Proteomic Mass Spec Assesses Biomolecular Teamwork / Le specifiche di massa proteomica valutano il lavoro di gruppo biomolecolare
Proteomic Mass Spec Assesses Biomolecular Teamwork / Le specifiche di massa proteomica valutano il lavoro di gruppo biomolecolare
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
At the University of Arkansas, Jeffrey A. Lewis, PhD, and colleagues are studying the role of protein acetylation in the heat shock response. Acetylation, the scientists suspect, plays a big role in various protein-protein interaction networks, far beyond its well-known role in modifying histones. To test their ideas, the scientists are probing how transcription factor acetylation influences protein function and gene expression. Ultimately, the scientists intend to “map” the heat shock response, specifying the relationships between upregulated genes (red nodes), downregulated genes (green nodes), and the genes’ protein-mediated functional relationships (edges). / All'Università dell'Arkansas, Jeffrey A. Lewis, PhD e colleghi stanno studiando il ruolo dell'acetilazione delle proteine nella risposta allo shock termico. L'acetilazione, sospettano gli scienziati, svolge un ruolo importante in varie reti di interazione proteina-proteina, ben oltre il suo ruolo ben noto nella modifica degli istoni. Per testare le loro idee, gli scienziati stanno studiando come l'acetilazione del fattore di trascrizione influenza la funzione delle proteine e l'espressione genica. In definitiva, gli scienziati intendono "mappare" la risposta allo shock termico, specificando le relazioni tra geni sovraregolati (nodi rossi), geni downregolati (nodi verdi) e le relazioni funzionali mediate dalle proteine (bordi) dei geni
Increasingly quantitative and dynamic, mass spectrometry
takes proteomics beyond headcounts and begins capturing subtle interactions and
convoluted processes.
Mass spectrometry can be used to globally analyze protein modifications such as glycosylation, in which case the technique’s success depends on whether biological samples contain detectable quantities of glycopeptides, even low-abundance glycopeptides. An enrichment technique developed by researchers at the Georgia Institute of Technology exploits a well-known interaction: reversible covalent binding between glycans and boronic acid. To effectively multiply the strength of this interaction, the researchers devised the “benzoboroxole octopus.” Benzoboroxole molecules derived from boronic acid are conjugated to a magnetic bead, much like the tentacles of an octopus are attached to the animal’s head. The glycoproteins ensnared by the octopus may be washed off the bead with a low-pH solution, resulting in an enriched sample.
Proteins have been called the workers of the cell, and cells have been likened to factories. So, it was only a matter of time before proteins, protein pathways, and entire proteomes came to be seen through a workforce management or operations management perspective. Initially, this kind of management is descriptive. It takes inventories. It conducts time-and-motion studies. But these are mere preludes. The real goal is to overcome management’s central problem: designing and controlling processes.
The operations management theme is becoming more pronounced in proteomics now that mass spectrometry technology is moving beyond static inventories and attendance sheets. It is becoming more quantitative and dynamic, taking account of diverse protein characteristics and activities—stability, folding, and protein-protein interactions. It is also looking at proteins while allowing them to remain in suitably rich contexts. For example, mass spectrometry techniques are revealing how cells behave—how they alter their structural biology—in the living cell. Somewhat narrower (but still expansive) settings include kinomes, stress response pathways, and glycosylated proteins.
It should be emphasized that the proteomic work that is being enabled by mass spectrometry is not merely descriptive. It is also practical. Ultimately, the idea is to improve the operations that are performed by the little factories known as living cells. If there are personnel problems, they can, perhaps, be resolved—at the individual level or at the team level—potentially improving healthcare outcomes.
Identifying onset of illness
“We looked at biomarkers that mark early transition points from wellness to chronic disease,” says Leroy Hood, MD, PhD, senior vice president and chief science officer at Providence St. Joseph Health, and chief strategy officer and professor at the Institute for Systems Biology. “[We hope to use these biomarkers] in systems approaches to find disease-deterring methods and therapies before disease manifests itself.”
In 2014, Hood and colleagues started a pilot study in which 108 healthy individuals were longitudinally followed with genome and phenome analyses, including the analysis of 300–400 proteins, 150 chemical analytes, and 800–900 metabolites from the blood. The investigators also analyzed the gut microbiome of the study participants and collected information about digitally self-measured parameters, including sleep and physical activity.
In the initial nine-month study, the phenome analyses were conducted every three months. Subsequently, 5000 more individuals were recruited into a four-year study. During the larger, longer study, over 100 of the participants developed various diseases.
“We were able to look at each of these patients in detail,” recalls Hood. “To assess the transition from wellness to disease, we analyzed blood samples for approximately 1200 analytes to see if we could find any outliers.”
Ultimately, five striking outliers were found, including three proteins that are members of the Notch receptor pathway, one of the most frequently activated signaling pathways in cancer.
Hood and colleagues are using this approach in a million-person project that will continue over the next five years. It aims to create a shared context for genomic and phenomic findings as well as electronic medical records.
“The whole vision of how we look at disease is going to be utterly transformed,” declares Hood. “It will mean having metrics to measure the degree and the extent of wellness, to detect the transition that initiates disease, and to follow the increasingly complex amplifications of disease.”
This paradigm change promises to disrupt clinical practice. “This is similar to what happened with the genome project,” suggests Hood. “It took five years to convince the world that we should do it, and once it was done, it generated technologies and data on many organisms that transformed how we think about biology.”
Dissecting the kinome
The proteomic methods used to profile protein kinase inhibitors should facilitate the identification and characterization of specific inhibitors. Unfortunately, conventional methods have contributed to a “plague” of nonspecific inhibitors, complains Lee M. Graves, PhD, professor of pharmacology at the University of North Carolina at Chapel Hill (UNC). To help dispel the plague, Graves contributes to the development of refined proteomic methods.
For example, Graves and his UNC colleagues (including the recently retired Gary L. Johnson, PhD) developed a platform called multiplexed inhibitor beads (MIBs). With this platform, several kinase inhibitors may be immobilized on a Sepharose column in a specificity gradient, allowing kinases to be captured at different layers on the column and subsequently examined by quantitative mass spectrometry. Because this approach combines MIBs and mass spectrometry, it is called MIB/MS. It can be used to reveal how kinome dynamics change in response to inhibitors or cellular conditions, or upon the emergence of drug resistance.
“With our capture method, we can see 75–80% of the expressed kinome, but not all kinases bind to the beads,” admits Graves. “Sometimes, we need to reengineer the chemical material to broaden the scope of capture.”
In collaboration with Nathaniel J. Moorman, PhD, associate professor of microbiology and immunology at UNC, Graves used MIB/MS to quantitate perturbations in >240 kinases in cells infected with human cytomegalovirus and profile the time-dependent changes in the cellular kinome. Using the data and viral replication assays, Moorman and Graves identified three inhibitors of viral replication that were effective at doses that did not show cellular toxicity. One of these compounds, an inhibitor of the serine threonine kinase MELK, caused an over 3-log decrease in viral replication, indicating its potential as a novel antiviral drug.
“This approach led to a large initiative to look at the kinome response to Middle East respiratory syndrome,” notes Graves. “We also anticipate looking at other pathogens, including herpes simplex virus and coronavirus, to profile the response and see whether some of the changes that occur can be targeted as new antiviral approaches.” Graves is currently working with leading virologists at UNC, supported by the Eshelman School of Pharmacy, to complete this important work.
In another study, Graves collaborated with UNC’s Channing Der, PhD, and others on a project that used a flow cytometry–based assay to screen a library of >800 protein kinase inhibitors. The investigators identified compounds that promoted either the stability or the degradation of MYC in a KRAS-mutant pancreatic ductal adenocarcinoma cell line. For example, CDK9 was found to enhance MYC protein stability through a previously unknown KRAS-independent mechanism that involved the phosphorylation of a specific serine.
“There is a huge amount of interest in using this technology to explore understudied kinases because our approach is unbiased,” asserts Graves.
The concept of kinome reprogramming is of particular interest in Graves’ group. Several studies revealed kinase remodeling in a time-dependent manner, largely involving transcriptional changes or their downregulation or degradation. “The dynamic nature of the kinome probably prevents single inhibitors from being as effective as they would because the kinome remodels around them and escapes their inhibitory effect,” explains Graves.
One of the limitations in kinome profiling experiments is that low-abundance proteins may not generate sufficient numbers of peptides to provide statistical confidence. “But with some new separation techniques and methods of quantification, some of those problems become less and less limiting,” Graves maintains. “As the mass spectrometers become more sensitive, we are able to see more things than we were able to see before.”
Determining protein structures in living cells
“My lab is pursuing a lot of method development, and the major question we are asking is whether we can perform structural biology in cellular systems to provide information across the proteome,” says Lisa M. Jones, PhD, associate professor of pharmacological sciences at the University of Maryland School of Pharmacy. One of the techniques used in Jones’ lab is fast photochemical oxidation of proteins (FPOP), a mass spectrometry–based protein footprinting approach. It is proving to be valuable in structural proteomics studies.
“We try to get around purification by studying the proteins directly in their native cellular environment,” Jones points out.
FPOP relies on the irreversible labeling of exposed amino acid side chains by hydroxyl radicals. In this technique, a flowing solution of protein and hydrogen peroxide is irradiated by a laser, triggering the production of hydroxyl radicals that subsequently modify the protein. Jones and colleagues expanded FPOP and created in-cell FPOP (IC-FPOP), which allowed protein footprinting to be performed in live cells for the first time. The technique’s potential was demonstrated in successful studies of protein-protein interactions in Caenorhabditis elegans and several mammalian cell lines.
A more recent approach developed in Jones’ lab, Platform Incubator with movable XY stage (PIXY), replaced the single-flow system with a sterile incubator that incorporates not just a mobile stage, but also peristaltic pumps, as well as mirrors for guiding laser beams.
“It takes about 20 seconds to perform an experiment with this new platform, as compared to 10 minutes with our previous flow system,” asserts Jones. Generally, the time scale for the tertiary structure folding of proteins ranges from milliseconds to seconds, and powerfully positions PIXY to detect events in this range.
A challenge with these experiments is the vast amount of data that is generated. “Data analysis is definitely a bottleneck,” advises Jones. “A good software that not just searches the data but helps with quantitation would be very helpful.”
Gauging cellular responses to environmental cues
“For a long time, I have been interested in understanding how cells sense and respond to their environment,” says Jeffrey A. Lewis, PhD, assistant professor of biological sciences at the University of Arkansas. The cellular response to environmental factors has been traditionally studied at the transcriptional level, by capturing changes in RNA molecules over time. This approach predominated, in part, because RNA was deemed a reasonable proxy for protein. Also, RNA is much easier to quantitate.
“With the availability of sensitive mass spectrometers, we are now able to accurately quantitate protein,” Lewis maintains. Protein quantitation, though not as good as RNA quantitation, is good enough, he continues, to allow investigators to “start looking at the ultimate mediators of environmental responses.”
A major effort in Lewis’ group is focusing on interrogating post-translational protein modifications during the classic heat shock response, a pathway that has been well studied at the transcriptional level in several organisms. “We used mass spectrometry to get a detailed view of an acute and dynamic measure of the stress response over time,” notes Lewis.
Using tandem mass tagging (TMT) triple-stage mass spectrometry (MS3), scientists in Lewis’ lab examined the heat shock response in the budding yeast over nine time points, from five minutes to four hours after the heart shock. This approach quantitated >2000 proteins and revealed that their differential expression peaked approximately 90 minutes after the heat shock as compared to unstressed, control cells. The induced proteins could be organized into three clusters, and analyses of transcription factors that regulated the genes from each cluster indicated that early-induced gene were more likely to be the ones that directly respond to the heat shock.
One of the challenges in quantitative proteomics is that in complex biological samples, low-abundance species are masked by the high-abundance ones, making it very difficult to learn about proteins with low expression, which nevertheless fulfill important biological roles. “It is still a question whether the dynamic range of protein level changes is being compressed by the technology,” observes Lewis. This translates to a certain degree of uncertainty over how accurate fold-change calculations are. “We are doing pretty well with measuring relative abundance,” says Lewis, “but absolute abundance is a big challenge.”
Interrogating cell surface glycosylation
“Compared with many other types of protein modifications, the study of glycosylation has been more challenging,” states Ronghu Wu, PhD, associate professor of chemistry and biochemistry at Georgia Tech. Research in Wu’s lab focuses on protein glycosylation, including the development of new methods to examine its distribution and function in cells.
As one of the most frequent modifications, protein glycosylation is ubiquitously distributed in cells across species and is essential for a wide variety of biological processes in development, homeostasis, and disease. “The surfaces of cells are covered by glycans,” says Wu. “This happens in all species, even in bacteria.”
Almost all proteins on the cell surfaces are glycosylated, and aberrant glycosylation is linked to human disease, including malignant transformation, inflammatory responses, the immune escape of viruses, and certain genetic conditions. “Protein glycosylation,” Wu emphasizes, “is also very important for biomarker identification and drug discovery.”
A new method developed by Wu and colleagues enriches glycopeptides by conjugating benzoboroxole, a derivative of boronic acid, to a dendrimer. The dendrimer provides a powerful platform to conjugate many benzoboroxole molecules to the same dendrimer bead and offers structural flexibility to establish stronger synergistic interactions with several sugar residues within a glycan.
This approach is particularly powerful for detecting low-abundance glycopeptides, which can be masked by highly abundant species during routine biochemical and molecular analyses. Working with yeast cells, mouse brain tissues, and several human cell lines, scientists in Wu’s lab used this technology to site-specifically identify N– and O-glycoproteins including many low-abundance ones.
In a study that metabolically labeled and enriched surface glycoproteins with a sugar analog containing a small functional group, Wu and colleagues characterized over 2000 N-glycosylation sites from over 1000 glycoproteins in eight human cell types. This analysis showed that glycosylation sites are dramatically impacted by the secondary structure of proteins and are predominantly distributed in disordered protein regions.
Interpreting the functional significance of glycosylation has been challenging. Part of the difficulty is attributable to the existence of multiple mechanisms for glycosylation. In addition, the types of sugar residues, the linkages, and the sizes of glycans all contribute to a wide variety of glycosylation modifications across species. “Glycans are highly diverse,” Wu points out, “and the heterogeneity of glycans also makes glycopeptide enrichment much more challenging.”
ITALIANO
Sempre più quantitativa e dinamica, la spettrometria di massa porta la proteomica oltre i conteggi e inizia a catturare interazioni sottili e processi contorti.
La spettrometria di massa può essere utilizzata per analizzare globalmente modificazioni proteiche come la glicosilazione, nel qual caso il successo della tecnica dipende dal fatto che i campioni biologici contengano quantità rilevabili di glicopeptidi, persino glicopeptidi a bassa abbondanza. Una tecnica di arricchimento sviluppata dai ricercatori del Georgia Institute of Technology sfrutta un'interazione ben nota: legame covalente reversibile tra glicani e acido boronico. Per moltiplicare efficacemente la forza di questa interazione, i ricercatori hanno ideato il "polipo benzoboroxolo". Le molecole di benzoboroxolo derivate dall'acido boronico sono coniugate a una perlina magnetica, proprio come i tentacoli di un polipo sono attaccati alla testa dell'animale. Le glicoproteine intrappolate dal polpo possono essere lavate via dal tallone con una soluzione a basso pH, ottenendo un campione arricchito.
Le proteine sono state chiamate i lavoratori della cellula e le cellule sono state paragonate alle fabbriche. Quindi, è stata solo una questione di tempo prima che le proteine, i percorsi proteici e interi proteomi venissero visti attraverso una prospettiva di gestione della forza lavoro o delle operazioni. Inizialmente, questo tipo di gestione è descrittivo. Ci vogliono inventari. Conduce studi sul tempo e sul movimento. Ma questi sono semplici preludi. Il vero obiettivo è superare il problema centrale del management: progettare e controllare i processi.
Il tema della gestione operativa sta diventando più pronunciato nella proteomica ora che la tecnologia della spettrometria di massa si sta muovendo oltre gli inventari statici e le schede delle presenze. Sta diventando più quantitativo e dinamico, tenendo conto delle diverse caratteristiche e attività delle proteine: stabilità, ripiegamento e interazioni proteina-proteina. Sta anche osservando le proteine mentre consente loro di rimanere in contesti adeguatamente ricchi. Ad esempio, le tecniche di spettrometria di massa stanno rivelando come le cellule si comportano, come alterano la loro biologia strutturale, nella cellula vivente. Impostazioni un po 'più ristrette (ma ancora espansive) includono chinomi, vie di risposta allo stress e proteine glicosilate.
Va sottolineato che il lavoro proteomico che viene abilitato dalla spettrometria di massa non è semplicemente descrittivo. È anche pratico. Alla fine, l'idea è di migliorare le operazioni che vengono eseguite dalle piccole fabbriche conosciute come cellule viventi. Se ci sono problemi del personale, possono, forse, essere risolti - a livello individuale o a livello di squadra - potenzialmente migliorando i risultati sanitari.
Identificare l'insorgenza della malattia
"Abbiamo esaminato i biomarcatori che segnano i primi punti di transizione dal benessere alle malattie croniche", afferma Leroy Hood, MD, PhD, vicepresidente senior e direttore scientifico presso Providence St. Joseph Health, e direttore strategico e professore presso l'Institute for Systems Biologia. "[Speriamo di usare questi biomarcatori] negli approcci dei sistemi per trovare metodi e terapie che scoraggiano la malattia prima che la malattia si manifesti."
Nel 2014 Hood e colleghi hanno avviato uno studio pilota in cui 108 soggetti sani sono stati seguiti longitudinalmente con analisi del genoma e del fenoma, compresa l'analisi di 300-400 proteine, 150 analiti chimici e 800-900 metaboliti dal sangue. I ricercatori hanno anche analizzato il microbioma intestinale dei partecipanti allo studio e raccolto informazioni sui parametri auto-misurati digitalmente, incluso il sonno e l'attività fisica.
Nello studio iniziale di nove mesi, le analisi del fenomeno sono state condotte ogni tre mesi. Successivamente, altre 5000 persone sono state reclutate in uno studio di quattro anni. Durante lo studio più ampio e più lungo, oltre 100 dei partecipanti hanno sviluppato varie malattie.
"Siamo stati in grado di esaminare ciascuno di questi pazienti in dettaglio", ricorda Hood. "Per valutare il passaggio dal benessere alla malattia, abbiamo analizzato campioni di sangue per circa 1200 analiti per vedere se potevamo trovare valori anomali".
Alla fine, sono stati trovati cinque sorprendenti valori anomali, tra cui tre proteine che sono membri della via del recettore Notch, una delle vie di segnalazione più frequentemente attivate nel cancro.
Hood e colleghi stanno usando questo approccio in un progetto di milioni di persone che proseguirà nei prossimi cinque anni. Mira a creare un contesto condiviso per reperti genomici e fenomici nonché per cartelle cliniche elettroniche.
"L'intera visione di come guardiamo la malattia sarà completamente trasformata", dichiara Hood. "Significherà avere metriche per misurare il grado e l'estensione del benessere, per rilevare la transizione che inizia la malattia e seguire le sempre più complesse amplificazioni della malattia."
Questo cambiamento di paradigma promette di interrompere la pratica clinica. "Questo è simile a quello che è successo con il progetto del genoma", suggerisce Hood. "Ci sono voluti cinque anni per convincere il mondo che dovremmo farlo, e una volta fatto, ha generato tecnologie e dati su molti organismi che hanno trasformato il modo in cui pensiamo alla biologia".
Dissezionare il kinome
I metodi proteomici usati per profilare gli inibitori della protein chinasi dovrebbero facilitare l'identificazione e la caratterizzazione di inibitori specifici. Sfortunatamente, i metodi convenzionali hanno contribuito a una "piaga" di inibitori non specifici, si lamenta Lee M. Graves, PhD, professore di farmacologia all'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (UNC). Per aiutare a dissipare la peste, Graves contribuisce allo sviluppo di raffinati metodi proteomici.
Ad esempio, Graves e i suoi colleghi UNC (tra cui il recente pensionato Gary L. Johnson, PhD) hanno sviluppato una piattaforma chiamata microsfere inibitorie multiplexate (MIB). Con questa piattaforma, diversi inibitori della chinasi possono essere immobilizzati su una colonna di sefarosio in un gradiente di specificità, permettendo alle chinasi di essere catturate in diversi strati sulla colonna e successivamente esaminate mediante spettrometria di massa quantitativa. Poiché questo approccio combina MIB e spettrometria di massa, si chiama MIB / MS. Può essere usato per rivelare come cambiano le dinamiche del cinoma in risposta agli inibitori o alle condizioni cellulari, o al sorgere della resistenza ai farmaci.
"Con il nostro metodo di acquisizione, possiamo vedere il 75–80% del cinoma espresso, ma non tutte le chinasi si legano alle perle", ammette Graves. "A volte, è necessario riprogettare il materiale chimico per ampliare la portata della cattura".
In collaborazione con Nathaniel J. Moorman, PhD, professore associato di microbiologia e immunologia presso l'UNC, Graves ha usato MIB / MS per quantificare le perturbazioni in> 240 chinasi in cellule infette da citomegalovirus umano e profilare i cambiamenti dipendenti dal tempo nel cinoma cellulare. Utilizzando i dati e i saggi di replicazione virale, Moorman e Graves hanno identificato tre inibitori della replicazione virale che erano efficaci a dosi che non mostravano tossicità cellulare. Uno di questi composti, un inibitore della serina treonina chinasi MELK, ha causato una riduzione di oltre 3 log nella replicazione virale, indicando il suo potenziale come nuovo farmaco antivirale.
"Questo approccio ha portato a una grande iniziativa per esaminare la risposta del cinoma alla sindrome respiratoria del Medio Oriente", osserva Graves. "Prevediamo anche di guardare altri patogeni, tra cui il virus dell'herpes simplex e il coronavirus, per profilare la risposta e vedere se alcuni dei cambiamenti che si verificano possono essere presi di mira come nuovi approcci antivirali." Graves sta attualmente lavorando con i principali virologi dell'UNC, supportati dalla Eshelman School of Pharmacy, per completare questo importante lavoro.
In un altro studio, Graves ha collaborato con Channing Der, PhD e altri della UNC in un progetto che ha utilizzato un test basato sulla citometria a flusso per selezionare una libreria di> 800 inibitori della protein-chinasi. I ricercatori hanno identificato composti che promuovevano la stabilità o il degrado di MYC in una linea cellulare di adenocarcinoma duttale pancreatico mutante KRAS. Ad esempio, è stato scoperto che CDK9 migliora la stabilità della proteina MYC attraverso un meccanismo KRAS precedentemente sconosciuto che ha coinvolto la fosforilazione di una serina specifica.
"Esiste un enorme interesse nell'uso di questa tecnologia per esplorare le chinasi poco apprezzate perché il nostro approccio è imparziale", afferma Graves.
Il concetto di riprogrammazione dei kinomi è di particolare interesse nel gruppo di Graves. Diversi studi hanno rivelato il rimodellamento della chinasi in modo dipendente dal tempo, in gran parte comportando cambiamenti trascrizionali o la loro downregulation o degradazione. "La natura dinamica del cinoma probabilmente impedisce ai singoli inibitori di essere efficaci come farebbero perché il cinoma si rimodella attorno a loro e sfugge al loro effetto inibitorio", spiega Graves.
Una delle limitazioni negli esperimenti di profilatura dei kinomi è che le proteine a bassa abbondanza potrebbero non generare un numero sufficiente di peptidi per fornire confidenza statistica. "Ma con alcune nuove tecniche di separazione e metodi di quantificazione, alcuni di questi problemi diventano sempre meno limitanti", sostiene Graves. "Man mano che gli spettrometri di massa diventano più sensibili, siamo in grado di vedere più cose di quelle che eravamo in grado di vedere prima."
Determinazione delle strutture proteiche nelle cellule viventi
"Il mio laboratorio sta perseguendo un sacco di sviluppo del metodo e la domanda principale che ci poniamo è se possiamo eseguire la biologia strutturale nei sistemi cellulari per fornire informazioni attraverso il proteoma", afferma Lisa M. Jones, PhD, professore associato di scienze farmacologiche presso la University of Maryland School of Pharmacy. Una delle tecniche utilizzate nel laboratorio di Jones è la rapida ossidazione fotochimica delle proteine (FPOP), un approccio basato sull'impronta delle proteine basato sulla spettrometria di massa. Si sta dimostrando prezioso negli studi di proteomica strutturale.
"Cerchiamo di aggirare la purificazione studiando le proteine direttamente nel loro ambiente cellulare nativo", sottolinea Jones.
FPOP si basa sull'etichettatura irreversibile delle catene laterali amminoacidiche esposte dai radicali idrossilici. In questa tecnica, una soluzione fluida di perossido di proteine e idrogeno viene irradiata da un laser, innescando la produzione di radicali idrossilici che successivamente modificano la proteina. Jones e colleghi hanno ampliato FPOP e creato FPOP in-cell (IC-FPOP), che ha permesso per la prima volta l'impronta delle proteine nelle cellule vive. Il potenziale della tecnica è stato dimostrato in studi di successo sulle interazioni proteina-proteina nella Caenorhabditis elegans e in diverse linee cellulari di mammiferi.
Un approccio più recente sviluppato nel laboratorio di Jones, Platform Incubator con stadio XY mobile (PIXY), ha sostituito il sistema a flusso singolo con un incubatore sterile che incorpora non solo uno stadio mobile, ma anche pompe peristaltiche, nonché specchi per guidare il laser.
"Sono necessari circa 20 secondi per eseguire un esperimento con questa nuova piattaforma, rispetto ai 10 minuti con il nostro sistema di flusso precedente", afferma Jones. In generale, la scala temporale per il ripiegamento della struttura terziaria delle proteine varia da millisecondi a secondi e posiziona potentemente PIXY per rilevare eventi in questo intervallo.
Una sfida con questi esperimenti è la grande quantità di dati che viene generata. "L'analisi dei dati è sicuramente un collo di bottiglia", consiglia Jones. "Un buon software che non solo ricerca i dati ma aiuta con la quantificazione sarebbe molto utile."
Misurazione di risposte cellulari a segnali ambientali
"Per molto tempo mi sono interessato a capire come le cellule percepiscono e rispondono al loro ambiente", afferma Jeffrey A. Lewis, PhD, assistente professore di scienze biologiche all'Università dell'Arkansas. La risposta cellulare ai fattori ambientali è stata tradizionalmente studiata a livello trascrizionale, catturando nel tempo i cambiamenti nelle molecole di RNA. Questo approccio ha prevalso, in parte, perché l'RNA era considerato un proxy ragionevole per le proteine. Inoltre, l'RNA è molto più facile da quantificare.
"Con la disponibilità di spettrometri di massa sensibili, ora siamo in grado di quantificare accuratamente le proteine", afferma Lewis. La quantificazione delle proteine, sebbene non buona quanto la quantificazione dell'RNA, è abbastanza buona, continua, per consentire agli investigatori di "iniziare a guardare i mediatori finali delle risposte ambientali".
Un grande sforzo nel gruppo di Lewis si sta concentrando sull'interrogare le modificazioni post-traduzionali delle proteine durante la classica risposta allo shock termico, un percorso che è stato ben studiato a livello trascrizionale in diversi organismi. "Abbiamo utilizzato la spettrometria di massa per avere una visione dettagliata di una misura acuta e dinamica della risposta allo stress nel tempo", osserva Lewis.
Usando la spettrometria di massa a triplo stadio tandem (TMT) (MS3), gli scienziati del laboratorio di Lewis hanno esaminato la risposta allo shock termico nel lievito in erba su nove punti temporali, da cinque minuti a quattro ore dopo lo shock cardiaco. Questo approccio ha quantificato> 2000 proteine e ha rivelato che la loro espressione differenziale ha raggiunto il picco circa 90 minuti dopo lo shock termico rispetto alle cellule di controllo non sollecitate. Le proteine indotte potevano essere organizzate in tre gruppi e le analisi dei fattori di trascrizione che regolavano i geni di ciascun gruppo indicavano che i geni indotti precocemente avevano più probabilità di essere quelli che rispondevano direttamente allo shock termico.
Una delle sfide della proteomica quantitativa è che nei complessi campioni biologici, le specie a bassa abbondanza sono mascherate da quelle ad alta abbondanza, rendendo molto difficile conoscere le proteine a bassa espressione, che tuttavia svolgono importanti ruoli biologici. "È ancora una questione se la gamma dinamica di cambiamenti del livello proteico sia compressa dalla tecnologia", osserva Lewis. Ciò si traduce in un certo grado di incertezza su quanto siano accurati i calcoli del cambio di modifica. "Stiamo andando abbastanza bene con la misurazione dell'abbondanza relativa", afferma Lewis, "ma l'abbondanza assoluta è una grande sfida".
Glicosilazione interrogante della superficie cellulare
"Rispetto a molti altri tipi di modificazioni proteiche, lo studio della glicosilazione è stato più impegnativo", afferma Ronghu Wu, PhD, professore associato di chimica e biochimica presso la Georgia Tech. La ricerca nel laboratorio di Wu si concentra sulla glicosilazione delle proteine, incluso lo sviluppo di nuovi metodi per esaminare la sua distribuzione e funzione nelle cellule.
Come una delle modifiche più frequenti, la glicosilazione proteica è distribuita onnipresentemente nelle cellule attraverso le specie ed è essenziale per un'ampia varietà di processi biologici in sviluppo, omeostasi e malattia. "Le superfici delle cellule sono coperte da glicani", afferma Wu. "Questo accade in tutte le specie, anche nei batteri."
Quasi tutte le proteine sulla superficie cellulare sono glicosilate e la glicosilazione aberrante è collegata alle malattie umane, tra cui la trasformazione maligna, le risposte infiammatorie, la fuga immunitaria dei virus e alcune condizioni genetiche. "La glicosilazione proteica", sottolinea Wu, "è anche molto importante per l'identificazione dei biomarcatori e la scoperta di farmaci".
Un nuovo metodo sviluppato da Wu e colleghi arricchisce i glicopeptidi coniugando benzoboroxolo, un derivato dell'acido boronico, in un dendrimero. Il dendrimero fornisce una potente piattaforma per coniugare molte molecole di benzoboroxolo allo stesso tallone di dendrimero e offre flessibilità strutturale per stabilire interazioni sinergiche più forti con diversi residui di zucchero all'interno di un glicano.
Questo approccio è particolarmente potente per rilevare glicopeptidi a bassa abbondanza, che possono essere mascherati da specie altamente abbondanti durante le normali analisi biochimiche e molecolari. Lavorando con cellule di lievito, tessuti cerebrali di topo e diverse linee cellulari umane, gli scienziati del laboratorio di Wu hanno utilizzato questa tecnologia per identificare in modo specifico il sito e le glicoproteine N e O, comprese molte di quelle a bassa abbondanza.
In uno studio che ha marcato e arricchito metabolicamente le glicoproteine di superficie con un analogo dello zucchero contenente un piccolo gruppo funzionale, Wu e colleghi hanno caratterizzato oltre 2000 siti di N-glicosilazione da oltre 1000 glicoproteine in otto tipi di cellule umane. Questa analisi ha mostrato che i siti di glicosilazione sono drammaticamente influenzati dalla struttura secondaria delle proteine e sono distribuiti prevalentemente in regioni proteiche disordinate.
L'interpretazione del significato funzionale della glicosilazione è stata impegnativa. Parte della difficoltà è attribuibile all'esistenza di meccanismi multipli per la glicosilazione. Inoltre, i tipi di residui di zucchero, i legami e le dimensioni dei glicani contribuiscono a un'ampia varietà di modifiche alla glicosilazione tra le specie. "I glicani sono molto diversi", sottolinea Wu, "e l'eterogeneità dei glicani rende l'arricchimento dei glicopeptidi molto più impegnativo".
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