Vedere singoli atomi con una tecnica microscopica / See individual atoms with a microscopic technique
Vedere singoli atomi con una tecnica microscopica / See individual atoms with a microscopic technique
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Una mappa della proteina apoferritina ottenuta con la crio-microscopia elettronica / A map of the apoferritin protein obtained by electron cryo-microscopy (Paul Emsley/MRC Laboratory of Molecular Biology)
La crio-microscopia elettronica ha raggiunto una risoluzione che permette di ottenere per la prima volta immagini di singoli atomi di strutture proteiche e quindi di produrre mappe molto dettagliate delle proteine. Questo risultato potrebbò4e essere prezioso per un'accurata progettazione dei farmaci.
Una tecnica rivoluzionaria per osservare le molecole, nota come crio-microscopia elettronica, ha prodotto le sue immagini più nitide di sempre e, per la prima volta, ha individuato singoli atomi in una proteina.
Raggiungendo la risoluzione atomica tramite la crio-microscopia elettronica (crio-EM, o cryo-EM con la sigla in inglese), i ricercatori saranno in grado di comprendere, con un dettaglio senza precedenti, il funzionamento delle proteine che non possono essere facilmente esaminate da altre tecniche di imaging, come la cristallografia a raggi X.
La scoperta, riportata da due laboratori alla fine del mese scorso, rafforza la posizione della crio-EM come strumento fondamentale per la mappatura delle strutture tridimensionali delle proteine, dicono gli scienziati. In definitiva, queste strutture aiuteranno i ricercatori a capire come funzionano le proteine in salute e in malattia, e porteranno a farmaci migliori con meno effetti collaterali.
“È una pietra miliare, questo è sicuro. Non si può più andare oltre: questa è l'ultima soglia della risoluzione", dice Holger Stark, biochimico e microscopista elettronico del Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie di Göttingen, in Germania, che ha effettuato uno degli studi. L'altro è stato effettuato da Sjors Scheres e Radu Aricescu, biologi strutturalisti del Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB) di Cambridge, nel Regno Unito. Entrambi gli studi sono stati pubblicati sul server di prestampa bioRxiv il 22 maggio.
"La vera 'risoluzione atomica' è una vera pietra miliare", aggiunge John Rubinstein, biologo strutturalista dell'Università di Toronto, in Canada. Ottenere strutture a risoluzione atomica di molte proteine sarà ancora un compito arduo a causa di altre difficoltà, come la flessibilità di una proteina. "Questi articoli di preprint mostrano dove si può arrivare se si possono superare queste altre limitazioni", aggiunge.
Oltrepassare i confini
Raggiungendo la risoluzione atomica tramite la crio-microscopia elettronica (crio-EM, o cryo-EM con la sigla in inglese), i ricercatori saranno in grado di comprendere, con un dettaglio senza precedenti, il funzionamento delle proteine che non possono essere facilmente esaminate da altre tecniche di imaging, come la cristallografia a raggi X.
La scoperta, riportata da due laboratori alla fine del mese scorso, rafforza la posizione della crio-EM come strumento fondamentale per la mappatura delle strutture tridimensionali delle proteine, dicono gli scienziati. In definitiva, queste strutture aiuteranno i ricercatori a capire come funzionano le proteine in salute e in malattia, e porteranno a farmaci migliori con meno effetti collaterali.
“È una pietra miliare, questo è sicuro. Non si può più andare oltre: questa è l'ultima soglia della risoluzione", dice Holger Stark, biochimico e microscopista elettronico del Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie di Göttingen, in Germania, che ha effettuato uno degli studi. L'altro è stato effettuato da Sjors Scheres e Radu Aricescu, biologi strutturalisti del Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB) di Cambridge, nel Regno Unito. Entrambi gli studi sono stati pubblicati sul server di prestampa bioRxiv il 22 maggio.
"La vera 'risoluzione atomica' è una vera pietra miliare", aggiunge John Rubinstein, biologo strutturalista dell'Università di Toronto, in Canada. Ottenere strutture a risoluzione atomica di molte proteine sarà ancora un compito arduo a causa di altre difficoltà, come la flessibilità di una proteina. "Questi articoli di preprint mostrano dove si può arrivare se si possono superare queste altre limitazioni", aggiunge.
Oltrepassare i confini
La crio-EM è una tecnica vecchia di decenni che determina la forma dei campioni congelati rapidamente sparando su di essi elettroni e registrando le immagini risultanti. I progressi nella tecnologia per il rilevamento degli elettroni che rimbalzano e nel programma di analisi delle immagini hanno catalizzato una "rivoluzione della risoluzione" iniziata intorno al 2013. Questo ha portato a strutture proteiche più nitide che mai, e buone quasi come quelle ottenute dalla cristallografia a raggi X, una tecnica più datata che deduce le strutture dalle figure di diffrazione prodotte dai cristalli di proteine quando sono bombardati da raggi X.
I successivi progressi hardware e software hanno portato a ulteriori miglioramenti nella risoluzione delle strutture ottenute con la crio-EM. Ma gli scienziati hanno dovuto affidarsi in gran parte alla cristallografia a raggi X per ottenere strutture a risoluzione atomica. Tuttavia, i ricercatori possono passare mesi o addirittura anni per far cristallizzare una proteina, e molte proteine importanti dal punto di vista medico non formeranno mai cristalli utilizzabili; la crio-EM, al contrario, richiede solo che la proteina sia in una soluzione purificata.
Le mappe di risoluzione atomica sono sufficientemente precise da permettere di discernere in modo inequivocabile la posizione dei singoli atomi in una proteina, con una risoluzione di circa 1,2 ångström (un ångström equivale a un decimiliardesimo di metro). Queste strutture sono particolarmente utili per capire come funzionano gli enzimi e per usare queste conoscenze per identificare i farmaci che possono bloccare la loro attività.
Per spingere la crio-EM fino alla risoluzione atomica, i due gruppi hanno lavorato su una proteina che immagazzina il ferro chiamata apoferritina. A causa della sua stabilità simile alla roccia, la proteina è diventata un banco di prova per la crio-EM: il precedente record era una struttura della proteina con una risoluzione di 1,54 ångström.
I gruppi hanno poi usato miglioramenti tecnologici per scattare foto più nitide dell'apoferritina. Quello di Stark ha ottenuto una struttura a 1,25 ångström della proteina, con l'aiuto di uno strumento che assicura che gli elettroni viaggino tutti con la stessa velocità prima di colpire un campione, migliorando la risoluzione delle immagini risultanti. Scheres, Aricescu e il loro gruppo hanno usato una tecnologia diversa per sparare gli elettroni che viaggiano a velocità simili tra loro, e hanno anche beneficiato di una tecnologia che riduce il rumore generato da alcuni elettroni che emergono dal campione di proteina, e di una fotocamera più sensibile che rileva gli elettroni. La loro struttura con una risoluzione di 1,2 ångström era così completa, dice Scheres, che si potevano individuare singoli atomi di idrogeno, sia nelle proteine sia nelle molecole d'acqua circostanti.
Stark ritiene che l’integrazione delle tecnologie potrebbe spingere le risoluzioni a circa 1 ångström, ma non molto di più. "Sotto 1 ångström è quasi impossibile arrivare per la crio-EM", dice. Ottenere una struttura di questo tipo con la tecnologia all'avanguardia esistente richiederebbe "diverse centinaia di anni di registrazione dei dati, e una quantità non realistica di potenza di calcolo e capacità di archiviazione dei dati", secondo le stime del suo gruppo.
Vedere chiaramente
Scheres e Aricescu hanno anche testato i loro miglioramenti su una forma semplificata di una proteina chiamata recettore GABA A. La proteina si trova nella membrana dei neuroni ed è un bersaglio per anestetici generali, farmaci ansiolitici e molti altri farmaci. L'anno scorso, il gruppo di Aricescu ha usato la crio-EM per mappare la proteina a 2,5 ångström. Ma con il nuovo kit, i ricercatori hanno raggiunto una risoluzione di 1,7 ångström, e una risoluzione ancora migliore in alcune parti chiave della proteina. "È stato come togliere un velo dagli occhi", dice Aricescu. "A questa risoluzione, ogni mezzo ångström apre un intero universo".
La struttura ha rivelato dettagli mai visti prima nella proteina, comprese le molecole d'acqua nella tasca dove si trova una sostanza chimica chiamata istamina. "Questa è una miniera d'oro per la progettazione di farmaci basati sulla struttura", dice Aricescu, perché mostra come un farmaco possa spostare le molecole d'acqua, con il risultato potenziale di farmaci con meno effetti collaterali.
Una mappa a risoluzione atomica di GABA A, che non è stabile come l'apoferritina, sarebbe una sfida, dice Scheres. "Non credo che sia impossibile, ma sarebbe molto poco pratico", a causa della grande quantità di dati da raccogliere. Ma altri miglioramenti, in particolare nel modo in cui sono preparati i campioni di proteine, potrebbero aprire la strada alle strutture di risoluzione atomica di GABA A e di altre proteine importanti dal punto di vista biomedico. Le soluzioni proteiche sono congelate su minuscole griglie di oro, e le alterazioni di queste griglie potrebbero trattenere anche le proteine più stabili.
"Sono tutti molto entusiasti e stupiti dal livello di prestazioni davvero sbalorditivo dimostrato dai gruppi dell’MRC-LMB e del Max-Planck", dice Radostin Danev, specialista di crio-EM all'Università di Tokyo. Ma è d'accordo sul fatto che la preparazione del campione è la sfida principale per le proteine più instabili. "Le prestazioni in termini di risoluzione sotto 1,5 ångström, o anche sotto 2 ångström, rimarranno accessibili per un certo periodo di tempo solo per campioni che si comportano bene", dice.
Secondo Scheres, è probabile che le innovazioni consolidino la posizione della crio-EM come strumento per la maggior parte degli studi strutturali. Le aziende farmaceutiche, che ricercano assiduamente strutture a risoluzione atomica, potrebbero essere ancora più propense a ricorrere alla crio-EM. Ma Stark pensa che la cristallografia a raggi X manterrà un certo fascino. Se una proteina può essere cristallizzata – e questo è un grande se – è relativamente efficiente per generarne strutture legate a migliaia di potenziali farmaci in un breve lasso di tempo. Ma potrebbero comunque essere necessarie ore o giorni per generare dati sufficienti per strutture crio-EM ad altissima risoluzione.
"Ci sono ancora pro e contro per ciascuna delle tecniche", dice Stark. "Sono stati pubblicati molti articoli e revisioni che dicono che questi ultimi progressi nella crio-EM decreteranno la fine dei raggi X. Ne dubito."
ENGLISH
Electron cryo-microscopy has reached a resolution that allows for the first time to obtain images of single atoms of protein structures and therefore to produce very detailed maps of proteins. This result could be valuable for accurate drug design.
A revolutionary technique for observing molecules, known as electron cryo-microscopy, has produced its sharpest images ever and, for the first time, has identified individual atoms in a protein.
By reaching atomic resolution through electron cryo-microscopy (cryo-EM, or cryo-EM with the acronym in English), researchers will be able to understand, in unprecedented detail, the functioning of proteins that cannot be easily examined from other imaging techniques, such as X-ray crystallography.
The finding, reported by two labs late last month, reinforces the position of cryo-EM as a key tool for mapping three-dimensional structures of proteins, scientists say. Ultimately, these structures will help researchers understand how proteins work in health and disease, and will lead to better drugs with fewer side effects.
“It's a milestone, that's for sure. We can't go any further: this is the last step of the resolution, "says Holger Stark, biochemist and electron microscopist at the Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen, Germany, who carried out one of the studies. The other It was conducted by Sjors Scheres and Radu Aricescu, structural biologists from the Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB) in Cambridge, UK, both of which were published on the bioRxiv prepress server on May 22.
"True 'atomic resolution' is a real milestone," adds John Rubinstein, a structural biologist at the University of Toronto, Canada. Obtaining atomic resolution structures of many proteins will still be a daunting task due to other difficulties, such as the flexibility of a protein. "These preprint articles show where you can go if you can overcome these other limitations," he adds.
Crossing borders
Cryo-EM is a decades-old technique that determines the shape of frozen samples by quickly shooting electrons at them and recording the resulting images. Advances in bouncing electron detection technology and the image analysis program catalyzed a "resolution revolution" that began around 2013. This has led to sharper protein structures than ever before, and almost as good as those obtained by crystallography. X-ray, a more dated technique that deduces structures from diffraction figures produced by protein crystals when bombarded by X-rays.
Subsequent hardware and software advances have led to further improvements in the resolution of structures obtained with cryo-EM. But scientists had to rely heavily on X-ray crystallography to obtain atomic resolution structures. However, researchers can spend months or even years to crystallize a protein, and many medically important proteins will never form usable crystals; cryo-EM, on the other hand, only requires that the protein be in a purified solution.
Atomic resolution maps are precise enough to allow the position of individual atoms in a protein to be discerned unequivocally, with a resolution of approximately 1.2 ångström (one ångström equals one ten billionth of a meter). These structures are particularly useful for understanding how enzymes work and for using this knowledge to identify drugs that can block their activity.
To push cryo-EM down to atomic resolution, the two groups worked on an iron-storing protein called apoferritin. Due to its rock-like stability, the protein has become a test for cryo-EM: the previous record was a protein structure with a resolution of 1.54 ångström.
The groups then used technological improvements to take sharper photos of apoferritin. Stark's got a 1.25 ångström structure of the protein, with the help of a tool that ensures that the electrons all travel with the same speed before hitting a sample, improving the resolution of the resulting images. Scheres, Aricescu and their team used different technology to shoot electrons traveling at similar speeds, and also benefited from a technology that reduces the noise generated by some electrons emerging from the protein sample, and from a camera more sensitive than detecting electrons. Their structure with a resolution of 1.2 ångström was so complete, says Scheres, that individual hydrogen atoms could be identified, both in the proteins and in the surrounding water molecules.
Stark believes that integrating technologies could push resolutions to around 1 ångström, but not much more. "Under 1 ångström it's almost impossible to get for cryo-EM," he says. Obtaining such a facility with existing cutting edge technology would require "several hundred years of data logging, and an unrealistic amount of computing power and data storage capacity," according to his group's estimates.
See clearly
Scheres and Aricescu also tested their improvements on a simplified form of a protein called the GABA A receptor. The protein is found in the membrane of neurons and is a target for general anesthetics, anxiolytic drugs and many other drugs. Last year, the Aricescu team used cryo-EM to map the protein to 2.5 ångström. But with the new kit, the researchers achieved 1.7 ångström resolution, and even better resolution in some key parts of the protein. "It was like removing a veil from the eyes," says Aricescu. "At this resolution, every ångström medium opens up a whole universe."
The structure revealed details never before seen in the protein, including the water molecules in the pocket where a chemical called histamine is found. "This is a gold mine for designing structure-based drugs," says Aricescu, because it shows how a drug can move water molecules, with the potential result of drugs with fewer side effects.
An atomic resolution map of GABA A, which is not as stable as apoferritin, would be a challenge, says Scheres. "I don't think it's impossible, but it would be very impractical", due to the large amount of data to be collected. But other improvements, particularly in the way protein samples are prepared, could pave the way for the atomic resolution structures of GABA A and other biomedically important proteins. Protein solutions are frozen on tiny gold grids, and the alterations of these grids could retain even the most stable proteins.
"They are all very excited and amazed by the truly astounding level of performance demonstrated by the MRC-LMB and Max-Planck teams," says Radostin Danev, cryo-EM specialist at the University of Tokyo. But he agrees that sample preparation is the main challenge for the most unstable proteins. "Performance in terms of resolution below 1.5 ångström, or even below 2 ångström, will remain accessible for a certain period of time only for samples that perform well," he says.
According to Scheres, innovations are likely to consolidate the position of cryo-EM as a tool for most structural studies. Pharmaceutical companies, which assiduously research atomic resolution facilities, may be even more likely to resort to cryo-EM. But Stark thinks that X-ray crystallography will retain some appeal. If a protein can be crystallized - and that's a great if - it is relatively efficient for generating structures related to thousands of potential drugs in a short space of time. But it may still take hours or days to generate enough data for very high resolution cryo-EM structures.
"There are still pros and cons for each of the techniques," says Stark. "Many articles and reviews have been published that say these latest advances in cryo-EM will decree the end of X-rays. I doubt it."
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