staminali embrionali pluripotenti (ESC) hanno prodotto conclusioni contraddittorie. Per risolvere questo problema, ESCs p53 + / + e p53 - / - derivati da due metodi diversi sono stati usati per quantificare i cambiamenti dipendenti dal tempo nel contenuto di DNA nucleare; legame allegato-V; permeabilizzazione cellulare; ed espressione proteica, modifica e localizzazione ”, scrivono gli investigatori.
"I risultati hanno rivelato che concentrazioni di doxorubicina (Adriamicina [ADR]) da 10 a 40 volte inferiori a quelle comunemente utilizzate in studi precedenti hanno indotto il checkpoint G2 dipendente dal danno del DNA e hanno completato l'apoptosi nello stesso lasso di tempo, indipendentemente dalla presenza o assenza di p53 , p21 e PUMA. L'aumento delle concentrazioni di ADR ha ritardato l'inizio dell'apoptosi negli ESC p53 - / -, ma i tassi di apoptosi sono rimasti equivalenti. Risultati simili sono stati ottenuti inducendo l'apoptosi con l'inibizione della staurosporina delle attività della chinasi o l'interruzione del WX8 dell'omeostasi del lisosoma. "
“La differenziazione degli ESC per deprivazione di LIF ha rivelato la formazione p53-dipendente di cellule aploidi, una maggiore stabilità genomica e la soppressione del checkpoint G2. La minima induzione del danno al DNA ora ha portato all'apoptosi facilitata dalla p53, ma la regolazione dell'espressione genica pluripotente è rimasta indipendente dalla p53. I fibroblasti embrionali primari sono stati sottoposti a arresto del ciclo cellulare totale dipendente dalla p53 (preludio alla senescenza cellulare) e l'apoptosi indipendente dalla p53 si è verificata in presenza di livelli di ADR 10 volte più alti, coerentemente con studi precedenti. "
"Nel loro insieme, questi risultati rivelano che i molteplici ruoli della p53 nella regolazione del ciclo cellulare e nell'apoptosi vengono acquisiti per la prima volta durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti."
"Se gli ESC devono essere utilizzati per formare la base delle terapie di sostituzione cellulare, è essenziale identificare il ruolo o i ruoli della p53 nelle cellule staminali pluripotenti", ha affermato DePamphilis. "Il nostro obiettivo era finalmente risolvere questa domanda se la p53 sia essenziale per indurre l'arresto del ciclo cellulare e / o l'apoptosi prima della differenziazione dell'ESC".
La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato l'ADR per indurre l'apoptosi. L'ADR influisce sulla replicazione e sulla mitosi del DNA, determinando l'accumulo di rotture del DNA a doppio filamento nelle cellule proliferanti. Il DNA danneggiato può innescare la p53 per iniziare l'apoptosi e prevenire la duplicazione dei cromosomi danneggiati.
All'aumentare dei livelli di p53, provocano la produzione di una proteina chiamata p21, che impone un arresto nel ciclo dettato dalla p53. Lo fa legandosi e inibendo l'attività dei complessi Cdk / ciclina, il cui compito è di spegnere il ciclo cellulare e consentire il tempo per la riparazione del DNA danneggiato.
In questo studio, il gruppo ha anche indotto l'apoptosi utilizzando una gamma di concentrazioni di ADR di 40 volte e altri farmaci chemioterapici (staurosporina e WX8), tutti testati su una gamma di densità di semina cellulare di 50 volte. Per eliminare la possibilità che le conclusioni dipendessero dalla fonte o dalla derivazione degli ESC p53 - / -, sia ESC wild-type che p53 - / - derivati direttamente dalle blastocisti di topo erano caratterizzati in parallelo con ESC in cui i geni p53 erano ablati in vitro dagli ESC che ospitano knockout genici p53 condizionali.
"Gli ESC isolati dalle blastocisti p53 - / - presentavano un fenotipo cronico, mentre gli ESC p53 - / - progettati in vitro presentavano un fenotipo acuto che poteva essere confrontato direttamente con i loro ESC parentali", ha spiegato Jaiswal.
I risultati hanno mostrato che, indipendentemente dalla derivazione, gli ESC non richiedevano p53, p21 o PUMA (un'altra proteina critica coinvolta nell'apoptosi indotta da p53) né per attivare il checkpoint G2, il che assicura che le cellule non inizino la mitosi fino a che il DNA danneggiato viene riparato o sottoposto a apoptosi in modo rapido ed efficiente.
“Gli effetti della concentrazione di ADR e della confluenza cellulare erano marginali, ma gli effetti della differenziazione cellulare erano drammatici; La regolazione dipendente dalla p53 della divisione cellulare e l'apoptosi sono state acquisite durante la differenziazione cellulare dipendente dalla p53 ", ha detto Oh.
Questi risultati hanno portato i ricercatori a concludere che lo studio "inequivocabilmente" dimostra che i molteplici ruoli della p53 nella regolazione del ciclo cellulare e nell'apoptosi vengono acquisiti per la prima volta durante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti.
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