IL TEST DI AMES CHE COS'E'? E COME SI SVOLGE? / THE AMES TEST WHAT IS IT? AND HOW DOES IT WORK?

 IL TEST DI AMES CHE COS'E'? E COME SI SVOLGE? / THE AMES TEST WHAT IS IT? AND HOW DOES IT WORK?

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Principio del test

Il principio del test si basa sulla valutazione della capacità di un sospetto mutageno di provocare la reversione di un carattere auxotrofo his- in un ceppo di batteri mutato (Salmonella typhimurium), rendendolo nuovamente capace di sopravvivere in un terreno privo di istidina. La maggior parte dei ceppi di Salmonella utilizzati nel test presentano anche altre mutazioni che alterano la permeabilità della parete (rfa-, elimina la catena polisaccaridica dei lipopolisaccaridi di membrana), consentendo l'ingresso nel batterio di mutageni anche di grosse dimensioni, o eliminano l'azione dei meccanismi di riparo del DNA (ΔuvrB, delezione del gene uvrB), permettendo in tal modo il mantenimento delle mutazioni ottenute. Poiché l'assenza di meccanismi di riparo rende complessa la crescita del batterio, in molti casi si introduce nel ceppo il plasmide pKM101, contenente i geni per il sistema di riparo SOS del DNA, incline a commettere errori durante la riparazione. Un'ulteriore mutazione presente in alcuni ceppi abitualmente utilizzati è la delezione di un gene coinvolto nella biosintesi della biotina (Δbio), che rende impossibile la sopravvivenza del batterio in terreni che ne siano privi; ciò consente di identificare eventuali contaminazioni del risultato finale sulla piastra (i batteri revertanti ottenuti dovranno risultare auxotrofi per la biotina).

Procedura sperimentale

Il test viene effettuato piastrando i batteri su un terreno solido di agar contenente una minima quantità di istidina, e ponendo al centro della piastra un disco contenente la sostanza in esame, che può in questo modo diffondersi nel terreno di coltura. La presenza delle tracce di amminoacido nel terreno permette di individuare mutazioni che richiedano più cicli di duplicazione cellulare per manifestarsi fenotipicamente, come nel caso di mutazioni puntiformi su una singola elica di DNA. La frequenza delle mutazioni ottenute viene valutata in base alla distanza dal disco dopo 48 ore di crescita, in rapporto a una piastra di controllo in cui i batteri sono stati fatti crescere sullo stesso terreno, ma in assenza del sospetto mutageno; il raffronto delle due piastre consente di eliminare dal risultato del test l'effetto dovuto alla presenza di revertanti spontanei. Il test per una sostanza viene sempre condotto in parallelo su differenti ceppi di Salmonella, in cui l'auxotrofia è dovuta a differenti tipi di mutazioni (mutazioni puntiformi di diverso tipo, o mutazioni di frameshift come inserzioni o delezioni) per individuare il tipo di effetto causato al DNA.

Limiti del test

Il limite principale del test, così descritto, è l'impossibilità di valutare l'effetto genotossico indiretto, ovvero di sostanze che non presentano direttamente un proprio effetto mutageno, ma diventano tossiche a seguito del metabolismo subito negli organismi superiori, come nel caso dell'alcol etilico, il cui effetto richiede la formazione del suo metabolita acetaldeide. Per superare questo problema, possono essere utilizzati protocolli differenti del test, che prevedano la presenza nel terreno di coltura degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici, che possono attivare l'effetto genotossico del promutageno. In questo caso la sostanza da esaminare viene aggiunta direttamente al terreno di coltura. Un altro meccanismo indiretto di genotossicità non rilevato dal test è quello che prevede un'azione mediata dal sistema infiammatorio o da virus, come succede nel caso dell'amianto.

Essendo condotto in cellule batteriche, il test di Ames non consente di valutare la capacità dei mutageni di alterare con precisione la struttura cromosomica del DNA umano, per cui non può da solo costituire un elemento sufficiente di valutazione del rischio genotossico, ma va eseguito insieme a test su cellule eucariotiche (test dei micronuclei, test della cometa, quantificazione degli addotti al DNA) e su animali in vivo. Vi è comunque una buona correlazione fra l'effetto mutageno riscontrato nel test di Ames e la cancerogenicità della sostanza negli organismi superiori.

Il test di Ames consiste nell' utilizzo di un agente potenzialmente cancerogeno o genotossico in grado di indurre una mutazione revertante di un microrganismo modello mutato, batterio Salmonella thiphymurium, mutato per impedire la sintesi dell'aminoacido Istidina, un aminoacido che consente la crescita del microorganismo.

I batteri mutati vengono fatti crescere in un terreno di coltura addizionato con fegato di ratto (S9), questo per simulare quello che avviene all'interno di un organismo eucariote perché non tutte le sostanze potenzialmente cancerogene sono tali così come entrano nell'organismo ma devono subire una serie di modificazioni molecolari indotte da alcuni enzimi presenti nel corpo ed in particolare nel fegato come i citocromi P450. Questo tipo di sostanze sono detti cancerogeni indiretti o pro-cancerogeni.  Vi è una minima quantità di Istidina  dove viene aggiunta tramite dischi la sostanza potenzialmente mutagenica.

Lo scopo del test è quello di verificare la capacità dell'agente potenzialmente mutagenico di indurre mutazioni tali da riportare il batterio a sintetizzare l'istidina, se ciò avviene vuol dire che l'agente analizzato è da ritenersi mutagene.

Inoltre vi è da dire che nel batterio oltre alla deficienza del Gene o dei Geni in grado di produrre l'istidina vi sono altre mutazioni indotte che rendono ad esempio la membrana facilmente penetrabile dall' agente cancerogeno e delle mutazioni che eliminano alcuni meccanismi di riparazione del DNA batterico come le scissione di nucleotidi (BER) e la riparazione per escissione di basi (NER).

ENGLISH

Principle of the test

The principle of the test is based on the evaluation of the ability of a suspected mutagen to cause the reversion of an auxotrophic his- trait in a mutated strain of bacteria (Salmonella typhimurium), making it again able to survive in a histidine-free medium. Most of the Salmonella strains used in the test also have other mutations that alter the permeability of the wall (rfa-, eliminates the polysaccharide chain of membrane lipopolysaccharides), allowing even large mutagens to enter the bacterium, or eliminate the action of DNA repair mechanisms (ΔuvrB, deletion of the uvrB gene), thus allowing the maintenance of the obtained mutations. Since the absence of repair mechanisms makes the growth of the bacterium complex, in many cases the plasmid pKM101 is introduced into the strain, containing the genes for the SOS DNA repair system, prone to making mistakes during the repair. A further mutation present in some commonly used strains is the deletion of a gene involved in biotin biosynthesis (Δbio), which makes it impossible for the bacterium to survive in soils without it; this allows to identify any contamination of the final result on the plate (the revertant bacteria obtained must be auxotrophic for the biotin).

Experimental procedure

The test is carried out by plating the bacteria on a solid agar medium containing a minimum amount of histidine, and placing a disc containing the test substance in the center of the plate, which can thus spread into the culture medium. The presence of traces of amino acid in the medium allows to identify mutations that require several cycles of cellular duplication to manifest themselves phenotypically, as in the case of point mutations on a single DNA helix. The frequency of the mutations obtained is evaluated based on the distance from the disc after 48 hours of growth, in relation to a control plate in which the bacteria were grown on the same medium, but in the absence of the suspected mutagen; the comparison of the two plates allows to eliminate from the test result the effect due to the presence of spontaneous revertants. The test for a substance is always carried out in parallel on different Salmonella strains, in which auxotrophy is due to different types of mutations (point mutations of different types, or frameshift mutations such as insertions or deletions) to identify the type of effect. caused to DNA.

Limitations of the test

The main limitation of the test, thus described, is the impossibility of evaluating the indirect genotoxic effect, i.e. of substances that do not directly present their own mutagenic effect, but become toxic following the metabolism undergone in higher organisms, as in the case of ethyl alcohol, the effect of which requires the formation of its metabolite acetaldehyde. To overcome this problem, different test protocols can be used, which foresee the presence in the culture medium of the enzymes involved in the metabolism of xenobiotics, which can activate the genotoxic effect of the promutagen. In this case the substance to be tested is added directly to the culture medium. Another indirect mechanism of genotoxicity not detected by the test is that which involves an action mediated by the inflammatory system or by viruses, as happens in the case of asbestos.

The mutated bacteria are grown in a culture medium supplemented with rat liver (S9), this to simulate what happens inside a eukaryotic organism because not all potentially carcinogenic substances are such as they enter the organism but must undergo a series of molecular modifications induced by some enzymes present in the body and in particular in the liver such as cytochromes P450. These types of substances are called indirect carcinogens or pro-carcinogens. There is a minimal amount of histidine where the potentially mutagenic substance is added via discs.

The purpose of the test is to verify the ability of the potentially mutagenic agent to induce mutations such as to bring the bacterium back to synthesize histidine, if this occurs it means that the agent analyzed is to be considered mutagenic.

Furthermore, it must be said that in the bacterium, in addition to the deficiency of the gene or genes capable of producing histidine, there are other induced mutations that make, for example, the membrane easily penetrable by the carcinogen and mutations that eliminate some repair mechanisms of the Bacterial DNA such as nucleotide cleavage (BER) and base excision repair (NER).

Being conducted in bacterial cells, the Ames test does not allow to evaluate the ability of mutagens to accurately alter the chromosomal structure of human DNA, so it cannot by itself constitute a sufficient element for assessing the genotoxic risk, but must be performed together with test on eukaryotic cells (micronucleus test, comet test, quantification of DNA adducts) and on animals in vivo. However, there is a good correlation between the mutagenic effect found in the Ames test and the carcinogenicity of the substance in higher organisms.

The Ames test consists in the use of a potentially carcinogenic or genotoxic agent capable of inducing a revertant mutation of a mutated model microorganism, Salmonella thiphymurium bacterium, mutated to prevent the synthesis of the amino acid Histidine, an amino acid that allows the growth of the microorganism.

Da:

https://sites.google.com/view/cytotoxycologyresearchitaly/articles?authuser=0

https://it.wikipedia.org/wiki/Test_di_Ames