Alla scoperta di anticorpi con specificità epitopiche più ampie / Discovering Antibodies with Broader Epitope Specificities

Alla scoperta di anticorpi con specificità epitopiche più ampie / Discovering Antibodies with Broader Epitope Specificities

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

La specificità del legame anticorpo-antigene è alla base della versatilità degli anticorpi. Nei sistemi biologici, il legame anticorpo-antigene consente agli anticorpi di indirizzare gli agenti estranei per l'eliminazione innescando diversi meccanismi immunitari adattativi. In laboratorio, come strumenti per la scoperta, la specificità dell'anticorpo supporta un'ampia gamma di applicazioni, tra cui Western blot, ELISA, immunoprecipitazione e colorazione immunochimica (p. Es., Immunocitochimica e immunoistochimica). Nonostante la notevole specificità degli anticorpi, i ricercatori devono affrontare sfide diverse quando utilizzano questi reagenti in varie applicazioni.

Nozioni di base su anticorpi, antigeni, epitopo

Gli anticorpi sono generati dalle cellule B come parte della risposta immunitaria adattativa coinvolta nell'identificazione e nell'eliminazione di agenti estranei come agenti patogeni infettivi. Gli anticorpi solubili secreti dai linfociti B sono dotati di specificità uniche, per lo più determinate dalle sequenze di amminoacidi e dai motivi che formano i loro domini di legame all'antigene o regioni determinanti complementari (CDR) (Janeway et al.2001, Sela-Culang et al.2013). Pertanto, la specificità delle interazioni anticorpo-antigene è modellata da contatti unici paratopo-epitopo. Gli epitopi possono essere definiti come le regioni immunogeniche o antigeniche di una proteina. In poche parole, un epitopo è formato dalle sequenze amminoacidiche, dai domini o dai motivi di un antigene che interagiscono direttamente con il sito di legame o il paratopo di un anticorpo.

Una singola proteina può essere riconosciuta da una serie di tipi di anticorpi, ognuno dei quali può legare epitopi unici. Chimicamente, le interazioni tra epitopo e paratopi che supportano il legame antigene-anticorpo non sono covalenti e coinvolgono invece una serie di forze più deboli ( Qaraghuli et al.2020).

Sfide tecniche dei saggi basati sugli anticorpi

Non c'è dubbio che gli anticorpi siano strumenti indispensabili per la scoperta in laboratorio. Tuttavia, i ricercatori potrebbero incontrare diverse sfide nel processo di ottimizzazione del loro utilizzo in applicazioni come ELISA, Western blot e immunocolorazione di cellule o tessuti. Ad esempio, i ricercatori spesso scoprono che il legame degli anticorpi è suscettibile alle condizioni del dosaggio. In tal modo, un anticorpo può legarsi specificamente al suo antigene in un saggio Western blot ma non riesce a rilevare la sua proteina bersaglio in situ tramite IHC o ICC, una volta che le proteine ​​sono state esposte a fissativi (Uhlen et al.2016). In generale, la colpa è dei cambiamenti conformazionali, poiché spesso portano al mascheramento degli epitopi (Saper, 2008).

Un chiaro vantaggio del sandwich ELISA risiede nella sua specificità e sensibilità, conferite da due anticorpi. Pertanto, gli ELISA sandwich sono adatti per analizzare le concentrazioni di antigeni in campioni biologici grezzi comunemente usati nella diagnostica.

Un'altra sfida può essere rappresentata dalle applicazioni che richiedono anticorpi per riconoscere più epitopi su un singolo antigene. In ELISA sandwich “cattura” e anticorpi “rilevamento” vengono utilizzati per rilevare specificamente un antigene entro condizioni greggio tipiche di campioni biologici complessi come urina e siero. A tal fine, i ricercatori potrebbero dover eseguire una risoluzione dei problemi approfondita per identificare una " coppia di anticorpi " cattura-rilevamento ottimale . Le sfide principali da superare in questo tipo di analisi sono garantire che le coppie di anticorpi non siano reattive crociate e che l'accesso degli anticorpi a ciascun epitopo non sia ostacolato. Spesso, gli sforzi di ottimizzazione dei ricercatori sono complicati dalla disponibilità di anticorpi sul mercato.

Infine, sebbene gli anticorpi siano reagenti altamente specifici, si verificano frequentemente problemi di reattività inattesa o legame fuori bersaglio. In tal modo è diventato sempre più chiaro che i ricercatori devono convalidare ampiamente i reagenti anticorpali per garantire specificità e riproducibilità (Uhlen et al.2016). Una strategia di convalida raccomandata dall'International Working Group for Antibody Validation (IWGAV) consiste nell'uso di anticorpi indipendenti. Questa strategia propone, "Utilizzare due o più anticorpi indipendenti che riconoscono epitopi diversi sulla proteina bersaglio e confermano la specificità tramite analisi comparative e quantitative" come metodo di convalida.

Alla scoperta di un più ampio repertorio di anticorpi

I flussi di lavoro di scoperta che offrono maggiori opportunità per identificare un'ampia gamma di anticorpi con specificità uniche sono desiderabili e forniscono un vantaggio durante lo sviluppo e la convalida di saggi analitici e diagnostici, inclusi i protocolli ELISA sandwich, Western blot e immunocolorazione. Mentre la tecnologia degli ibridomi è stata lo standard negli sforzi per la scoperta di anticorpi monoclonali, i processi di immortalizzazione portano inevitabilmente alla perdita di cloni che producono anticorpi. Il tasso di sopravvivenza stimato per le cellule B in fase di fusione è, in media, 1/5000 (Winters et al.2019). Al contrario, poiché le strategie di scoperta di anticorpi basate sulla clonazione delle cellule B aggirano la necessità di immortalizzazione, questa tecnologia offre ai ricercatori maggiori opportunità di vagliare un numero maggiore ed una diversità di cellule che producono anticorpi.

Date le sfide che i ricercatori devono affrontare con l'ottimizzazione del dosaggio, le tecnologie che massimizzano la scoperta di un ampio repertorio di anticorpi antigene-specifici forniscono un vantaggio reale nel trovare i migliori reagenti per un'ampia gamma di applicazioni.

ENGLISH

The specificity of antibody-antigen binding underlies the versatility of antibodies. In biological systems, antibody-antigen binding enables antibodies to target foreign agents for elimination by triggering several adaptive immune mechanisms. In the lab, as tools for discovery, antibody specificity supports a broad range of applications, including Western blot, ELISA, immunoprecipitation, and immunochemical staining (e.g., immunocytochemistry and immunohistochemistry). Albeit the remarkable specificity of antibodies, investigators face different challenges when utilizing these reagents in various applications.

Antibody, Antigen, Epitope Basics

Antibodies are generated by B cells as part of the adaptive immune response involved in identifying and eliminating foreign agents such as infectious pathogens. Soluble antibodies secreted by B cells are endowed with unique specificities, mostly determined by the amino acid sequences and motifs forming their antigen-binding domains or complementary determining regions (CDRs) (Janeway et al. 2001, Sela-Culang et al. 2013). Therefore, the specificity of antibody-antigen interactions is shaped by unique paratope-epitope contacts. Epitopes may be defined as the immunogenic or antigenic regions of a protein. Simply put, an epitope is formed by the amino acid sequences, domains, or motifs of an antigen that directly interact with an antibody’s binding site or paratope.

A single protein may be recognized by a range of antibody types, each of which may bind unique epitopes. Chemically, the interactions between epitope and paratopes supporting antigen-antibody binding are non-covalent and instead involve a series of weaker forces (Qaraghuli et al. 2020).

Technical Challenges of Antibody-Based Assays

There is no doubt that antibodies are indispensable tools for discovery in the lab. Yet, investigators may encounter several challenges in the process of optimizing their use across applications such as ELISA, Western blot, and cell or tissue immunostaining. For example, investigators often find that antibody binding is susceptible to the assay’s conditions. Thereby, an antibody may specifically bind to its antigen in a Western blot assay but fail to detect its target protein in situ through IHC or ICC, once proteins have been exposed to fixatives (Uhlen et al. 2016). Generally, conformational changes are to blame, as they frequently lead to epitope masking (Saper, 2008).

A definite advantage of the sandwich ELISA lies in its specificity and sensitivity, conferred by two antibodies. Therefore, sandwich ELISAs are suitable for analyzing antigen concentrations in crude biological samples commonly used in diagnostics.

Another challenge may be presented by applications needing antibodies to recognize multiple epitopes on a single antigen. In sandwich ELISA, “capture” and “detection” antibodies are used to specifically detect an antigen within crude conditions typical of complex biological samples such as urine and serum. To this end, investigators may need to do extensive troubleshooting to identify an optimal capture-detection “antibody pair.”  The main challenges to overcome in this type of assay are ensuring that antibody pairs are not cross-reactive and that antibody-access to each epitope is unhindered. Often, investigators’ optimization efforts are complicated by antibody availability in the market.

Lastly, although antibodies are highly specific reagents, problems with unexpected reactivity or off-target binding frequently occur. Thereby it has become increasingly clear that investigators must extensively validate antibody reagents to ensure specificity and reproducibility (Uhlen et al. 2016). A recommended validation strategy by the International Working Group for Antibody Validation (IWGAV) consists of the use of independent antibodies. This strategy proposes, “Use two or more independent antibodies that recognize different epitopes on the target protein and confirm specificity via comparative and quantitative analyses” as a validation method.

Uncovering a Broader Antibody Repertoire

Discovery workflows providing more opportunities to identify a broad range of antibodies with unique specificities are desirable and provide an edge when developing and validating analytical and diagnostic assays, including sandwich ELISA, Western blot, and immunostaining protocols. While hybridoma technology has been the standard in monoclonal antibody discovery efforts, immortalization processes unavoidably result in the loss of antibody-producing clones. The estimated survival rate for B cells undergoing fusion is, on average, 1/5000 (Winters et al. 2019). In contrast, because antibody discovery strategies based on B cell cloning bypass the need for immortalization, this technology provides investigators more opportunities to screen a greater number and diversity of antibody-producing cells.

Given the challenges that investigators confront with assay optimization, technologies that maximize discovering a broad repertoire of antigen-specific antibodies provide a real advantage in finding the best reagents for a wide range of applications.

Da:

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