Abilitazione della ricerca GPCR con anticorpi GPCR / Enabling GPCR Research with GPCR Antibodies
Abilitazione della ricerca GPCR con anticorpi GPCR / Enabling GPCR Research with GPCR Antibodies
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Figura 1. Analisi Western blot di preparazioni di cellule intere da cellule HEK-293 simulate o trasfettate stabilmente con GPR68 utilizzando l' anticorpo monoclonale di coniglio ricombinante GPR68 (16H23L16) ( prodotto n. 702595 , diluizione 1: 500). B. È stata osservata una forte colorazione di cellule distinte nelle isole pancreatiche nel pancreas umano testato utilizzando lo stesso anticorpo monoclonale di coniglio ricombinante in immunoistochimica. L'inserto mostra il tessuto di controllo in cui non è stato aggiunto alcun anticorpo primario. / A Western blot analysis of whole-cell preparations from mock- or stably GPR68-transfected HEK-293 cells using GPR68 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (16H23L16) (Product # 702595, 1:500 dilution). B. Strong staining of distinct cells in pancreatic islets was observed in the human pancreas tested using the same recombinant rabbit monoclonal antibody in immunohistochemistry. Inset shows control tissue where no primary antibody was added.
Cosa sono i GPCR?
G ( g uanine nucleotide-binding) P rotein- C oupled R eceptors (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di segnalazione cellulare, con oltre 800 membri ( ~ 4%) codificati nel genoma umano. I GPCR sono sette proteine pass-transmembrana che riconoscono diversi ligandi extracellulari, come ammine biogeniche, lipidi, peptidi, proteine, ioni e fotoni. Dopo l'attivazione da parte di un ligando, i GPCR subiscono un cambiamento conformazionale per legare la proteina G e promuovere lo scambio di GTP invece del PIL. La proteina G eterotrimerica (subunità α, β, γ) si dissocia in subunità βγ e α legate a GTP per mediare una cascata di segnali a valle ed effetti biologici. La segnalazione GPCR è più comune in risposta agli ormoni ed ai neurotrasmettitori e svolge un ruolo importante nella vista, nell'olfatto e nel gusto.
Le mutazioni nei GPCR causano più di 30 diverse malattie umane. Non sorprende che i GPCR siano tra i bersagli farmacologici più sfruttati: circa il 30-40% dei farmaci prescritti per insufficienza cardiaca, ipertensione, diabete, cancro alla prostata e asma bronchiale colpiscono i GPCR. Recentemente, la funzione e il malfunzionamento dei GPCR sono stati sempre più implicati nei tumori e sono potenziali biomarcatori per una serie di tumori e disturbi del sistema immunitario.
Sfide nella ricerca GPCR
La biologia unica dei GPCR li rende notoriamente difficili da lavorare. L'estrazione di questi recettori altamente idrofobici dalla membrana cellulare in soluzione senza compromettere l'integrità strutturale e funzionale è tecnicamente impegnativa. Intrinsecamente, queste grandi proteine transmembrana sono scarsamente espresse rispetto ad altre proteine solubili e la sovraespressione spesso si traduce in un fallimento con la localizzazione in una forma inattiva nei corpi di inclusione.
Gli anticorpi anti-GPCR sono importanti strumenti di ricerca e vengono utilizzati per comprendere il ruolo del GPCR in malattie come cancro, infezioni, infiammazioni e malattie cardiovascolari. Tuttavia, la raccolta di anticorpi specifici di alta qualità contro GPCR non è un compito facile. Oltre alle sfide di estrazione e purificazione descritte sopra, la progettazione di antigeni immunogenici è limitata alle regioni esposte e idrofile della GPCR. Inoltre, un singolo GPCR può esibire eterogeneità cellulare nella struttura e attività di legame del ligando che presentano ulteriori sfide nello sviluppo di anticorpi anti-GPCR funzionali.
Sviluppo di anticorpi GPCR
Il gruppo di sviluppo di anticorpi di Thermo Fisher Scientific ha sviluppato anticorpi monoclonali e policlonali ricombinanti di coniglio contro diversi bersagli GPCR utilizzando una piattaforma di sviluppo di anticorpi brevettata. I nostri sforzi di sviluppo di anticorpi GPCR includono l'uso di strategie specifiche per ottenere immunogeni, come peptidi o frammenti proteici corti, e l'utilizzo di residui glicosilati su GCPR per il loro arricchimento e lo screening degli anticorpi. Una volta sviluppata, la specificità dell'anticorpo viene stabilita utilizzando il knockdown del gene, l'internalizzazione del recettore sul trattamento cellulare e l'espressione relativa in diversi tessuti.
Anticorpo monoclonale ricombinante GPR68 per la ricerca di base e gli esami patologici
GPR68 o carcinoma ovarico G
Il recettore accoppiato a proteine (OGR1) è un membro della famiglia GPCR di rilevamento dei protoni. La proteina è attiva a un pH leggermente acido, 6,8, ma inattiva a pH 7,8. A pH acido, quattro istidine nel ciclo extracellulare vengono protonate con conseguente interruzione dei legami H e attivazione della proteina. Oltre al pH, ogerina e benzodiazepina lorazepam agiscono come attivatori chimici. Si dice che GPR68 svolga ruoli importanti nell'infiammazione, nell'ischemia e nella tumorigenesi. Queste condizioni sono caratterizzate da variazioni di pH nel microambiente.
Esistono rapporti contraddittori sul ruolo del GPR68 nella tumorigenesi. Nelle linee cellulari tumorali, una maggiore espressione di GPR68 si traduce in una ridotta proliferazione e migrazione cellulare, suggerendo quindi ruoli di soppressore tumorale. Tuttavia, il deficit di GPR68 negli esperimenti sul modello di cancro del topo ha favorito la riduzione del tumore indicando le funzioni del promotore del tumore. Ulteriori indagini sono fondamentali per verificare se l'impatto del GPR68 varia a seconda del tipo di cellula tumorale, del microambiente e delle differenze nei tumori primari e nelle metastasi.
Una delle principali limitazioni dello studio del GPR68 nei tessuti rispetto alle linee cellulari tumorali è l'indisponibilità di uno specifico anticorpo monoclonale con una colorazione di fondo minima. Per sviluppare un tale reagente, abbiamo utilizzato la coda carbossilica del GPR68 umano come epitopo per generare un anticorpo monoclonale ricombinante di coniglio ( GPR68 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody, 16H23L16, Product # 702595 ) che potrebbe essere efficacemente utilizzato per tre applicazioni, vale a dire western blot (figura 1A), immunocitochimica e doppia etichettatura di immunofluorescenza di sezioni di tessuto normale e neoplastico. La specificità dell'anticorpo potrebbe essere verificata mediante knockdown genetico utilizzando siRNA, con conseguente riduzione del segnale nel western blotting.
Nell'immunofluorescenza, è stato possibile osservare una chiara colorazione citoplasmatica a pH 6,8 o 7,4 e quando è stato utilizzato il trattamento con lorazepam. Tuttavia, questo è cambiato alla colorazione della membrana plasmatica a pH 7,8, rispecchiando la biologia GPR68. L'immunoistochimica dei tessuti normali ha rivelato distintamente la presenza di GPR68 nelle cellule alfa del pancreas che producono glucagone (figura 1B), nelle cellule neuroendocrine del tratto intestinale, nelle ghiandole gastriche, nei granulociti, nei macrofagi e negli strati muscolari dei vasi sanguigni.
Per decifrare i ruoli di GPR68 nel cancro e la sua presenza in campioni di tumori umani, Herzig et al hanno valutato GPR68 in un ampio pannello di tessuti tumorali. Sulla base di un "punteggio immunoreattivo" calcolato, la colorazione anticorpale più evidente è stata attribuita ai tumori pancreatici e neuroendocrini. I risultati della colorazione sono stati correlati con i dati clinici, come la classificazione, la stadiazione, la secrezione di glucagone o insulina e la sopravvivenza globale del paziente. Una maggiore espressione di GPR68 è stata osservata in tumori ben differenziati rispetto all'espressione in neoplasie altamente aggressive e correlata con un più alto tasso di sopravvivenza. Ciò suggerisce che nei tumori neuroendocrini, GPR68 può agire come un soppressore del tumore.
Lo sviluppo di uno specifico anticorpo GPR68 che funziona in una varietà di applicazioni è incredibilmente utile. La ricerca su GPR68 ha generato una grande quantità di informazioni su un GPCR che fino a pochi anni fa era caratterizzato come un recettore orfano con ligandi endogeni sconosciuti, funzioni biologiche e rilevanza clinica.
What are GPCRs?
G (guanine nucleotide-binding) Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are the largest family of cell signaling receptors, with over 800 members (~4%) encoded in the human genome. GPCRs are seven pass-transmembrane proteins that recognize diverse extracellular ligands, such as biogenic amines, lipids, peptides, proteins, ions, and photons. Upon activation by a ligand, GPCRs undergo a conformational change to bind the G-protein and promote exchange of GTP instead of GDP. The heterotrimeric (α, β, γ subunits) G-protein dissociates into βγ and GTP-bound α subunits to mediate a downstream signal cascade and biological effects. GPCR signaling is most common in response to hormones and neurotransmitters and play important roles in vision, olfaction, and taste.
Mutations in GPCRs cause more than 30 different human diseases. Not surprisingly, GPCRs are amongst the most exploited drug targets – approximately 30-40% of drugs prescribed for heart failure, hypertension, diabetes, prostate cancer, and bronchial asthma target GPCRs. Recently, GPCRs function and malfunction have been increasingly implicated in cancers and are potential biomarkers for a number of cancers and immune system disorders.
Challenges in GPCR research
The unique biology of GPCRs makes them notoriously difficult to work with (2). Extraction of these highly hydrophobic receptors from the cell membrane into solution without compromising the structural and functional integrity is technically challenging. Inherently, these large transmembrane proteins are poorly expressed compared to other soluble proteins and overexpression often results in failure with localization to an inactive form in the inclusion bodies.
Anti-GPCR antibodies are important research tools and are used in understanding GPCR’s role in diseases such as cancer, infection, inflammation, and cardiovascular disease. However, raising high-quality, specific antibodies against GPCRs is no easy task. In addition to the extraction and purification challenges described above, the design of immunogenic antigens is restricted to exposed, hydrophilic regions of the GPCR. Additionally, a single GPCR can exhibit cellular heterogeneity in structure and ligand-binding activities presenting additional challenges in the development of functional anti-GPCR antibodies.
GPCR antibody development
The antibody development team at Thermo Fisher Scientific has developed rabbit recombinant monoclonal and polyclonal antibodies against several GPCR targets by employing a proprietary antibody development platform. Our GPCR antibody development efforts include the usage of specific strategies to obtain immunogens, such as peptides or short protein fragments, and the utilization of glycosylated residues on GCPRs for their enrichment and antibody screening. Once developed, antibody specificity is established using gene knockdown, receptor internalization on cell treatment, and relative expression in different tissues.
GPR68 recombinant monoclonal antibody for basic research and pathological examinations
GPR68 or ovarian cancer G Protein coupled Receptor 1 (OGR1) is a member of the proton sensing GPCR family. The protein is active at a slightly acidic pH, 6.8, but inactive at pH 7.8. At acidic pH, four histidines in the extracellular loop are protonated resulting in disruption of H-bonds and activation of the protein. Apart from pH, ogerin and benzodiazepine lorazepam act as its chemical activators. GPR68 is reported to play major roles in inflammation, ischaemia, and tumorigenesis. These conditions are characterized by pH changes in the microenvironment.
Contradictory reports exist on the role of GPR68 in tumorigenesis. In cancer cell lines, increased GPR68 expression results in reduced cell proliferation and migration, thus, suggesting tumor suppressor roles. However, GPR68 deficiency in mouse cancer model experiments favored tumor reduction indicating tumor promoter functions. Further investigation is crucial to verify if GPR68 impact varies depending on the tumor cell type, microenvironment, and differences in primary tumors and metastases.
A major limitation of studying GPR68 in tissues as opposed to cancer cell lines is the unavailability of a specific monoclonal antibody with minimal background staining. To develop such a reagent, we used the carboxyl-terminal tail of human GPR68 as an epitope to generate a rabbit recombinant monoclonal antibody (GPR68 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody, 16H23L16, Product # 702595) that could be effectively used for three applications, namely western blot (figure 1A), immunocytochemistry, and immunofluorescence double-labelling of normal and neoplastic tissue sections. Specificity of the antibody could be verified by genetic knockdown using siRNA, resulting in a reduction in signal in western blotting.
In immunofluorescence, clear cytoplasmic staining could be observed at pH 6.8 or 7.4 and when the lorazepam treatment was used. However, this changed to plasma membrane staining at pH 7.8, mirroring GPR68 biology. Immunohistochemistry of normal tissues distinctly revealed GPR68 presence in glucagon- producing alpha cells of pancreas (figure 1B), neuroendocrine cells of the intestinal tract, gastric glands, granulocytes, macrophages, and muscle layers of blood vessels.
To decipher GPR68 roles in cancer and its presence in human tumor samples, Herzig et al assessed GPR68 in a broad panel of tumor tissues. Based on a calculated ‘immune reactive score’ the most prominent antibody staining was attributed in pancreatic and neuroendocrine tumors. The staining results were correlated with clinical data, such as grading, staging, glucagon, or insulin secretion, and patient overall survival. Higher GPR68 expression was noted in well-differentiated tumors compared to the expression in highly aggressive neoplasms and correlated with higher survival rate. This suggests that in neuroendocrine tumors, GPR68 may act as a tumor suppressor.
The development of a specific GPR68 antibody that works in a variety of applications is incredibly useful. Research on GPR68 has generated a wealth of information on a GPCR that until a few years ago was characterized as an orphan receptor with unknown endogenous ligands, biologicalfunctions, and clinical relevance.
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