Rapid and Efficient Live Zebrafish Embryo Genotyping / Genotipizzazione rapida ed efficiente di embrioni di pesci zebra vivi
Rapid and Efficient Live Zebrafish Embryo Genotyping / Genotipizzazione rapida ed efficiente di embrioni di pesci zebra vivi
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Fig. 1 Rapid and efficient live zebrafish embryo genotyping. (A) The step procedure for the method. (B) Representative image of genotyped zebrafish larva at 7 dpf. Lateral view, head to left. (C) Representative PCR results. dpf, days postfertilization; NC, negative control; PC, positive control; PCR, polymerase chain reaction. / Genotipizzazione rapida ed efficiente di embrioni di zebrafish dal vivo . (A) La procedura passo per il metodo. (B) Immagine rappresentativa della larva di zebrafish genotipizzata a 7 dpf. Vista laterale, testa a sinistra. (C) risultati PCR rappresentativi. dpf, giorni di post fertilizzazione; NC, controllo negativo; PC, controllo positivo; PCR, reazione a catena della polimerasi.
Abstract
Most current methods for genotyping zebrafish embryos require sacrifice or raising the animal to at least 1 month of age for fin amputation. These limitations restrict the use of zebrafish and increase time and costs for experiments. This article introduces an innovative method for genotyping live zebrafish embryos. The method utilizes enzyme to extract a small amount of genetic material from the skin tissue of the embryo. Then, using conventional polymerase chain reaction (PCR) strategy, the embryo is genotyped. This approach was successful >95% of the time while maintaining high viability (>90%) of the embryo. This effective method can facilitate high-throughput screening and other applications in zebrafish.
As a powerful vertebrate model system, zebrafish is being widely used in research fields ranging from developmental biology, disease modeling, and drug discovery. One of the advantages of zebrafish as a model is its amenability to genetic manipulation, which has been dramatically improved with recently developed genetic tools such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology. However, using current methods for genotyping zebrafish, embryos must be sacrificed; or fish must be raised to at least 1 month old to have a fin clip collected. Methods have been described for genotyping of live embryos; however, these require special instruments or tedious surgical procedures.These limitations increase time and cost for experiments and prohibit larger-scale phenotypic screens. Methods to enable fast genotyping of live zebrafish embryos in a high-throughput manner would have extensive applicability and practical significance.
As the zebrafish embryo has a remarkable capacity to regenerate, we set out to establish a cost-efficient live embryo genotyping method based on limited proteinase digestion. First, we tested the DNA extraction ability of different types of proteinases on 72 h postfertilization (hpf) embryos in embryo culture medium. To enhance the digestion efficacy, the samples were incubated at 37°C and constantly mixed on a multiwell plate shaker (Fig. 1A). The results showed both pronase and proteinase K could release DNA from embryo skin tissue, with embryos treated by proteinase K showing higher viability. We, therefore, optimized the procedure with proteinase K (Supplementary Fig. S1A). To further improve the genotyping sensitivity, we prepared four different types of buffer after literature review and compared the DNA extraction efficiency and embryo viability for each. The results showed that when using 30 mM Tris (pH8.0), genotyping polymerase chain reaction (PCR) could be successfully performed in 90% of samples, with a 90% survival rate of genotyped embryos (Fig. 1B and Supplementary Fig. S1B). For applications, including drug screens, mutant genotyping, and genetic screens, researchers require genotype information as rapidly as possible. To minimize the damage of enzyme treatment to the early stage embryo, we optimized the concentration of proteinase K, treatment time, and shaking speed for embryos from 24 to 96 hpf (Supplementary Fig. S1C–F) and listed the recommended treatment conditions in a detailed protocol (Supplementary Data). To test the quality of DNA obtained from the method, we deployed PCR for a variety of amplicon and DNA sequences, and found that up to 1.2 kb could be successfully amplified (Fig. 1C and Supplementary Table S1). We also assessed the possible adverse effects of the treatment on larva behavior, fish survival, and fecundity (Supplementary Fig. S2), with no significant effects observed.
To further enhance the throughput of this method, we established a two-round procedure. At 48 hpf, up to eight embryos could be pooled into 1 well of a 24-well plate, and the mixed DNA was prepared and tested in first-round genotyping. The embryos from positive pools were cultured to allow recovery. At 96 hpf, these embryos were individually re-genotyped (Supplementary Fig. S3). This procedure (see note in the protocol) is suitable for genotyping screens especially those with a low germline transmission rate (such as CRISPR/Cas9-mediated knock-in, base-editing, and large fragment deletion), such that up to 800 embryos could be processed by one person in one round of genotyping.
Our results show that this method provides a fast, cost-efficient, and high-throughput compatible solution to genotyping live zebrafish embryos. The genetic material obtained from this method is suitable for detecting SNPs, transgenes, and mutations, including single base-pair changes, insertions, or deletions. To our knowledge, this is the first report of a limited digestion method and could facilitate the use of zebrafish embryos in biomedical research.
ITALIANO
Riassunto
La maggior parte dei metodi attuali per la genotipizzazione degli embrioni di pesce zebra richiede il sacrificio dell'animale ad almeno 1 mese di età per l'amputazione delle pinne. Queste limitazioni limitano l'uso del pesce zebra e aumentano i tempi e i costi per gli esperimenti. Questo articolo introduce un metodo innovativo per la genotipizzazione di embrioni di pesce zebra vivi. Il metodo utilizza un enzima per estrarre una piccola quantità di materiale genetico dal tessuto cutaneo dell'embrione. Quindi, utilizzando la strategia convenzionale della reazione a catena della polimerasi (PCR), l'embrione viene genotipizzato. Questo approccio ha avuto successo> 95% delle volte pur mantenendo un'elevata vitalità (> 90%) dell'embrione. Questo metodo efficace può facilitare lo screening ad alto rendimento e altre applicazioni nel pesce zebra.
In quanto potente sistema modello di vertebrati, il pesce zebra è ampiamente utilizzato in campi di ricerca che vanno dalla biologia dello sviluppo, alla modellizzazione delle malattie e alla scoperta di farmaci. Uno dei vantaggi del pesce zebra come modello è la sua suscettibilità alla manipolazione genetica, che è stata notevolmente migliorata con strumenti genetici recentemente sviluppati come la tecnologia CRISPR (Short Palindromic Repeats) a intervalli regolari. Tuttavia, utilizzando i metodi attuali per la genotipizzazione del pesce zebra, gli embrioni devono essere sacrificati; oppure il pesce deve essere allevato ad almeno 1 mese di età per poter raccogliere una pinna. Sono stati descritti metodi per la genotipizzazione di embrioni vivi; tuttavia, questi richiedono strumenti speciali o procedure chirurgiche noiose. Queste limitazioni aumentano i tempi e i costi per gli esperimenti e vietano schermi fenotipici su larga scala. I metodi per consentire la genotipizzazione rapida di embrioni di pesce zebra vivi in modo ad alto rendimento avrebbero ampia applicabilità e significato pratico.
Poiché l'embrione di pesce zebra ha una notevole capacità di rigenerarsi, abbiamo deciso di stabilire un metodo di genotipizzazione di embrioni vivi efficiente in termini di costi basato su una digestione limitata della proteinasi. In primo luogo, abbiamo testato la capacità di estrazione del DNA di diversi tipi di proteinasi su embrioni di 72 ore postfertilization (hpf) in un mezzo di coltura embrionale. Per migliorare l'efficacia della digestione, i campioni sono stati incubati a 37 ° C e costantemente miscelati su un agitatore per piastre multipozzetto (Fig. 1A). I risultati hanno mostrato che sia la pronasi che la proteinasi K potrebbero rilasciare DNA dal tessuto cutaneo dell'embrione, con embrioni trattati con proteinasi K che mostrano una maggiore vitalità. Abbiamo quindi ottimizzato la procedura con la proteinasi K (Figura complementare S1A). Per migliorare ulteriormente la sensibilità della genotipizzazione, abbiamo preparato quattro diversi tipi di tampone dopo la revisione della letteratura e confrontato l'efficienza di estrazione del DNA e la vitalità dell'embrione per ciascuno. I risultati hanno mostrato che quando si utilizza 30 mM Tris (pH8.0), la genotipizzazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) potrebbe essere eseguita con successo nel 90% dei campioni, con un tasso di sopravvivenza del 90% degli embrioni genotipizzati (Fig. 1B e Figura supplementare. S1B ). Per le applicazioni, inclusi gli screening dei farmaci, la genotipizzazione mutante e gli schermi genetici, i ricercatori richiedono informazioni sul genotipo il più rapidamente possibile. Per ridurre al minimo il danno del trattamento enzimatico allo stadio iniziale dell'embrione, abbiamo ottimizzato la concentrazione di proteinasi K, il tempo di trattamento e la velocità di agitazione per gli embrioni da 24 a 96 hpf (Figura supplementare. S1C – F) ed elencato le condizioni di trattamento raccomandate in un protocollo dettagliato (dati supplementari). Per testare la qualità del DNA ottenuto dal metodo, abbiamo implementato la PCR per una varietà di sequenze di ampliconi e DNA e abbiamo scoperto che è possibile amplificare con successo fino a 1,2 kb (Fig. 1C e Tabella supplementare S1). Abbiamo anche valutato i possibili effetti negativi del trattamento sul comportamento delle larve, la sopravvivenza dei pesci e la fecondità (Figura supplementare S2), senza effetti significativi osservati.
Per migliorare ulteriormente il rendimento di questo metodo, abbiamo stabilito una procedura in due fasi. A 48 hpf, è stato possibile raggruppare fino a otto embrioni in 1 pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e il DNA misto è stato preparato e testato nella genotipizzazione del primo round. Gli embrioni da pool positivi sono stati coltivati per consentire il recupero. A 96 hpf, questi embrioni sono stati ri-genotipizzati individualmente (Figura complementare S3). Questa procedura è adatta per gli schermi di genotipizzazione, specialmente quelli con una bassa velocità di trasmissione della linea germinale (come il knock-in mediato da CRISPR / Cas9, l'editing di base e l'eliminazione di grandi frammenti), in modo tale che fino a 800 embrioni potrebbero essere elaborati da una persona in un ciclo di genotipizzazione.
I nostri risultati mostrano che questo metodo fornisce una soluzione compatibile veloce, conveniente e ad alto rendimento per la genotipizzazione di embrioni di pesce zebra vivi. Il materiale genetico ottenuto da questo metodo è adatto per rilevare SNP, transgeni e mutazioni, comprese le modifiche, le inserzioni o le delezioni di singole coppie di basi. A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto di un metodo di digestione limitato e potrebbe facilitare l'uso di embrioni di pesce zebra nella ricerca biomedica.
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