Highly Sensitive Methylation Detection Using Enzymatic Methyl-seq and Twist Target Enrichment / Rilevamento della metilazione altamente sensibile utilizzando metil-seq enzimatico ed arricchimento del target di torsione.

 Highly Sensitive Methylation Detection Using Enzymatic Methyl-seq and Twist Target Enrichment / Rilevamento della metilazione altamente sensibile utilizzando metil-seq enzimatico ed arricchimento del target di torsione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Methylation Conversion. Methylation sequencing involves enzymatic or chemical methods of converting unmethylated cytosines to uracil through deamination, while leaving methylated cytosines intact. During amplification, uracil is paired with adenine on the complementary strand, leading to the inclusion of thymine in the original position of the unmethylated cytosine. The end product is asymmetric, yielding two different double stranded DNA molecules after conversion (top row); the same process for methylated DNA leads to yet additional sets of sequences (bottom row).  / Conversione di metilazione. Il sequenziamento della metilazione implica metodi enzimatici o chimici per convertire le citosine non metilate in uracile attraverso la deaminazione, lasciando intatte le citosine metilate. Durante l'amplificazione, l'uracile è associato all'adenina sul filamento complementare, portando all'inclusione della timina nella posizione originale della citosina non metilata. Il prodotto finale è asimmetrico, producendo due diverse molecole di DNA a doppio filamento dopo la conversione (riga in alto); lo stesso processo per il DNA metilato porta a ulteriori serie di sequenze (riga in basso).

Library preparation for methylation detection consists of 6 key steps. /  La preparazione della libreria per il rilevamento della metilazione consiste in 6 passaggi chiave.

INTRODUCTION

 DNA methylation plays an important role in cell growth by regulating gene expression.

 In some cases, aberrant cytosine methylation can lead to carcinogenic changes in gene expression.

 Historically, these modifications have been hard to identify in patient samples. 

Although next-generation sequencing (NGS) of DNA treated with sodium bisulfite has provided an efficient means for the detection of methylated cytosines, the chemical conversion process is damaging, leading to GC biased coverage and poor complexity.

Such protocols are therefore limited in their sensitivity. 

The Twist Targeted Methylation Workflow introduces a complete solution that produces highly complex and uniform libraries for methylome analysis in a variety of settings, including novel ones like cancer screening by liquid biopsy.

 The end-to-end protocol achieves this by combining an innovative, enzymatic conversion process with a highly compatible and quick hybrid capture process using Twist Custom Methylation Panels. 

This technical note highlights the benefits of this workflow over existing protocols, discusses the use of controls throughout the workflow, and demonstrates the effects of panel target size and genomic DNA methylation level on downstream sequencing metrics. 

RESULTS

 Library Preparation for Methylation Detection Conventional protocols identify methylated cytosine residues by chemically converting unmethylated cytosines to uracils with bisulfite treatment. 

After PCR, unmethylated cytosines are sequenced as thymines, and methylated cytosines are sequenced as cytosines (Figure 1). 

However, bisulfite treatment often leads to DNA breaks that can complicate downstream sample preparation and, ultimately, methylation detection.

Twist Bioscience® partnered with New England Biolabs® to offer NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EMseqTM) as part of the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow.

This innovative process accomplishes the same conversion results as bisulfite treatment without the harshness of chemical conversion, yielding a superior end result.

The enzymatic and bisulfite methods convert unmethylated cytosines to thymines with similar efficiency.

 However, enzymatically converted libraries show increased and more uniform coverage in high GC regions, this is potentially a result of fewer DNA breaks at these sites. 

The Twist Methylation System offers flexibility in fragment size by utilizing mechanical shearing before library preparation and enzymatic conversion. 

When using this library preparation method for methylation detection, Twist Bioscience recommends shearing genomic material to approximately 200 to 300 bp to generate final fragment sizes ranging between 350 bp and 450 bp, although the actual fragment size will depend on the initial integrity of input material. 

Library yield depends on the amount of input material and the number of PCR amplification cycles used during library preparation. 

Twist Bioscience recommends starting with 200 ng input material and nine amplification cycles. 

These recommendations ensure enough material is available for subsequent hybrid capture. 

The final quality control step confirms the fragment length distribution. 

Use of the Control DNAs in the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow Incomplete conversion increases the false positive rate of the assay, as unconverted, unmethylated cytosines are interpreted erroneously as methylated. 

To mitigate this, the conversion rate can be confirmed using DNA controls of known methylation levels.

 As part of the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow, the NEB EM-seq Methylation Library Preparation Kit includes CpG Methylated pUC19 DNA and Unmethylated Lambda DNA as optional controls.

 Both controls possess known levels of methylation, enabling an accurate determination of the conversion rate post-sequencing.

 Because they may lack complementary probes in target enrichment panels, these controls should not be subjected to hybrid capture. 

Instead, they should be stored until after hybrid capture and subsequently pooled with samples for sequencing. 

To demonstrate the use of these controls in the Twist workflow, libraries were generated using the protocol described in Appendix A of the NEBNext EM-seq Methylation Library Preparation Protocol.

 Forty-eight microliters of each DNA control were combined together in a single reaction, and the mix was dried down using a speed vacuum concentrator.

 The resulting dried DNA was resuspended in 50 µl of 0.1X TE pH 8.0 and moved through the library process. 

EM-seq met the expected efficiency at higher than 99.5% conversion for both controls. 

The expected CpG methylation levels of the Unmethylated Lambda DNA and CpG Methylated pUC19 DNA controls are 0.5% and 95– 98%, respectively. 

The measured CpG methylation levels matched the expected levels; in the methylated control, 166 out of 177 CpG sites were methylated. 

These data indicate that DNA controls of known methylation levels can be used to ensure that the conversion process is complete and the assay’s false positive minimized. 

Twist recommends using these controls when unsure about the enzymatic conversion efficiency during the EM-seq workflow. 

For every 96-reaction kit, there is enough of each control to make two separate control libraries.

 Twist Target Enrichment for Methylation Detection The Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow also uses the Twist Fast Hybridization Target Enrichment System to achieve highly sensitive and customized methylation detection. 

This system reaches hybridization equilibrium without adversely impacting sequencing metrics despite its use of a faster hybridization time than the previous Twist workflow, arriving at hybridization equilibrium with no detriment in metrics despite decreased hybridization time. 

Twist recommends using these controls when unsure about the enzymatic conversion efficiency during the EM-seq workflow. 

For every 96-reaction kit, there is enough of each control to make two separate control libraries. 

Twist Target Enrichment for Methylation Detection The Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow also uses the Twist Fast Hybridization Target Enrichment System to achieve highly sensitive and customized methylation detection. 

This system reaches hybridization equilibrium without adversely impacting sequencing metrics despite its use of a faster hybridization time than the previous Twist workflow, arriving at hybridization equilibrium with no detriment in metrics despite decreased hybridization time. 

This system enables multiplexing (up to 8-plex) for higher throughput and reduced hands-on time and pipette use.

 The Twist Targeted Methylation Sequencing Protocol recommends best practices that are compatible with a variety of custom methylation panels.

 However, as with all target capture systems, multiple factors can influence the final capture data quality, including the size and methylation level of the target region. 

The impact of these factors on downstream sequencing metrics is discussed below. 

Target Region Size Many factors related to custom target regions influence the final targeted sequencing metrics; optimization may be needed for best performance. 

For example, very small panel designs (<0.5 Mb) or panels with high GC content in the target region, are particularly sensitive to small changes in panel design.

 The optimal trade-off between inclusiveness and off-target control depends on characteristics of the target region and the panel’s intended application. 

During the panel design process for example, a researcher working with a medium sized panel and a low number of samples may prefer to keep certain probes, even if they require additional sequencing to balance increased off-target capture. 

By contrast, those working with a much smaller panel (where offtarget capture increases the required sequencing relative to rest of the panel more quickly) or with very large numbers of samples (where modest increases in cost can quickly add up), may prefer to use more stringent design conditions to optimize cost. 

To evaluate the relationship between panel size and sequencing metrics, three different panels were used with the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow.

 Together, the panels spanned a wide range of methylation targets and panel sizes: 0.5 Mb, 3 Mb, and 50 Mb. 

The largest panel used in this study gave off-target levels close to 7%, with all panels registering off-target levels under 10%.

 Capture uniformity (fold-80 base penalty) was exceptional for all target sizes, reaching values between 1.4 and 1.7.

 The proportion of probes with 30X coverage was higher than 90% for all panels.

 However, the increase in duplication rate with panel size warrants consideration when defining what key metrics to prioritize.

 Identification of differing Target Region Methylation Level Methylation levels differ across the genome.

 Because differential methylation levels can be used for early detection of specific cancers, it is vitally important that the protocols used to detect methylation are highly compatible with custom panel designs and are capable of identifying hyper- and hypomethylated regions.

 Conversion leads to a decrease in sequence complexity, which can cause issues downstream in the hybrid capture step. 

However, these issues can be mitigated with the right combination of library preparation reagents, hybrid capture reagents, and custom panel design, resulting in probe coverage that is evenly distributed across regions with varying AT/GC content and methylation levels.

 Twist Custom Panels for targeted methyl-seq are built with 4 probe species per target to optimally capture the methylated and unmethylated forms of both the sense and antisense DNA after conversion (See Figure 1, right side).

 To demonstrate the evenness of coverage that can be obtained with the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow, probe coverage plots were generated using a 1.5 Mb custom panel with hyper- and hypomethylated genomic DNA input material using two different conversion systems: EM-seq and bisulfite treatment.

By contrast, an industry-leading bisulfite conversion process (grey) resulted in comparatively uneven target read counts. 

Thus, Twist custom panel design efficiently captures all targeted DNA species —regardless of target methylation level—when used with the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow. 

To look more closely at the performance of Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow across a wide range of methylation levels, libraries of varying methylation levels were generated and captured using a 1 Mb panel. 

These libraries were produced by mixing hypo- and hypermethylated control human cell lines (EpiScope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA PN# 3521 and EpiScope Methylated HCT116 gDNA PN# 3522, Takara Bio USA) to create libraries with 0, 25, 50, 75, and 100% methylation. 

These data demonstrate the compatibility of the Twist Methylation System with both hypo- and hypermethylated DNA regions.

 CONCLUSION 

Twist Bioscience now provides an end-to-end, targeted methylation detection workflow that combines an enzymatic conversion from NEB, with custom methylation panels and optimized target enrichment reagents. 

Overall, the Twist Targeted Methylation Sequencing Workflow enables highly sensitive methylation detection that can be optimized as needed to accommodate time constraints or reduce hands-on time.

 With this workflow, both the target size of custom panel designs and the level of methylation have little to no impact on final Picard metrics. 

Thus, this system is suitable for a wide variety of researchers interested in methylation detection.

ITALIANO

INTRODUZIONE

 La metilazione del DNA svolge un ruolo importante nella crescita cellulare regolando l'espressione genica.

 In alcuni casi, la metilazione aberrante della citosina può portare a cambiamenti cancerogeni nell'espressione genica.

 Storicamente, queste modifiche sono state difficili da identificare nei campioni dei pazienti.

Sebbene il sequenziamento di nuova generazione (NGS) del DNA trattato con bisolfito di sodio abbia fornito un mezzo efficiente per il rilevamento delle citosine metilate, il processo di conversione chimica è dannoso, portando a una copertura distorta del GC ed ad una scarsa complessità.

Tali protocolli sono quindi limitati nella loro sensibilità.

Il flusso di lavoro di metilazione mirato a Twist introduce una soluzione completa che produce librerie altamente complesse ed uniformi per l'analisi del metiloma in una varietà di impostazioni, comprese quelle nuove come lo screening del cancro mediante biopsia liquida.

 Il protocollo end-to-end raggiunge questo obiettivo combinando un innovativo processo di conversione enzimatica con un processo di acquisizione ibrido altamente compatibile e rapido utilizzando i pannelli di metilazione personalizzati Twist.

Questa nota tecnica evidenzia i vantaggi di questo flusso di lavoro rispetto ai protocolli esistenti, discute l'uso dei controlli in tutto il flusso di lavoro e dimostra gli effetti della dimensione del target del pannello e del livello di metilazione del DNA genomico sulle metriche di sequenziamento a valle.

RISULTATI

 Preparazione della libreria per il rilevamento della metilazione.

 I protocolli convenzionali identificano i residui di citosina metilata convertendo chimicamente le citosine non metilate in uracili con il trattamento con bisolfito.

Dopo la PCR, le citosine non metilate vengono sequenziate come timine e le citosine metilate vengono sequenziate come citosine (Figura 1).

Tuttavia, il trattamento con bisolfito spesso porta a rotture del DNA che possono complicare la preparazione del campione a valle e, in definitiva, il rilevamento della metilazione.

Twist Bioscience® ha collaborato con New England Biolabs® per offrire NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EMseqTM) come parte del flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirata a Twist.

Questo processo innovativo ottiene gli stessi risultati di conversione del trattamento con bisolfito senza la durezza della conversione chimica, ottenendo un risultato finale superiore.

I metodi enzimatici e bisolfiti convertono le citosine non metilate in timine con un'efficienza simile.

 Tuttavia, le librerie convertite enzimaticamente mostrano una copertura maggiore e più uniforme nelle regioni ad alto GC, questo è potenzialmente il risultato di un minor numero di rotture del DNA in questi siti.

Il sistema di metilazione della torsione offre flessibilità nella dimensione dei frammenti utilizzando il taglio meccanico prima della preparazione della libreria e della conversione enzimatica.

Quando si utilizza questo metodo di preparazione della libreria per il rilevamento della metilazione, Twist Bioscience consiglia di tagliare il materiale genomico a circa 200-300 bp per generare dimensioni dei frammenti finali comprese tra 350 bp e 450 bp, sebbene la dimensione effettiva del frammento dipenderà dall'integrità iniziale del materiale in ingresso.

La resa della libreria dipende dalla quantità di materiale in ingresso e dal numero di cicli di amplificazione PCR utilizzati durante la preparazione della libreria.

Twist Bioscience consiglia di iniziare con 200 ng di materiale in ingresso e nove cicli di amplificazione.

Queste raccomandazioni assicurano che sia disponibile materiale sufficiente per la successiva cattura ibrida.

La fase finale del controllo di qualità conferma la distribuzione della lunghezza del frammento.

Uso dei DNA di controllo nel flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato a Twist.

 La conversione incompleta aumenta il tasso di falsi positivi del test, poiché le citosine non convertite e non metilate vengono interpretate erroneamente come metilate.

Per mitigare ciò, il tasso di conversione può essere confermato utilizzando controlli del DNA di livelli di metilazione noti.

 Come parte del flusso di lavoro del sequenziamento della metilazione mirato a torsione, il kit di preparazione della libreria di metilazione EM-seq NEB include DNA pUC19 metilato CpG e DNA Lambda non metilato come controlli opzionali.

 Entrambi i controlli possiedono livelli noti di metilazione, consentendo una determinazione accurata del tasso di conversione post-sequenziamento.

 Poiché potrebbero mancare di sonde complementari nei pannelli di arricchimento target, questi controlli non dovrebbero essere sottoposti a cattura ibrida.

Invece, dovrebbero essere conservati fino a dopo la cattura ibrida e successivamente riuniti con i campioni per il sequenziamento.

Per dimostrare l'uso di questi controlli nel flusso di lavoro Twist, le librerie sono state generate utilizzando il protocollo descritto nell'Appendice A del protocollo di preparazione della libreria di metilazione NEBNext EM-seq.

 Quarantotto microlitri di ciascun controllo di DNA sono stati combinati insieme in una singola reazione e la miscela è stata essiccata utilizzando un concentratore a vuoto veloce.

 Il DNA essiccato risultante è stato risospeso in 50 µl di 0,1X TE pH 8,0 e spostato attraverso il processo della libreria.

EM-seq ha raggiunto l'efficienza prevista con una conversione superiore al 99,5% per entrambi i controlli.

I livelli di metilazione CpG previsti dei controlli DNA Lambda non metilato e DNA pUC19 metilato CpG sono rispettivamente 0,5% e 95-98%.

I livelli di metilazione CpG misurati corrispondevano ai livelli previsti; nel controllo metilato, 166 su 177 siti CpG erano metilati.

Questi dati indicano che i controlli del DNA dei livelli di metilazione noti possono essere utilizzati per garantire che il processo di conversione sia completo e che i falsi positivi del test siano ridotti al minimo.

Twist consiglia di utilizzare questi controlli quando non si è sicuri dell'efficienza di conversione enzimatica durante il flusso di lavoro EM-seq.

Per ogni kit da 96 reazioni, ogni controllo è sufficiente per creare due librerie di controlli separate.

 Twist Target Enrichment per il rilevamento della metilazione.

 Il flusso di lavoro Twist Targeted Methylation Sequencing utilizza anche il Twist Fast Hybridization Target Enrichment System per ottenere un rilevamento della metilazione altamente sensibile e personalizzato.

Questo sistema raggiunge l'equilibrio di ibridazione senza influire negativamente sulle metriche di sequenziamento nonostante l'utilizzo di un tempo di ibridazione più rapido rispetto al precedente flusso di lavoro Twist, arrivando all'equilibrio di ibridazione senza alcun danno nelle metriche nonostante il tempo di ibridazione ridotto.

Twist consiglia di utilizzare questi controlli quando non si è sicuri dell'efficienza di conversione enzimatica durante il flusso di lavoro EM-seq.

Per ogni kit da 96 reazioni, ogni controllo è sufficiente per creare due librerie di controlli separate.

Arricchimento del target di torsione per il rilevamento della metilazione.

 Il flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato a torsione utilizza anche il sistema di arricchimento del bersaglio di ibridazione rapida Twist per ottenere un rilevamento della metilazione altamente sensibile e personalizzato.

Questo sistema raggiunge l'equilibrio di ibridazione senza influire negativamente sulle metriche di sequenziamento nonostante l'utilizzo di un tempo di ibridazione più rapido rispetto al precedente flusso di lavoro Twist, arrivando all'equilibrio di ibridazione senza alcun danno nelle metriche nonostante il tempo di ibridazione ridotto.

Questo sistema consente il multiplexing (fino a 8 plex) per una maggiore produttività e una riduzione dei tempi manuali e dell'uso delle pipette.

 Il Twist Targeted Methylation Sequencing Protocol raccomanda le migliori pratiche compatibili con una varietà di pannelli di metilazione personalizzati.

 Tuttavia, come con tutti i sistemi di acquisizione del bersaglio, molteplici fattori possono influenzare la qualità dei dati di acquisizione finale, inclusa la dimensione ed il livello di metilazione della regione di destinazione.

L'impatto di questi fattori sulle metriche di sequenziamento a valle è discusso di seguito.

Dimensione della regione di destinazione.

 Molti fattori relativi alle regioni di destinazione personalizzate influenzano le metriche di sequenza di destinazione finali; potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione per ottenere le migliori prestazioni.

Ad esempio, progetto di pannelli molto piccoli (<0,5 Mb) o pannelli con un alto contenuto di GC nella regione target, sono particolarmente sensibili a piccoli cambiamenti nel progetto del pannello.

 Il compromesso ottimale tra inclusività e controllo fuori obiettivo dipende dalle caratteristiche della regione target e dall'applicazione prevista del panel.

Durante il processo di progettazione del pannello, ad esempio, un ricercatore che lavora con un pannello di medie dimensioni ed un numero ridotto di campioni potrebbe preferire mantenere determinate sonde, anche se richiedono un ulteriore sequenziamento per bilanciare una maggiore cattura fuori bersaglio.

Al contrario, coloro che lavorano con un pannello molto più piccolo (dove l'acquisizione fuori bersaglio aumenta il sequenziamento richiesto rispetto al resto del pannello più rapidamente) o con un numero molto elevato di campioni (dove si possono sommare rapidamente aumenti di costo modesti), potrebbe preferire utilizzare condizioni di progettazione più rigorose per ottimizzare i costi.

Per valutare la relazione tra la dimensione del pannello e le metriche di sequenziamento, sono stati utilizzati tre diversi pannelli con il flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato a Twist.

 Insieme, i pannelli coprivano un'ampia gamma di obiettivi di metilazione e dimensioni del pannello: 0,5 Mb, 3 Mb e 50 Mb.

Il panel più grande utilizzato in questo studio ha fornito livelli fuori target vicini al 7%, con tutti i panel che hanno registrato livelli fuori target inferiori al 10%.

 L'uniformità di cattura (penalità di base di 80 volte) è stata eccezionale per tutte le dimensioni target, raggiungendo valori compresi tra 1,4 e 1,7.

 La proporzione di sonde con copertura 30X è stata superiore al 90% per tutti i pannelli.

 Tuttavia, l'aumento del tasso di duplicazione con le dimensioni del pannello merita di essere preso in considerazione quando si definiscono le metriche chiave a cui dare la priorità.

 Identificazione di diversi livelli di metilazione della regione obiettivo. 

 I livelli di metilazione differiscono nel genoma.

 Poiché i livelli di metilazione differenziali possono essere utilizzati per la diagnosi precoce di tumori specifici, è di vitale importanza che i protocolli utilizzati per rilevare la metilazione siano altamente compatibili con i design dei pannelli personalizzati e siano in grado di identificare le regioni iper e ipometilate.

 La conversione porta a una diminuzione della complessità della sequenza, che può causare problemi a valle nella fase di acquisizione ibrida.

Tuttavia, questi problemi possono essere mitigati con la giusta combinazione di reagenti per la preparazione della libreria, reagenti di cattura ibridi e progetto del pannello personalizzato, con conseguente copertura della sonda distribuita uniformemente tra le regioni con contenuto di AT/GC e livelli di metilazione variabili.

 I pannelli Twist Custom per il metil-seq mirato sono costruiti con 4 specie di sonde per bersaglio per catturare in modo ottimale le forme metilate e non metilate del DNA senso e antisenso dopo la conversione (vedi Figura 1, lato destro).

Per dimostrare l'uniformità della copertura che può essere ottenuta con il flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirata a torsione, i grafici di copertura della sonda sono stati generati utilizzando un pannello personalizzato da 1,5 Mb con materiale di input di DNA genomico iper e ipometilato utilizzando due diversi sistemi di conversione: EM-seq e trattamento con bisolfito .

Al contrario, un processo di conversione del bisolfito leader del settore (grigio) ha portato a conteggi di letture target relativamente irregolari.

Pertanto, il progetto del pannello personalizzato Twist cattura in modo efficiente tutte le specie di DNA mirate, indipendentemente dal livello di metilazione target, quando viene utilizzato con il flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato Twist.

Per esaminare più da vicino le prestazioni del flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato a Twist attraverso un'ampia gamma di livelli di metilazione, sono state generate e acquisite librerie di diversi livelli di metilazione utilizzando un pannello da 1 Mb.

Queste librerie sono state prodotte mescolando linee cellulari umane di controllo ipo e ipermetilate (EpiScope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA PN# 3521 e EpiScope Methylated HCT116 gDNA PN# 3522, Takara Bio USA) per creare librerie con 0, 25, 50, 75 e 100% di metilazione.

Questi dati dimostrano la compatibilità del Twist Metilation System con entrambe le regioni di DNA ipo e ipermetilato.

 CONCLUSIONE

Twist Bioscience ora fornisce un flusso di lavoro di rilevamento della metilazione mirato end-to-end che combina una conversione enzimatica da NEB, con pannelli di metilazione personalizzati e reagenti di arricchimento target ottimizzati.

Nel complesso, il flusso di lavoro di sequenziamento della metilazione mirato a Twist consente un rilevamento della metilazione altamente sensibile che può essere ottimizzato in base alle esigenze per soddisfare i vincoli di tempo o ridurre il tempo pratico.

 Con questo flusso di lavoro, sia la dimensione target dei progetti di pannelli personalizzati che il livello di metilazione hanno un impatto minimo o nullo sulle metriche Picard finali.

Pertanto, questo sistema è adatto a un'ampia varietà di ricercatori interessati al rilevamento della metilazione.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Twist%20Bio/May%202021/TechNote_NGS_HighlySensitiveMethylationDetectionUsingEnzymaticMethyl-seqandTwistTE_23FEB21_Rev1.0.pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1622335921752.1622465823934.113&__hssc=8807082.1.1622465823934&__hsfp=2281083568&hsCtaTracking=c10e1a10-4de3-4e5a-9846-50375af5d65c%7Cde96f0b0-4304-4838-b7c5-7362c0f4cb82