Camelid Nanobodies Poised to Revolutionize Antibody Therapeutics / Nanocorpi dei camelidi pronti a rivoluzionare la terapia con anticorpi
Camelid Nanobodies Poised to Revolutionize Antibody Therapeutics / Nanocorpi dei camelidi pronti a rivoluzionare la terapia con anticorpi
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellesssa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellesssa
Single-domain antibodies, or nanobodies, have recently been thrust into the spotlight as a potential treatment for COVID-19. In fact, a COVID-19 nanobody-based treatment developed by the Beroni Group, an Australian biotechnology company, is currently in preclinical testing. Even though nanobodies are only beginning to realize their therapeutic potential, they have been studied for decades.
In 1989, two graduate students at Vrije Universiteit Brussel serendipitously discovered a unique property of camelids (camels, llamas, and alpacas among others). While testing frozen camel blood serum, the students found that camelids not only produce conventional antibodies, but also a unique secondary set of single-chain antibodies (scAbs) composed of two identical heavy-chain polypeptides, each of which incorporates two contiguous constant domains, a hinge region, and a variable domain. (The constant domains of each heavy chain run parallel; beyond the hinge region, the variable domains diverge like the arms of the letter “Y.”) Each of the variable domains of the scAb serves as an antigen-binding module.
This exciting discovery was just the start. Subsequent work revealed that only a tiny fragment of the scAb, a single variable domain, is required to recognize an antigen. This fragment weighs in at only 12–15 kDa, hence the name “nanobody.”
In contrast, human antibodies are composed of two identical heavy-chain and two identical light-chain polypeptides. These proteins are large, with a molecular weight of approximately 150 kDa. Unlike camelid scAbs, the antigen-binding site of human antibodies spans both the heavy and light chains (or rather the variable domains of these chains), meaning all the chains are needed to detect an antigen.
Nanobody advantages
As human antibodies are large, they often have difficulty accessing small binding spaces on viruses, certain cells, and targets deep within tumor tissue. However, the small nanobodies can navigate tight spaces and may be an attractive alternative to human antibodies for therapeutic developers. Additionally, the binding domain of nanobodies is long, producing a “finger like” structure that enhances the ability of nanobodies to reach their targets.
One huge advantage of nanobodies, compared with conventional human antibodies, is their easy manufacturability. The relatively simple process starts with immunization of a camelid with the desired antigen. The camelid’s immune system produces a scAb that recognizes the antigen. A blood sample is subsequently taken from the camelid (left otherwise unharmed), and the mRNA for the scAb is extracted from the sample.
The genes for the variable antigen-binding domain, that is, the nanobody, are then amplified from the mRNA. Large quantities of the final nanobody can then be produced inside microorganisms, typically Escherichia coli, at a low cost.
Newer methods are taking animals completely out of the equation by testing antigens against a preproduced library of nanobodies. Twist Bioscience, though its Twist BioPharma division, offers several types of nanobody libraries within a llama scAb framework or partially humanized scAb framework. Billions of nanobody sequences can be tested at once, making antibody discovery and development extremely fast and relatively inexpensive.
Nanobody applications
Originally, nanobodies were used only or primarily for research purposes. However, exploration into nanobodies’ use as a therapeutic has dramatically increased over the last decade. In February 2019, a significant advance was made when the first nanobody therapeutic was approved by the FDA.
The drug, called Cablivi, was developed by Ablynx for the treatment of acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Cablivi acts as an anti-von Williebrand factor and prevents platelets from aggregating around organs.
Nanobodies for varied conditions are in clinical trials. For example, nanobodies are being evaluated as treatments for psoriasis, rheumatoid arthritis, and viral infections.
In addition to constituting solo therapies, nanobodies may contribute to combination therapies. Of interest are the clinical trials exploring the combination of nanobodies and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies for cancer.
CAR T cells are genetically engineered to recognize and target antigens on the surface of tumors. Thus far, CAR T-cell therapies have been very promising treatments for blood cancers that are unresponsive to more conventional treatments. However, CAR T-cell therapies have not yet been successful against solid tumors.
To take on solid tumors, CAR T cells may need to home in on alternative targets. The usual targets include cancer-specific antigens, which are proving hard to find, and cancer-associated antigens, which are easier to find but are harder to engage safely, since they also appear on healthy cells.
These targets pose yet another yet another difficulty. They are usually targeted by CAR T cells that incorporate an antigen-recognition domain derived from a human monoclonal antibody. However, human antibodies can cause immunogenicity leading to side effects and a reduction in CAR T-cell efficacy.
What alternative targets might be suitable? Possibilities abound in the extracellular matrix, a web of proteins that shields solid tumors and harbors immunosuppressive molecules. The idea of hitting targets in the extracellular matrix appealed to scientists at Boston Children’s Hospital. Ultimately, these scientists decided to engineer CAR T cells with antigen-recognition domains derived from nanobodies.
Using mouse models of cancer, the scientists demonstrated that nanobody-based CAR T cells are only weakly immunogenic and capable of recognizing specific antigens in the tumor microenvironment. To construct these CAR T cells, the scientists used the Gibson Assembly method, a technique that allows multiple DNA fragments to be combined and cloned.
CAR T cell–nanobody constructs are capable of damaging tumor-nourishing blood vessels and tumor-protecting elements of the extracellular matrix. The damage to the tumor microenvironment significantly slows growth and allows other treatments, such as chemotherapy, access to the inside of the tumor.
Nanobody development issues
It took 30 years after nanobodies were discovered in 1989 for a nanobody therapeutic to reach the market. The first 10 years were focused on research into the structure, composition, and properties of nanobodies. Just after the 10-year mark, in 2001, Vrije Universiteit Brussel attempted to commercialize nanobodies with multiple patents issued in its name. These patents were subsequently passed onto the Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) and then onto a VIB-founded company, Ablynx, in 2002.
It is likely that intellectual property limitations on the composition of matter of nanobodies contributed to the long delay between the discovery of nanobodies and the first approval of a nanobody-based drug. However, the main patent claims on this biomolecule expired in 2014 in Europe and 2017 in America, allowing Ablynx to significantly expand its collaboration with some of the largest pharmaceutical companies in the world, including Merck & Co., Boehringer Ingelheim, and Sanofi.
These collaborations have resulted in a flurry of clinical trials being registered involving nanobodies and the long-awaited approval of Cablivi. Additionally, diminishing intellectual property barriers associated with nanobodies’ composition of matter has allowed even more companies to show an interest in the further commercialization of these super-molecules.
As with all therapies, nanobodies do have drawbacks. Their small size results in rapid clearance through the kidneys, reducing their half-lives. Therefore, to ensure a high enough volume of nanobodies are present in the blood to achieve the desired effect, frequent dosing is required, which may induce kidney toxicity. There is also a small risk that patients could have an immune response to therapeutic nanobodies as they are a biologic material.
Fortunately, these problems can be overcome. Research has shown that fusing nanobodies to serum albumin, an abundant transport protein found in blood, significantly increases the half-lives of nanobodies, allowing them to remain in the blood for longer and in larger quantities. The immunogenicity of nanobodies can be reduced via humanization, a process that modifies some of the nanobody protein sequences to increase their similarity to human antibodies, reducing the risk of a negative immune reaction.
While there have been delays to the commercialization of nanobodies as therapeutics, now that multiple companies are able to invest in these wonderful and unique molecules, it is anticipated that there will soon be an explosion of nanobodies being used as therapeutics for a multitude of diseases, from viral infections to cancer. Camelid nanobodies have not only proven their worth but could also change the landscape of antibody therapy and hail in a new generation of therapeutics.
ITALIANO
Gli anticorpi a dominio singolo, o nanobodies, sono stati recentemente messi sotto i riflettori come potenziale trattamento per COVID-19. Infatti, un trattamento a base di nanobody COVID-19 sviluppato dal Gruppo Beroni, una società biotecnologica australiana, è attualmente in fase di test preclinico. Anche se i nanobodies stanno appena iniziando a realizzare il loro potenziale terapeutico, sono stati studiati per decenni.
Nel 1989, due studenti laureati della Vrije Universiteit Brussel scoprirono casualmente una proprietà unica dei camelidi (cammelli, lama e alpaca tra gli altri). Durante il test del siero di sangue di cammello congelato, gli studenti hanno scoperto che i camelidi non solo producono anticorpi convenzionali, ma anche un set secondario unico di anticorpi a catena singola (scAbs) composto da due polipeptidi a catena pesante identici, ciascuno dei quali incorpora due domini costanti contigui, una regione cerniera e un dominio variabile. (I domini costanti di ciascuna catena pesante corrono paralleli; oltre la regione cerniera, i domini variabili divergono come i bracci della lettera "Y"). Ciascuno dei domini variabili di scAb funge da modulo di legame dell'antigene.
Questa entusiasmante scoperta è stata solo l'inizio. Il lavoro successivo ha rivelato che è necessario solo un minuscolo frammento di scAb, un singolo dominio variabile, per riconoscere un antigene. Questo frammento pesa solo 12-15 kDa, da cui il nome "nanobody".
Al contrario, gli anticorpi umani sono composti da due identici polipeptidi a catena pesante e due identici polipeptidi a catena leggera. Queste proteine sono grandi, con un peso molecolare di circa 150 kDa. A differenza degli scAbs camelidi, il sito di legame dell'antigene degli anticorpi umani si estende sia sulle catene pesanti che su quelle leggere (o meglio i domini variabili di queste catene), il che significa che tutte le catene sono necessarie per rilevare un antigene.
Vantaggi del nanobody
Poiché gli anticorpi umani sono grandi, spesso hanno difficoltà ad accedere a piccoli spazi di legame su virus, determinate cellule e bersagli profondi all'interno del tessuto tumorale. Tuttavia, i piccoli nanobodies possono navigare in spazi ristretti e possono essere un'alternativa interessante agli anticorpi umani per gli sviluppatori terapeutici. Inoltre, il dominio di legame dei nanobodies è lungo, producendo una struttura "simile a un dito" che migliora la capacità dei nanobodies di raggiungere i loro obiettivi.
Un enorme vantaggio dei nanobodies, rispetto agli anticorpi umani convenzionali, è la loro facile producibilità. Il processo relativamente semplice inizia con l'immunizzazione di un camelide con l'antigene desiderato. Il sistema immunitario del camelide produce uno scAb che riconosce l'antigene. Successivamente viene prelevato un campione di sangue dal camelide (lasciato altrimenti illeso) e l'mRNA per lo scAb viene estratto dal campione.
I geni per il dominio di legame dell'antigene variabile, cioè il nanobody, vengono quindi amplificati dall'mRNA. Grandi quantità del nanobody finale possono quindi essere prodotte all'interno di microrganismi, tipicamente Escherichia coli, a basso costo.
Metodi più recenti stanno eliminando completamente gli animali dall'equazione testando gli antigeni contro una libreria preprodotta di nanobodies. Twist Bioscience, sebbene la sua divisione Twist BioPharma, offre diversi tipi di librerie di nanobody all'interno di un framework scAb lama o framework scAb parzialmente umanizzato. Miliardi di sequenze di nanobody possono essere testate contemporaneamente, rendendo la scoperta e lo sviluppo di anticorpi estremamente rapidi e relativamente economici.
Applicazioni nanobody
In origine, i nanobodies erano usati solo o principalmente per scopi di ricerca. Tuttavia, l'esplorazione dell'uso dei nanobodies come terapeutico è aumentata notevolmente negli ultimi dieci anni. Nel febbraio 2019, è stato fatto un progresso significativo quando il primo nanobody terapeutico è stato approvato dalla FDA.
Il farmaco, chiamato Cablivi, è stato sviluppato da Ablynx per il trattamento della porpora trombotica trombocitopenica acquisita. Cablivi agisce come un fattore anti-von Williebrand e impedisce l'aggregazione delle piastrine intorno agli organi.
Nanobodies per varie condizioni sono in studi clinici. Ad esempio, i nanobodies vengono valutati come trattamenti per la psoriasi, l'artrite reumatoide e le infezioni virali.
Oltre a costituire terapie solitarie, i nanobodies possono contribuire alle terapie combinate. Di interesse sono gli studi clinici che esplorano la combinazione di nanobodies e terapie con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) per il cancro.
Le cellule T CAR sono ingegnerizzate geneticamente per riconoscere e indirizzare gli antigeni sulla superficie dei tumori. Finora, le terapie con cellule T CAR sono state trattamenti molto promettenti per i tumori del sangue che non rispondono a trattamenti più convenzionali. Tuttavia, le terapie con cellule T CAR non hanno ancora avuto successo contro i tumori solidi.
Per affrontare i tumori solidi, le cellule CAR T potrebbero dover puntare su bersagli alternativi. Gli obiettivi usuali includono antigeni specifici per il cancro, che si stanno dimostrando difficili da trovare, e antigeni associati al cancro, che sono più facili da trovare ma sono più difficili da coinvolgere in sicurezza, poiché compaiono anche su cellule sane.
Questi obiettivi pongono ancora un'altra difficoltà. Di solito sono presi di mira dalle cellule T CAR che incorporano un dominio di riconoscimento dell'antigene derivato da un anticorpo monoclonale umano. Tuttavia, gli anticorpi umani possono causare immunogenicità che porta a effetti collaterali e una riduzione dell'efficacia delle cellule T CAR.
Quali obiettivi alternativi potrebbero essere adatti? Le possibilità abbondano nella matrice extracellulare, una rete di proteine che protegge i tumori solidi e ospita molecole immunosoppressive. L'idea di colpire obiettivi nella matrice extracellulare ha attirato gli scienziati del Boston Children’s Hospital. Alla fine, questi scienziati hanno deciso di progettare cellule T CAR con domini di riconoscimento dell'antigene derivati da nanobodies.
Utilizzando modelli murini di cancro, gli scienziati hanno dimostrato che i linfociti CAR T basati su nanobody sono solo debolmente immunogenici e in grado di riconoscere antigeni specifici nel microambiente tumorale. Per costruire queste cellule T CAR, gli scienziati hanno utilizzato il metodo Gibson Assembly, una tecnica che consente di combinare e clonare più frammenti di DNA.
I costrutti di cellule T CAR - nanobody sono in grado di danneggiare i vasi sanguigni che nutrono il tumore e gli elementi di protezione dal tumore della matrice extracellulare. Il danno al microambiente tumorale rallenta notevolmente la crescita e consente ad altri trattamenti, come la chemioterapia, l'accesso all'interno del tumore.
Problemi di sviluppo del nanobody
Ci sono voluti 30 anni dopo la scoperta dei nanobody nel 1989 prima che un nanobody terapeutico raggiungesse il mercato. I primi 10 anni si sono concentrati sulla ricerca sulla struttura, la composizione e le proprietà dei nanobodies. Subito dopo il traguardo dei 10 anni, nel 2001, la Vrije Universiteit Brussel ha tentato di commercializzare i nanocorpi con più brevetti rilasciati a suo nome. Questi brevetti sono stati successivamente trasferiti al Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) e poi a una società fondata da VIB, Ablynx, nel 2002.
È probabile che le limitazioni della proprietà intellettuale sulla composizione della materia dei nanobodies abbiano contribuito al lungo ritardo tra la scoperta dei nanobodies e la prima approvazione di un farmaco a base di nanobody. Tuttavia, le principali rivendicazioni di brevetto su questa biomolecola sono scadute nel 2014 in Europa e nel 2017 in America, consentendo ad Ablynx di espandere significativamente la propria collaborazione con alcune delle più grandi aziende farmaceutiche del mondo, tra cui Merck & Co., Boehringer Ingelheim e Sanofi.
Queste collaborazioni hanno portato a una raffica di sperimentazioni cliniche registrate che coinvolgono nanoorganismi e alla tanto attesa approvazione di Cablivi. Inoltre, la diminuzione delle barriere sulla proprietà intellettuale associate alla composizione della materia dei nanocorpi ha consentito a un numero ancora maggiore di aziende di mostrare interesse per l'ulteriore commercializzazione di queste super-molecole.
Come con tutte le terapie, i nanobodies hanno degli svantaggi. Le loro piccole dimensioni si traducono in una rapida eliminazione attraverso i reni, riducendo la loro emivita. Pertanto, per garantire che nel sangue sia presente un volume sufficientemente elevato di nanobodies per ottenere l'effetto desiderato, è necessario un dosaggio frequente, che può indurre tossicità renale. C'è anche un piccolo rischio che i pazienti possano avere una risposta immunitaria ai nanobodies terapeutici in quanto sono un materiale biologico.
Fortunatamente, questi problemi possono essere superati. La ricerca ha dimostrato che la fusione dei nanobodies con l'albumina sierica, un'abbondante proteina di trasporto presente nel sangue, aumenta significativamente l'emivita dei nanobodies, consentendo loro di rimanere nel sangue più a lungo e in quantità maggiori. L'immunogenicità dei nanobodies può essere ridotta tramite l'umanizzazione, un processo che modifica alcune sequenze proteiche dei nanobody per aumentare la loro somiglianza con gli anticorpi umani, riducendo il rischio di una reazione immunitaria negativa.
Sebbene ci siano stati ritardi nella commercializzazione dei nanobodies come terapie, ora che più aziende sono in grado di investire in queste molecole meravigliose e uniche, si prevede che presto ci sarà un'esplosione di nanobodies utilizzati come terapie per una moltitudine di malattie, dalle infezioni virali al cancro. I nanobodies camelidi non solo hanno dimostrato il loro valore, ma potrebbero anche cambiare il panorama della terapia con anticorpi e dare il benvenuto a una nuova generazione di terapie.
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