Approfondimenti dal laboratorio: le sfide della selezione della DNA Polimerasi per i test virali nel punto di cura / Insights from the bench: the challenges of DNA polymerase selection for viral point of care testing
Approfondimenti dal laboratorio: le sfide della selezione della
DNA Polimerasi per i test virali nel punto di cura /
Le piattaforme di test molecolari rapidi mirate al genoma virale basate sulla reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) facilitano la velocità, la sensibilità e la scala per le diagnosi di laboratorio non possibili con la microbiologia convenzionale. I laboratori di ricerca e sviluppo ed i produttori di IVD di tutto il mondo stanno correndo per innovare piattaforme molecolari point of care rapide, versatili e robuste ; tuttavia, la questione di come affrontare al meglio questo aspetto è complessa. Abbiamo incontrato il dott. John Goh, Senior Research Scientist presso Veredus Laboratories, per ottenere la sua consulenza di esperto, basata sulla sua esperienza nel mondo reale, sulle considerazioni chiave sulle materie prime per lo sviluppo di queste piattaforme .
Da quando il primo test molecolare su campioni diretti per malattie infettive è stato approvato dalla FDA degli Stati Uniti 26 anni fa, c'è stata una recente esplosione nelle piattaforme di amplificazione e rilevamento rapido a campione diretto. Ma quali sono i requisiti di progettazione primari che gli scienziati di R&S devono considerare quando sviluppano la prossima generazione di piattaforme di test molecolari rapidi mirate al genoma virale? Abbiamo parlato con il dott. John Goh, Senior Research Scientist presso Veredus Laboratories, per discutere la sua esperienza nello sviluppo di test ed applicazioni con la piattaforma PCR microarray all'avanguardia VereChip ™ Lab-on-Chip .
Combinazione di due tecnologie per ampliare gli orizzonti della piattaforma di test molecolari rapidi
Sebbene i microarray possano analizzare simultaneamente più geni, la loro sensibilità a livello di sistema è relativamente bassa. Al contrario, la PCR è limitata nel numero di target che possono essere fedelmente amplificati simultaneamente, a causa delle interazioni primer-primer incontrollabili. Combinando i due metodi, la capacità di specificità viene migliorata. La tecnologia VereChip ™ integra sia la PCR che la tecnologia microarray, per realizzare capacità di multiplexing innovative.
"Questa capacità di catturare più bersagli significa che le coinfezioni di malattie infettive possono essere determinate all'interno di un singolo dosaggio." Afferma il dott. Goh: "Abbiamo sviluppato il processo di progettazione delle sonde per microarray in modo tale da essere in grado di distinguere tra sequenze di DNA nella misura di polimorfismi a singolo nucleotide". Utilizzando questa capacità, il dottor Goh è stato in grado di estendere l'ambito di questo saggio alla scientifica criminale; “Questa è stata un'estensione molto interessante della nostra piattaforma Lab on Chip (LOC). Il tempo di risposta per questo test, inclusa l'estrazione del campione e la preamplificazione, è di circa 3 ore. "
Tripla minaccia: velocità, sensibilità e specificità
La pandemia globale ha posto un'enfasi eccessiva sulla rapida inversione di tendenza del saggio per limitare la diffusione della trasmissione. Il dott. Goh concorda che "dall'esperienza del Covid-19, il tempo di consegna del test ha dimostrato di essere una caratteristica essenziale del test". Ciò ha avuto un impatto significativo sul campo della diagnostica in vitro , con una maggiore attenzione a "mirare a ridurre il tempo di estrazione per risparmiare tempo".
"... dall'esperienza del Covid-19, è stato dimostrato che il tempo necessario per il test è una caratteristica essenziale del test "
Al di sopra della velocità, quali sono stati i requisiti di progettazione primari del dottor Goh durante lo sviluppo del suo test COVID-19? “Il punto focale quando ci si avvicina allo sviluppo del kit di analisi, secondo me, è la specificità e la sensibilità del dosaggio. Questo perché durante la valutazione clinica, le autorità guarderanno sicuramente i dati in termini di numero di falsi negativi e falsi positivi, come previsto dal test ".
Per quanto riguarda la specificità, il dottor Goh prosegue spiegando che "a causa della possibilità di mutazioni man mano che la malattia infettiva si evolve, sono inclusi diversi geni target del patogeno per migliorare non solo la robustezza ma anche per garantire che in caso di mutazioni ci siano obiettivi di backup che garantiranno la pertinenza del dosaggio. "
L'impatto della selezione delle materie prime: DNA polimerasi
In definitiva, velocità, specificità e sensibilità possono essere raggiunte solo con la selezione della materia prima appropriata. Dei cinque componenti principali di una miscela PCR, la DNA polimerasi è una considerazione essenziale.
"Ci sono molti componenti che compongono il test, ma il componente che desidero evidenziare è la miscela di enzimi per il test"
Per quanto riguarda le prestazioni della DNA polimerasi, il dottor Goh sottolinea l'importanza della miscela di enzimi per un dato dosaggio; infatti, la considerazione di agenti che potenziano la PCR può ottimizzare le prestazioni degli enzimi e consentire un'amplificazione efficiente. “Spesso vengono aggiunti anche additivi per migliorare la resistenza contro l'inibizione della PCR. In termini di gestione del rischio "afferma il dott. Goh" è uno dei fattori più importanti da considerare perché è essenziale per l'esecuzione del test. La miscela di enzimi è soggetta a fluttuazioni di temperatura e qualsiasi variazione avrà un impatto sulla specificità e sensibilità del test. "
DNA polimerasi: 1 fase, 1 enzima o 2 fasi, 2 enzimi per RT-qPCR?
Una serie di fattori influenzano la scelta tra RT-qPCR in una fase o RT-qPCR in due fasi; tuttavia, la tendenza verso una rapida inversione di tendenza ha alimentato l'approccio in un'unica fase. Il dottor Goh è d'accordo? "Per un dispositivo diagnostico molecolare, un sistema enzimatico a una fase è decisamente preferito, soprattutto se si considera la facilità d'uso." Con RT-PCR in una fase, le fasi di trascrizione inversa doppia (RT) e qPCR vengono condotte nella stessa reazione; ciò è conforme alla natura quantitativa in tempo reale dei test PCR che dominano le metodologie diagnostiche molecolari. Inoltre aggira le difficoltà nell'ottimizzazione delle condizioni per soddisfare simultaneamente i requisiti degli enzimi della trascrittasi inversa e della DNA polimerasi nell'approccio in due fasi. Con one-step un solido vincitore nella diagnostica quantitativa in tempo reale per il targeting virale, è necessaria una DNA polimerasi bifunzionale termostabile con doppia DNA polimerasi e attività di trascrittasi inversa. Quali enzimi vengono offerti?
"Il primo sistema di dosaggio a un enzima è stato l' enzima Tth DNA polimerasi in grado di eseguire sia la trascrizione inversa che le funzioni della DNA polimerasi", afferma il dott. Goh. Derivata dal batterio termofilo Thermus thermophilus (Tth) HB8, la DNA polimerasi Tth è termostabile, possiede attività di trascrittasi inversa oltre ad un'attività polimerasi 5 '→ 3' e un'attività esonucleasica 5 '→ 3' specifica a doppio filamento in presenza di Mn 2+ ioni. Pertinente alla sfida dei bersagli virali per l'amplificazione, la Tth DNA Polymerase è efficace per la trascrizione inversa di RNA con struttura secondaria complicata a causa della reazione che si verifica ad alte temperature.
TTx DNA Polymerase è la prossima generazione di enzimi Tth DNA Polymerase-simili, che offre anche l'opzione di un sistema monoenzimatico. Come Tth, TTx DNA Polymerase mostra attività di trascrittasi inversa in presenza di ioni Mn 2+ con un'amplificazione rapida ed efficace da campioni grezzi. Il dottor Goh prosegue dicendo: "questo sistema potrebbe essere preferibile per diversi motivi:
Facilità di controllo di qualità . Un sistema a un enzima rappresenta una semplificazione nei controlli di qualità, poiché sono coinvolti meno componenti.
Migliore esperienza del cliente . In precedenza abbiamo richiesto ai nostri clienti di pipettare diversi componenti, inclusi gli enzimi della trascrittasi inversa e della polimerasi. Avere un sistema con un solo enzima aumenterebbe sicuramente la facilità d'uso del test. "
"Trovo che le prestazioni siano paragonabili se non migliori."
Qual è stata l'esperienza del dottor Goh con le prestazioni di trascrizione inversa delle sue scelte enzimatiche per i sistemi di dosaggio di un enzima? “Abbiamo recentemente esplorato l'uso della TTx DNA polimerasi sostituendo la miscela enzimatica esistente nei saggi SARS-COV 2 esistenti sia sulla piattaforma LOC che sulla PCR in tempo reale. Sulla base di prove molto preliminari, trovo che le prestazioni siano paragonabili se non migliori ", afferma," Ipotizzo che il vantaggio di essere in grado di funzionare a una temperatura di trascrizione inversa più alta potrebbe portare a prestazioni migliori ". Tra Tth e TTx DNA Polymerase, il dott. Goh spiega "TTx DNA Polymerase può eseguire la fase a 60 ° C, che sarebbe più ideale per superare le possibili strutture secondarie di mRNA che ostacolano questa fase. Forse a causa della temperatura più alta, siamo stati anche in grado di limitare la fase di trascrizione inversa a 5 minuti negli studi preliminari con risultati soddisfacenti ".
Il futuro della DNA polimerasi
Tornando al ruolo degli additivi nell'aumentare la stabilità della DNA polimerasi, ci sono sviluppi entusiasmanti in cantiere. Il dottor Goh ha già lavorato con enzimi privi di glicerolo, per i quali c'è stato molto interesse negli ultimi anni. Sebbene il glicerolo svolga un ruolo crioprotettore, rappresenta un ostacolo alla liofilizzazione delle proteine. Con prodotti "lyo-ready" che offrono numerosi vantaggi, da una migliore esperienza utente a vantaggi economici e ambientali su larga scala, sono un'opzione interessante per gli scienziati di R&S. In quanto tali, sono state sviluppate soluzioni alternative, con tendenze recenti, tra cui test molecolari point-of-care a base di acido nucleico liofilizzato. Qual è l'attrazione principale per il dottor Goh? "Questo approccio migliorerebbe l'esperienza del cliente perché tutto ciò che il cliente deve fare è ricostituire la singola miscela di reazione e aggiungere il campione estratto."
Oltre alla facilità di ricostituzione, un ulteriore vantaggio è la stabilità della temperatura ambiente, che aggira i requisiti di trasporto e conservazione a freddo dei reagenti PCR convenzionali. Con vantaggi come questo sia per il settore della fornitura di reagenti che per l'utente finale, il dott. Goh continua “i test possono essere portati in stazioni fuori campo senza i normali servizi che esistono in un laboratorio convenzionale. L'azienda è anche in grado di ridurre i costi di spedizione nella catena del freddo come ulteriore vantaggio ".
"La sensibilità e la specificità del dosaggio non dovrebbero essere compromesse come risultato del processo di liofilizzazione"
Ma gli enzimi privi di glicerolo non sono privi di sfide “diversi fornitori hanno i loro processi di liofilizzazione e additivi unici per stabilizzare la miscela di enzimi. Devono essere effettuati ulteriori studi riguardanti il reagente liofilizzato finale e la compatibilità con il test ", afferma il dott. Goh," anche il costo della liofilizzazione deve essere gestito con attenzione per ridurre al minimo il costo delle merci ".
In definitiva, qual è l'asporto del dottor Goh? "La prospettiva di fornire reagenti liofilizzati ai nostri clienti come parte del kit di analisi è entusiasmante…. riteniamo che questa sarebbe la via da seguire. "
Con il futuro delle piattaforme di test molecolari rapidi che comprendono RT-qPCR, PCR endpoint con microfluidica e tecnologie di array e piattaforme integrate , la scelta delle materie prime, in particolare la DNA polimerasi, ha la capacità di migliorare la velocità, la sensibilità e la specificità. può offrire.
Con oltre 35 anni di esperienza, SEKISUI Diagnostics affronta la sfida dei saggi RT-qPCR in una sola fase rapidi ed efficienti. Con enzimi ad alte prestazioni, che offrono un'elevata efficienza di amplificazione, SEKISUI consente agli scienziati di ricerca e sviluppo di sviluppare e fornire piattaforme molecolari rapide con applicazioni versatili dalla medicina legale, alla sorveglianza alimentare, ai test rapidi POC delle malattie infettive.
ENGLISH
Rapid molecular test platforms targeting the viral genome based on real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) facilitate speed, sensitivity, and scale for laboratory diagnoses not possible with conventional microbiology. R&D labs and IVD manufacturers worldwide are racing to innovate rapid, versatile, and robust point of care molecular platforms; however, the question of how best to approach this is complex. We caught up with Dr John Goh, Senior Research Scientist at Veredus Laboratories, to get his expert advice, based on his real-world experience, on the key raw material considerations for the development of these platforms.
Since the first direct-specimen molecular testing for infectious diseases was approved by the US FDA 26 years ago, there has been a recent explosion in direct-specimen rapid amplification and detection platforms. But what are the primary design requirements R&D scientists need to consider when developing the next generation of rapid molecular test platforms targeting the viral genome? We spoke to Dr John Goh, Senior Research Scientist at Veredus Laboratories, to discuss his experience of developing assays and applications with the cutting-edge PCR microarray VereChip™ Lab-on-Chip platform.
Combining two technologies to broaden rapid molecular test platform horizons
While microarrays can simultaneously analyse multiple genes, their system-level sensitivity is relatively low. Conversely, PCR is restricted in the number of targets that can be faithfully amplified simultaneously, because of uncontrollable primer–primer interactions. By combining the two methods, the capacity for specificity is enhanced. VereChip™ technology integrates both PCR and microarray technology, to bring about innovative multiplexing capabilities.
“This ability to capture multiple targets means that co-infections of infectious diseases can be determined within a single assay.” Says Dr Goh, “We have developed the design process of the microarray probes such that we are able to distinguish between DNA sequences to the extent of single nucleotide polymorphisms.” Using this capability, Dr Goh has been able to extend the scope of this assay to criminal forensics; “this has been a very exciting extension of our Lab on Chip (LOC) platform. The turn-around time for this assay including sample extraction and pre-amplification is about 3 hours.”
Triple threat: speed, sensitivity and specificity
The global pandemic placed undue emphasis on rapid assay turnaround to limit the spread of transmission. Dr Goh agrees “from the experience of Covid-19, the turn-around time for the assay has been shown to be an essential feature of the assay”. This has had a significant impact on the in vitro diagnostics field, with a stronger focus on “aiming to cut-out the extraction time to save time.”
“…from the experience of Covid-19, the turn-around time for the assay has been shown to be an essential feature of the assay”
Above speed, what did Dr Goh consider to be the primary design requirements when developing his COVID-19 assay? “The focus when approaching assay kit development in my own opinion is the specificity and sensitivity of the assay. This is because when undergoing clinical evaluation, the authorities will definitely be looking at the data in terms of the number of false-negatives and false-positives as predicted by the assay.”
With regards to the specificity, Dr Goh goes on to explain “due to the possibility of mutations as the infectious disease evolves, several gene targets of the pathogen are included to not only improve robustness but also to guarantee that should any mutations occur, there are back-up targets that will ensure the relevance of the assay.”
The impact of raw material selection: DNA polymerase
Ultimately, speed, specificity and sensitivity can only be achieved with the selection of the appropriate raw material. Of the five core components of a PCR mix, DNA polymerase is an essential consideration.
“There are many components that make up the assay, but the component I wish to highlight is the enzyme mix for the assay”
Regarding DNA polymerase performance, Dr Goh highlights the importance of the enzyme mix for a given assay; indeed, consideration of PCR-enhancing agents can optimise enzyme performance and allow efficient amplification. “Additives are also often added to improve the robustness against PCR inhibition. In terms of risk management” says Dr Goh “it is one of the most important factors to consider because it is essential to the performance of the assay. The enzyme mix is prone to temperature fluctuations, and any variation will have an impact on the specificity and sensitivity of the assay.”
DNA Polymerase: 1-Step, 1-Enzyme or 2-Steps, 2-Enzymes for RT-qPCR?
A host of factors affect the choice between one-step RT-qPCR or two-step RT-qPCR; however, the trend towards rapid turnaround has fueled the one-step approach. Does Dr Goh agree? “For a molecular diagnostic device, a one-step enzyme system is definitely preferred, especially when you take into consideration the ease-of-use.” With one-step RT-PCR, dual reverse transcription (RT) and qPCR steps are conducted in the same reaction; this complies with the quantitative real-time nature of PCR tests dominating molecular diagnostic methodologies. It also bypasses the difficulties in optimising conditions to simultaneously meet the requirements of the reverse transcriptase and DNA polymerase enzymes in the two-step approach. With one-step a firm winner in viral-targeting real-time quantitative diagnostics, a bifunctional thermostable DNA polymerase with dual DNA polymerase and reverse transcriptase activities is required. What enzymes are on offer?
“The first one-enzyme assay system was the Tth DNA Polymerase enzyme that could perform both reverse transcription and DNA polymerase functions” says Dr Goh. Derived from the thermophilic bacteria Thermus thermophilus (Tth) HB8, Tth DNA polymerase is thermostable, possessing reverse transcriptase activity in addition to a 5’→3’ polymerase activity and a double strand specific 5’→3’ exonuclease activity in the presence of Mn2+ ions. Pertinent to the challenge of viral targets for amplification, Tth DNA Polymerase is effective for reverse transcription of RNA with complicated secondary structure due to the reaction occurring at high temperatures.
TTx DNA Polymerase is the next generation of Tth DNA Polymerase-like enzymes, also offering the option of a one-enzyme system. Like Tth, TTx DNA Polymerase exhibits reverse transcriptase activity in the presence of Mn2+ ions with fast and effective amplification from crude samples. Dr Goh goes on to say, “this system might be preferable for several reasons:
Ease of quality control. A one enzyme system represents a simplification in the quality control checks, as fewer components are involved.
Better customer experience. We have previously required our customers to pipette different components including both the reverse transcriptase and polymerase enzymes. Having a one enzyme system would certainly enhance the ease of use of the assay.”
“I find that the performance is comparable if not better.”
What has been Dr Goh’s experience with the reverse transcription performance of his enzyme choices for one-enzyme assay systems? “We have recently explored the use of TTx DNA Polymerase by switching out the existing enzyme mix in the existing SARS-COV 2 assays both on the LOC platform and real-time PCR. Based on very preliminary trials, I find that the performance is comparable if not better” he says, “I hypothesise that the advantage of being able to run at a higher reverse transcription temperature might result in better performance.” Between Tth and TTx DNA Polymerase, Dr Goh explains “TTx DNA Polymerase can carry out the step at 60 °C, which would be more ideal to overcome possible secondary mRNA structures that hinder this step. Possibly due to the higher temperature, we have also been able to restrict the reverse transcription step to 5 minutes in preliminary studies with satisfactory results.”
The future of DNA polymerase
Circling back to the role of additives in increasing DNA polymerase stability – there are exciting developments in the pipeline. Dr Goh has previously worked with glycerol free enzymes, for which there has been a lot of interest in the last few years. While glycerol plays a cryoprotectant role, it poses a roadblock to protein lyophilization. With “lyo-ready” products offering a wealth of advantages from improved user experience to large-scale economic and environmental benefits, they are an attractive option for R&D scientists. As such, alternative solutions have been developed, with recent trends including lyophilised nucleic acid-based molecular point-of-care assays. What is the main attraction for Dr Goh? “This approach would improve the customer experience because all the customer needs to do is to reconstitute the single reaction mix and add the extracted sample.”
In addition to the ease of reconstitution, a further benefit is the ambient temperature stability – which circumvents the cold transport & storage requirements of conventional PCR reagents. With benefits like this to both the reagent supply industry and the end-user, Dr Goh continues “the tests can be brought to out-field stations without the usual amenities that exist in a conventional lab. The company is also able to reduce costs in cold-chain shipment as an added benefit.”
“The sensitivity and specificity of the assay should not be compromised as a result of the lyophilisation process”
But glycerol-free enzymes are not without their challenges “different vendors have their unique lyophilisation processes and additives to stabilise the enzyme mix. Further studies regarding the final lyophilised reagent and the compatibility with the assay must be carried out” says Dr Goh, “the cost of lyophilisation also needs to be managed carefully to minimise the cost of goods.”
Ultimately, what is Dr Goh’ s takeaway? “the prospect of providing lyophilised reagents to our customers as part of the assay kit is exciting…. we feel this would be the way forward.”
With the future of rapid molecular test platforms encompassing RT-qPCR, endpoint PCR with microfluidics and array technologies, and integrated platforms, the choice of raw materials– in particular, DNA polymerase – has the capacity to improve the speed, sensitivity, and specificity they can offer.
With over 35 years’ experience, SEKISUI Diagnostics addresses the challenge of rapid and efficient one-step RT-qPCR assays. With high-performance enzymes, delivering high amplification efficiency, SEKISUI enables R&D scientists to develop and deliver rapid molecular platforms with versatile applications from forensics, through food surveillance, to rapid POC testing of infectious disease.
Da:
https://blog.sekisuidiagnostics.com/dxdialogue/the-challenges-of-dna-polymerase-selection-for-viral-point-of-care-testing-insights-from-the-bench?utm_campaign=Enzymes%2FMethod%20-%202020&utm_source=facebook&utm_medium=paidsocial&utm_content=fb-paid-dxdialogue-article-3-lookalike_v2&hsa_acc=10203188547129041&hsa_cam=23847269182580484&hsa_grp=23847269386960484&hsa_ad=23847269386950484&hsa_src=fb&hsa_net=facebook&hsa_ver=3
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