Human pluripotent stem cells: derivation and applications / Cellule staminali pluripotenti umane: derivazione e applicazioni
Human pluripotent stem cells: derivation and applications / Cellule staminali pluripotenti umane: derivazione e applicazioni
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
In vivo, after transplantation into animals, these cells can form teratomas comprising various cell lineages, or integrate as functional cells into specific tissues.
Human PSCs can acquire epigenetic and genetic aberrations, typically in specific chromosomal hot spots and in cancer-associated genes.
Human PSCs have a wide range of applications related to the study of early human development, disease modelling and regenerative medicine.
Multiple human disorders can now be modelled using cells derived from human PSCs and grown in monolayers, spheroids or organoids.
These cell cultures are used for the discovery of therapeutics by applying high-throughput screening (HTS) or candidate medication approaches.
Cells derived from human PSCs are also in clinical trials as treatments for various human disorders.
Derivation of human PSCs
Human PSCs can be derived from multiple sources.
ESCs are derived from blastocyst-stage embryos, whereas iPSCs are reprogrammed from somatic cells, ofen by inducing the expression of the transcription factors OCT4, SOX2, KLF4 and MYC2 .
Uniparental ESCs contain only maternal (parthenogenetic) or paternal (androgenetic) genomes and are generated from artificially activated unfertilized eggs or by injection of a sperm into an enucleated egg, respectively.
These cells can serve as a source from which to derive haploid ESCs that have a single set of chromosomes .
Somatic cells can also be reprogrammed by nuclear transfer (NT) into enucleated eggs.
Differentiation of human PSCs
Human PSCs can differentiate into cells of all three embryonic germ layers, which is demonstrated in vitro by aggregation into embryoid bodies.
Directed differentiation towards defined cell types is achieved via the addition of specific growth factors or small molecules.
Self-organizing structures of a specific lineage can generate organoids resembling functional organs.
The injection of undifferentiated human PSCs into immunodeficient mice results in teratomas, while transplantation of immature differentiated cells into relevant animal tissues can promote the functional maturation of these cells in vivo.
Genomic stability of human PSCs
Extended growth in vitro can lead to the selective expansion of human PSCs carrying certain genetic abnormalities.
Large genomic alterations appear predominantly as gains in chromosomal regions 1q, 12p, 17q, 20q and the X chromosome.
Point mutations in tumour-related genes have also been detected, mainly in the tumour suppressor gene TP53.
Epigenetic aberrations, such as changes in DNA methylation, can also accumulate, affecting genes associated with parental imprinting and cancer.
Abnormalities that arise will persist following differentiation, potentially having hazardous consequences for some applications of human PSCs.
It is thus important to undertake a detailed characterization of cells being grown in vitro for long periods of time, including routine karyotyping of cells.
Some approaches to improve the quality of PSCs might include the use of alternative derivation techniques or better growth conditions.
Human development
In culture, undifferentiated PSCs can be induced to differentiate into ectodermal, mesodermal and endodermal cells, mimicking embryonic differentiation during gastrulation.
Further specification can be induced by using small molecules, proteins or transcription factors in a stepwise manner that simulates normal developmental trajectories to guide differentiation to hundreds of cell types, simulating the process of organogenesis.
Comparing these processes across various species can be applied to study human evolution.
Therefore, PSCs are a valuable tool to model human development, for stages that are otherwise inaccessible for research.
Disease modelling and drug discovery
A major application of human PSC technology is in modelling human disease which can be achieved by three possible approaches: gene editing, to recapitulate a mutation associated with a genetic disorder; isolation of ESCs from affected blastocysts identified by PGD; or via the generation of iPSCs from patients’ somatic cells.
Generating these models advances our knowledge of the molecular and cellular basis of diseases and serves to identify new therapies.
These disease models can also be used to test and discover drugs, ofen by HTS, that ameliorate pathological phenotypes.
Moreover, infectious disorders can be studied by introducing specific viruses or bacteria to PSCs or to cultures derived from them, such as organoids.
Cell therapy
Human PSCs already play a role in regenerative medicine for disorders such as blindness, diabetes and Parkinson disease.
Transplantation of differentiated cell types derived from PSCs is being tested in both animal pre-clinical and human clinical trials.
One major safety measure is to eliminate undifferentiated tumorigenic cells before transplantation.
This can potentially be achieved by differentiation and sorting protocols, by pharmacological means or by introducing a ‘switch system’ that induces cell death.
To avoid immune rejection, patients’ own cells can be reprogrammed into iPSCs, allowing autologous transplantation.
In allogeneic transplantation, the need for treatment with immunosuppressive drugs may be avoided by establishing a bank of HLA haplotype-matching PSCs or the generation of universal cells, which are designed to evade undesirable immune responses.
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Glossary and abbreviations
Allogeneic cell transplantation
A form of cell therapy in which cells of a genetically distinct donor are used for transplantation.
Androgenetic (a) cells
Cells carrying only a paternal genome, generated by introduction of sperm into an enucleated egg. For example, androgenetic ESCs (aESCs).
Autologous cell transplantation
A form of cell therapy in which the patient’s own cells are used for transplantation.
Blastocyst
An early embryonic structure formed in humans 5 days post-fertilization, comprising an inner cell mass of pluripotent cells, an external layer of trophectoderm cells and a blastocoel fluid cavity.
Cell therapy
An approach to treat human diseases by transplanting functional cells into patients.
Culture adaptation
Alterations arising in a population of cells during prolonged growth in culture, resulting in increased fitness.
Directed differentiation
In vitro differentiation of cells towards a specific cell type by defined culture conditions.
Disease modelling
A strategy to study human diseases using cells that exhibit relevant pathological features.
Embryoid bodies
Sphere-shaped aggregates of pluripotent stem cells undergoing spontaneous differentiation into the three embryonic germ layers.
Embryonic stem cells (ESCs).
Pluripotent stem cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage embryos.
Haploid cells
Cells carrying a single set of chromosomes, in contrast to diploid cells, which contain two sets of chromosomes.
High-throughput screening (HTS).
A method for simultaneously assessing the biological effects of a large set of chemical compounds or genetic alterations.
Human leukocyte antigen (HLA).
The major histocompatibility complex in humans, which is part of the immune system. It encodes cell surface molecules that are specialized to present antigenic peptides to T cell receptors.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs).
Pluripotent stem cells derived from somatic cells by a set of reprogramming factors, for example, OCT4, SOX2, KLF4 and MYC (collectively referred to as OSKM).
Organoids
Three-dimensional structures assembled from self-organizing cells that simulate an organ in vitro.
Parthenogenetic (p) cells
Cells carrying only a maternal genome, established by activation of an unfertilized egg; for example, parthenogenetic SCs (pESCs).
Pluripotent stem cells (PSCs).
Cells capable of indefinite selfrenewal and differentiation into all three embryonic germ layers.
Preimplantation genetic diagnosis (PGD).
A test performed on biopsied cells of early in vitro fertilized embryos to determine genetic attributes of the embryo.
Somatic cell nuclear transfer (SCNT).
Introduction of a somatic nucleus into an enucleated egg, resulting in the induction of pluripotent identity and generation of NT-ESCs.
Teratoma
A tumour comprising cells of all three embryonic germ layers.
Tumorigenicity
The competency of a cell to form a tumour.
Universal cells
Genetically modified cells designed to evade immune detection.
ITALIANO
I due principali tipi di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) sono le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), entrambe in grado di differenziarsi in vitro in cellule paragonabili a quelle derivanti da uno qualsiasi dei tre strati germinali embrionali.
In vivo, dopo il trapianto negli animali, queste cellule possono formare teratomi comprendenti varie linee cellulari o integrarsi come cellule funzionali in tessuti specifici.
Le PSC umane possono acquisire aberrazioni epigenetiche e genetiche, tipicamente in specifici punti caldi cromosomici ed in geni associati al cancro.
Le PSC umane hanno una vasta gamma di applicazioni legate allo studio dello sviluppo umano precoce, alla modellizzazione delle malattie ed alla medicina rigenerativa.
È ora possibile modellare più disturbi umani utilizzando cellule derivate da PSC umane e coltivate in monostrati, sferoidi o organoidi.
Queste colture cellulari vengono utilizzate per la scoperta di terapie applicando lo screening ad alto rendimento (HTS) o approcci farmacologici candidati.
Le cellule derivate da PSC umane sono anche in sperimentazione clinica come trattamenti per vari disturbi umani.
Derivazione di PSC umane
Le PSC umane possono essere derivate da più fonti.
Le ESC sono derivate da embrioni allo stadio di blastocisti, mentre le iPSC vengono riprogrammate da cellule somatiche, spesso inducendo l'espressione dei fattori di trascrizione OCT4, SOX2, KLF4 e MYC2.
Gli ESC uniparentali contengono solo genomi materni (partenogenetici) o paterni (androgenetici) e sono generati rispettivamente da uova non fecondate attivate artificialmente o mediante iniezione di uno spermatozoo in un uovo enucleato.
Queste cellule possono servire come fonte da cui derivare ESC aploidi che hanno un unico set di cromosomi.
Le cellule somatiche possono anche essere riprogrammate mediante trasferimento nucleare (NT) in uova enucleate.
Differenziazione delle PSC umane
Le PSC umane possono differenziarsi in cellule di tutti e tre gli strati germinali embrionali, il che è dimostrato in vitro dall'aggregazione in corpi embrioidi.
La differenziazione diretta verso tipi cellulari definiti si ottiene tramite l'aggiunta di fattori di crescita specifici o piccole molecole.
Le strutture auto-organizzate di un lignaggio specifico possono generare organoidi simili a organi funzionali.
L'iniezione di PSC umane indifferenziate in topi immunodeficienti provoca teratomi, mentre il trapianto di cellule differenziate immature in tessuti animali rilevanti può promuovere la maturazione funzionale di queste cellule in vivo.
Stabilità genomica delle PSC umane
La crescita prolungata in vitro può portare all'espansione selettiva delle PSC umane portatrici di determinate anomalie genetiche.
Grandi alterazioni genomiche compaiono prevalentemente come guadagni nelle regioni cromosomiche 1q, 12p, 17q, 20q e nel cromosoma X.
Sono state rilevate anche mutazioni puntiformi in geni correlati al tumore, principalmente nel gene soppressore tumorale TP53.
Anche le aberrazioni epigenetiche, come i cambiamenti nella metilazione del DNA, possono accumularsi, influenzando i geni associati all'imprinting genitoriale e al cancro.
Le anomalie che si presentano persisteranno dopo la differenziazione, con potenziali conseguenze pericolose per alcune applicazioni di PSC umane.
È quindi importante intraprendere una caratterizzazione dettagliata delle cellule coltivate in vitro per lunghi periodi di tempo, compresa la routine cariotipica delle cellule.
Alcuni approcci per migliorare la qualità delle PSC potrebbero includere l'uso di tecniche di derivazione alternative o migliori condizioni di crescita.
Sviluppo umano
In coltura, le PSC indifferenziate possono essere indotte a differenziarsi in cellule ectodermiche, mesodermiche ed endodermiche, imitando la differenziazione embrionale durante la gastrulazione.
Ulteriori specifiche possono essere indotte utilizzando piccole molecole, proteine o fattori di trascrizione in modo graduale che simula le normali traiettorie di sviluppo per guidare la differenziazione verso centinaia di tipi di cellule, simulando il processo di organogenesi.
Il confronto di questi processi tra varie specie può essere applicato per studiare l'evoluzione umana.
Pertanto, le PSC sono uno strumento prezioso per modellare lo sviluppo umano, per fasi altrimenti inaccessibili per la ricerca.
Modellazione della malattia e scoperta di farmaci
Una delle principali applicazioni della tecnologia PSC umana è nella modellazione di malattie umane che può essere ottenuta mediante tre possibili approcci: modifica genetica, per ricapitolare una mutazione associata a una malattia genetica; isolamento di ESC da blastocisti affette identificate da PGD; o tramite la generazione di iPSC dalle cellule somatiche dei pazienti.
La generazione di questi modelli fa progredire la nostra conoscenza delle basi molecolari e cellulari delle malattie e serve a identificare nuove terapie.
Questi modelli di malattia possono essere utilizzati anche per testare e scoprire farmaci, spesso da HTS, che migliorano i fenotipi patologici.
Inoltre, i disturbi infettivi possono essere studiati introducendo virus o batteri specifici nelle PSC o in colture da esse derivate, come gli organoidi.
Terapia cellulare
Le PSC umane svolgono già un ruolo nella medicina rigenerativa per disturbi come cecità, diabete e morbo di Parkinson.
Il trapianto di tipi cellulari differenziati derivati da PSC è in fase di sperimentazione sia in studi clinici preclinici su animali che su quelli umani.
Una delle principali misure di sicurezza è l'eliminazione delle cellule tumorigeniche indifferenziate prima del trapianto.
Ciò può essere potenzialmente ottenuto mediante protocolli di differenziazione e smistamento, con mezzi farmacologici o introducendo un "sistema di commutazione" che induce la morte cellulare.
Per evitare il rigetto immunitario, le cellule dei pazienti possono essere riprogrammate in iPSC, consentendo il trapianto autologo.
Nel trapianto allogenico, la necessità di un trattamento con farmaci immunosoppressori può essere evitata istituendo una banca di PSC corrispondenti a aplotipo HLA o la generazione di cellule universali, che sono progettate per eludere risposte immunitarie indesiderate.
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Glossario e abbreviazioni
Trapianto di cellule allogeniche
Una forma di terapia cellulare in cui le cellule di un donatore geneticamente distinto vengono utilizzate per il trapianto.
Cellule androgenetiche (a)
Cellule che trasportano solo un genoma paterno, generato dall'introduzione di spermatozoi in un uovo enucleato. Ad esempio, ESC androgenetiche (aESC).
Trapianto di cellule autologhe
Una forma di terapia cellulare in cui le cellule del paziente vengono utilizzate per il trapianto.
Blastocisti
Una struttura embrionale precoce formata nell'uomo 5 giorni dopo la fecondazione, comprendente una massa cellulare interna di cellule pluripotenti, uno strato esterno di cellule trofectodermiche ed una cavità di fluido blastocele.
Terapia cellulare
Un approccio per trattare le malattie umane trapiantando cellule funzionali nei pazienti.
Adattamento culturale
Alterazioni che si verificano in una popolazione di cellule durante la crescita prolungata in coltura, con conseguente aumento della forma fisica.
Differenziazione diretta
Differenziazione in vitro delle cellule verso un tipo di cellula specifico mediante condizioni di coltura definite.
Modellazione della malattia
Una strategia per studiare le malattie umane utilizzando cellule che presentano caratteristiche patologiche rilevanti.
Corpi embrioidi
Aggregati sferici di cellule staminali pluripotenti in fase di differenziazione spontanea nei tre strati germinali embrionali.
Cellule staminali embrionali (ESC).
Cellule staminali pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna di embrioni allo stadio di blastocisti.
Cellule aploidi
Cellule che trasportano un singolo set di cromosomi, a differenza delle cellule diploidi, che contengono due set di cromosomi.
Screening ad alta produttività (HTS).
Un metodo per valutare simultaneamente gli effetti biologici di un ampio insieme di composti chimici o alterazioni genetiche.
Antigene leucocitario umano (HLA).
Il principale complesso di istocompatibilità nell'uomo, che fa parte del sistema immunitario. Codifica molecole di superficie cellulare specializzate per presentare peptidi antigenici ai recettori delle cellule T.
Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
Cellule staminali pluripotenti derivate da cellule somatiche da una serie di fattori di riprogrammazione, ad esempio OCT4, SOX2, KLF4 e MYC (collettivamente denominati OSKM).
Organoidi
Strutture tridimensionali assemblate da cellule auto-organizzate che simulano un organo in vitro.
Cellule partenogenetiche (p)
Cellule che trasportano solo un genoma materno, stabilito dall'attivazione di un uovo non fecondato; per esempio, SC partenogenetici (pESC).
Cellule staminali pluripotenti (PSC).
Cellule in grado di rinnovarsi e differenziarsi indefinitamente in tutti e tre gli strati germinali embrionali.
Diagnosi genetica preimpianto (PGD).
Un test eseguito su cellule sottoposte a biopsia di embrioni precoci fecondati in vitro per determinare gli attributi genetici dell'embrione.
Trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT).
Introduzione di un nucleo somatico in un uovo enucleato, con conseguente induzione dell'identità pluripotente e generazione di NT-ESC.
Teratoma
Un tumore che comprende cellule di tutti e tre gli strati germinali embrionali.
Tumorigenicità
La capacità di una cellula di formare un tumore.
Cellule universali
Cellule geneticamente modificate progettate per eludere il rilevamento immunitario.
Da:
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