Bigfoot Spectral Cell Sorter with Sasquatch Software / Ordinatore di cellule spettrali Bigfoot con software Sasquatch

 Bigfoot Spectral Cell Sorter with Sasquatch Software / Ordinatore di cellule spettrali Bigfoot con software Sasquatch

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

SQS presents a visual representation of the selected panel of fluorophores. This graph is helpful as it provides a clear picture of where additional fluorophores can be added without overlapping with the current selections. A specific emission curve can be shaded by highlighting it in the “Selected fluorophores” list. /  SQS presenta una rappresentazione visiva del pannello selezionato di fluorofori. Questo grafico è utile in quanto fornisce un'immagine chiara di dove è possibile aggiungere ulteriori fluorofori senza sovrapporsi alle selezioni correnti. Una curva di emissione specifica può essere ombreggiata evidenziandola nell'elenco "fluorofori selezionati".

The world’s first real-time spectral cell sorter

Introduction

 Researchers working in flow cytometry require the highest-quality data from every sample in order to achieve increasingly challenging scientific goals. The demand for higher-resolution, multidimensional data has amplified interest in spectral data unmixing and analysis as compared to the traditional method of compensation for spectral spillover. Investigators frequently find it difficult or impossible to resolve dim, rare, or highly autofluorescent populations using standard compensation. Although some companies offer spectral analysis and post-acquisition sort solutions, workflows are cumbersome, and experiments consume large volumes of precious sample. Despite the shortcomings of current options, researchers still desire the power of spectral data handling. The Invitrogen™ Bigfoot Spectral Cell Sorter was developed with innovative hardware and software specifically to sort cells using spectrally unmixed data in real time. 

Seventeen years ago, the concept of spectral flow cytometry was demonstrated by flow cytometry pioneer and innovator J. Paul Robinson, Cytometry Lab, Purdue University, but it was not incorporated into standard instruments for many years due to limited practical applications. In 2015, commercial spectral flow cytometers appeared on the market ready for installation in core lab facilities seeking to take on new challenges (Futamura ). These instruments still offer a chance to unravel complex, heterogeneous populations where autofluorescence limits dye options (Schmutz 2017). This type of versatility is reshaping panel design by allowing freedom to combine fluorescent proteins, surface markers, and other dyes while still allowing spectral separation. 

However, many instruments that are produced today are uniquely configured to primarily perform spectral analysis, with limited options to perform the accepted, reliable, and trusted technique of compensation, which some researchers still want due to familiarity or for comparison to other methods. The Bigfoot Spectral Cell Sorter’s acquisition and sorting application, Sasquatch Software (SQS), allows the operator to sort and analyze either spectrally unmixed data or traditional compensated data.

As with most technological tools, the quality of data produced depends on proper use. Successful highspeed sorting on spectrally unmixed data requires a precise combination of concepts from the disciplines of biology, mathematics, and high-speed computing. Some researchers may find it overwhelming to balance numerous fields of expertise, where even a slight knowledge gap can result in suboptimal experiment design and results. We used the underlying mathematical theory of spectral data handling to develop tools that provide researchers with valuable guidance, starting with panel design and continuing throughout all phases of the experiment. Not only does this impart mathematical rigor and eliminate subjectivity, it also frees the researcher to focus on his or her scientific specialty. SQS includes extensive user-support tools to identify fluorophores that, when paired, are either expected to unmix properly or are expected to be challenging due to high levels of signal overlap. To assist with experiment design, geometric and statistical comparisons are performed to assess the likelihood of successful unmixing of the chosen panel. Similar comparisons are used to identify and account for autofluorescence. The spectral unmixing process is performed on specialized, state-of-the-art hardware, allowing for remarkably fast real-time processing and high-purity spectral sorting. In this paper, we will demonstrate the capability of the Bigfoot Spectral Cell Sorter using a fifteen-color panel. This panel was selected to show proof of principle for this cutting-edge technique of combining spectral workflow and multiparameter six-way cell sorting. Hardware features are covered in more detail in the “Discussion and conclusion” section of this white paper, as well as in other white papers.

Methods 

The Bigfoot Spectral Cell Sorter was started and allowed to warm up and stabilize for 10 minutes, after which the automated QC process was initiated. The comprehensive three-bead QC protocol set the optimal nozzle position, calibrated droplet and stream settings, adjusted the stream positions, and calculated the system’s drop delay value. The resulting CVs, voltages, and separation factor, as well as sort settings, are tracked day-to-day and can be viewed in a trending report. PMT voltages can be applied as application references in future experiments.

 Sample preparation 

Normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected from donors and immediately stained with the fluorophore-conjugated antibodies, including single color controls, at optimal concentrations for unstained-stained signal separation. The blood was then lysed using OptiLyse™ C solution (Beckman Coulter; Cat. No. A11895) for 10 minutes. After lysing, a buffer solution of Hanks’ balanced salt solution (HBSS) and 2% fetal bovine serum (FBS) was added to increase the quality and longevity of the sample. The samples were then centrifuged at 300 x g for 5 minutes and the supernatant was removed. HBSS was added to each sample and immediately run on the Bigfoot Spectral Cell Sorter using SQS. The sample used for sorting was further concentrated to allow for a higher event rate and sort speed.

Spectral workflow 

In SQS, a new sort workflow was selected and designated as a spectral experiment. The required fluorophores were selected and single-color control samples and templates were automatically generated. The unstained control was placed on the multisample loader and run on the instrument. PMT voltages were automatically set to ensure that autofluorescence signals were resolved. Without any additional voltage adjustments, the singlecolor controls were run sequentially using the multisample loader and the automatically generated templates were populated with data. The instrument obtained the spectral signature for each fluorophore in all fluorescence channels. The unmixing algorithm automatically applied calculations after each control was acquired and recorded. New “unmixed parameters” then became selectable in plots and were used for acquisition and sorting in the workspace. Spectral plots were automatically created in all fluorescence channels.

Spectral plot examples

 The autofluorescence background signal is captured using the unstained control. SQS uses an automated positive signal selection process, which often means that only a small number of positive events are required to construct the single-color–control signal. For each signal, the process automatically seeks significant separation from the autofluorescence of the unstained sample, thus ensuring a robust positive single-color–control signal. With this information, the software defines the positive populations, which are then shown in automatically generated templates. Successful experiments have been run with as few as 50 positive events, showing that SQS can build quality spectral signals remarkably fast. These efficiencies mean less sample waste and reduced setup time. A spectral graph is included in each of the automatically generated single control templates showing the signature of the positive cells in each control. The variation in spectral curves between different fluorophores is key to the unmixing algorithms applied to the data. Cell sorting setup Six populations were selected for sorting, highlighting the ability to combine spectral unmixing and cell sorting. These populations are identified by the outlined gating strategy. The Bigfoot Spectral Cell Sorter was configured with a 100 µm nozzle tip, 30 psi sheath pressure, a drop drive amplitude of 13.3 volts, and a drop drive frequency of 40,600 Hz. The sort was performed with an event rate of 5,000 events per second on the identified spectrally unmixed populations. Cells were sorted using purity mode into six 5 mL tubes with 500 µL filtered HBSS and reanalyzed for purity.

 Results

 Following the sort, each collection tube was reanalyzed for purity. The spectral unmixing capability of the Bigfoot Spectral Cell Sorter produced results with high efficiency and greater than 98 percent purity. The sorting performance is equivalent to instruments that utilize traditional compensation. This parity will allow users to seamlessly transition between the two methods as experiment complexity increases, thus improving research laboratory workflow.

Discussion and conclusion 

Full spectral cytometry has been proven to help researchers build complex panels with numerous and novel combinations of markers. The data retrieved from these experiments are well resolved and of higher resolution than is possible with traditional methods. However, the Bigfoot Spectral Cell Sorter takes these improvements to the next level by enabling these new combinations of markers to be sorted in real time. Additionally, operators can select up to 18 subpopulations of cells and sort each one to a different tube in a single run, or utilize the reverse index feature to correlate an event in a plot with the physical location of the sorted event in a plate to further support DNA sequencing.

The ability to compare two fluorochromes across multiple points on their spectra significantly reduces the correction error compared to compensating two spectral bands. Full spectrum sorting will produce better population resolution compared to nonspectral sorting, and so result in superior sorted populations. The electronics of the Bigfoot Spectral Cell Sorter include custom-designed, programmable-logic hardware with algorithms developed specifically for the challenges presented by sorting. Multiple innovations and design iterations were required to achieve greater than six terabits per second data processing speed required for successful operation. The resulting architecture allows operators to use either compensation or spectral unmixing in real time at a sort rate of >70,000 events per second. The Bigfoot Spectral Cell Sorter has up to nine lasers with 3–12 PMTs available for each detection path, and is therefore ideally suited for the wide range of fluorescence signal intensities found in diverse flow cytometry applications. PMT voltages can be set using a control sample of unstained cells or by importing application settings derived from a three-bead QC control. The Bigfoot Spectral Cell Sorter was designed using PMTs because they provide robust signal strength, which results in a higher signal-to-noise ratio than other collection methods. Furthermore, PMTs paired with selected singlechannel filters create improved differentiation of fluorophore spectra and ensure that the system is not limited to a specific application. The Bigfoot Spectral Cell Sorter’s PMTs have an 8 mm diameter aperture, which significantly improves signal stability, resulting in narrow CVs and consistent results across flow rates for the entire workday. The detector and optical configuration designed into the Bigfoot Spectral Cell Sorter allow investigators the option of viewing data in multidimensional spectral mode or with compensation; both methods achieve outstanding performance. No other instrument can provide these advantages to the researcher.

The power of spectral flow cytometry and real-time sorting can help to extend the frontier of cell-type discovery in the immediate future. The combination of expanded panel options with high-throughput cell sorting enables the rapid interrogation of novel populations. Thus, the Bigfoot Spectral Cell Sorter offers particular promise for large-scale exploratory efforts such as the Human Cell Atlas, where spectral sorting will likely expand the ability to identify and isolate new cell populations (Regev 2017). Further, these novel multiparametric panels are expected to provide expanded protein expression information to complement transcriptional characterization of novel human cell types by high-throughput sequencing. As part of our continuing efforts to be responsive to professionals working in flow cytometry, our team engages in ongoing dialog with industry experts to deliver the features and performance needed for highend instrumentation. The Bigfoot Spectral Cell Sorter is the product of decades of flow cytometry experience, innovative engineering, and constant collaboration. As the first spectral cell sorter, the Bigfoot Spectral Cell Sorter will expand research capabilities and provide innovation to serve those in the quest for greater scientific knowledge.

ITALIANO

Il primo selezionatore di cellule spettrali in tempo reale al mondo

Introduzione

 I ricercatori che lavorano in citometria a flusso richiedono dati della massima qualità da ogni campione per raggiungere obiettivi scientifici sempre più impegnativi. La richiesta di dati multidimensionali a risoluzione più elevata ha amplificato l'interesse per l'unmixing e l'analisi dei dati spettrali rispetto al metodo tradizionale di compensazione per lo spillover spettrale. I ricercatori trovano spesso difficile o impossibile risolvere popolazioni deboli, rare o altamente autofluorescenti utilizzando la compensazione standard. Sebbene alcune aziende offrano analisi spettrali e soluzioni di ordinamento post-acquisizione, i flussi di lavoro sono ingombranti e gli esperimenti consumano grandi volumi di campioni preziosi. Nonostante le carenze delle opzioni attuali, i ricercatori desiderano ancora la potenza della gestione dei dati spettrali. Invitrogen™ Bigfoot Spectral Cell Sorter è stato sviluppato con hardware e software innovativi specificamente per ordinare le cellule utilizzando dati spettrali non miscelati in tempo reale.

Diciassette anni fa, il concetto di citometria a flusso spettrale è stato dimostrato dal pioniere e innovatore della citometria a flusso J. Paul Robinson, Cytometry Lab, Purdue University, ma non è stato incorporato negli strumenti standard per molti anni a causa delle limitate applicazioni pratiche. Nel 2015, i citometri a flusso spettrali commerciali sono apparsi sul mercato pronti per l'installazione nelle strutture di laboratorio principali che cercano di affrontare nuove sfide (Futamura). Questi strumenti offrono ancora la possibilità di svelare popolazioni complesse ed eterogenee in cui l'autofluorescenza limita le opzioni di colorante (Schmutz 2017). Questo tipo di versatilità sta rimodellando il progetto del pannello consentendo la libertà di combinare proteine ​​fluorescenti, marcatori di superficie ed altri coloranti pur consentendo la separazione spettrale.

Tuttavia, molti strumenti prodotti oggi sono configurati in modo univoco per eseguire principalmente l'analisi spettrale, con opzioni limitate per eseguire la tecnica di compensazione accettata, affidabile e affidabile, che alcuni ricercatori desiderano ancora per familiarità o per confronto con altri metodi. L'applicazione di acquisizione e smistamento del Bigfoot Spectral Cell Sorter, Sasquatch Software (SQS), consente all'operatore di ordinare e analizzare dati spettrali non miscelati o dati compensati tradizionali.

Come per la maggior parte degli strumenti tecnologici, la qualità dei dati prodotti dipende dal corretto utilizzo. Il successo dell'ordinamento ad alta velocità su dati spettrali non misti richiede una combinazione precisa di concetti delle discipline della biologia, della matematica e dell'informatica ad alta velocità. Alcuni ricercatori potrebbero trovare travolgente bilanciare numerosi campi di competenza, dove anche un leggero divario di conoscenza può comportare una progettazione e risultati non ottimali dell'esperimento. Abbiamo utilizzato la teoria matematica sottostante della gestione dei dati spettrali per sviluppare strumenti che forniscano ai ricercatori una guida preziosa, a partire dalla progettazione del pannello e proseguendo durante tutte le fasi dell'esperimento. Questo non solo impartisce rigore matematico ed elimina la soggettività, ma libera anche il ricercatore di concentrarsi sulla sua specialità scientifica. SQS include ampi strumenti di supporto per l'utente per identificare i fluorofori che, una volta accoppiati, dovrebbero essere smistati correttamente o dovrebbero essere difficili a causa degli alti livelli di sovrapposizione del segnale. Per aiutare con la progettazione dell'esperimento, vengono eseguiti confronti geometrici e statistici per valutare la probabilità di successo di unmixing del pannello scelto. Confronti simili vengono utilizzati per identificare e spiegare l'autofluorescenza. Il processo di scomposizione spettrale viene eseguito su hardware specializzato e all'avanguardia, consentendo un'elaborazione in tempo reale notevolmente veloce ed un ordinamento spettrale di elevata purezza. In questo documento, dimostreremo la capacità del Bigfoot Spectral Cell Sorter utilizzando un pannello a quindici colori. Questo pannello è stato selezionato per mostrare la prova di principio per questa tecnica all'avanguardia di combinare il flusso di lavoro spettrale e l'ordinamento cellulare a sei vie multiparametrico. Le funzionalità hardware sono trattate in modo più dettagliato nella sezione "Discussione e conclusione" di questo white paper, così come in altri white paper.

Metodi

Il Bigfoot Spectral Cell Sorter è stato avviato e lasciato riscaldare e stabilizzare per 10 minuti, dopodiché è stato avviato il processo di controllo qualità automatizzato. Il protocollo QC completo a tre sfere ha impostato la posizione ottimale dell'ugello, calibrato le impostazioni delle gocce e del flusso, regolato le posizioni del flusso e calcolato il valore del ritardo di caduta del sistema. I CV, le tensioni e il fattore di separazione risultanti, nonché le impostazioni di ordinamento, vengono monitorati giorno per giorno e possono essere visualizzati in un rapporto sulle tendenze. Le tensioni PMT possono essere applicate come riferimenti applicativi in ​​esperimenti futuri.

 Preparazione del campione

Cellule mononucleate normali del sangue periferico umano (PBMC) sono state raccolte da donatori e immediatamente colorate con gli anticorpi coniugati con fluorofori, inclusi i controlli a colore singolo, a concentrazioni ottimali per la separazione del segnale non colorato. Il sangue è stato quindi lisato utilizzando la soluzione OptiLyse™ C (Beckman Coulter; Cat. No. A11895) per 10 minuti. Dopo la lisi, è stata aggiunta una soluzione tampone di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e siero bovino fetale al 2% (FBS) per aumentare la qualità e la longevità del campione. I campioni sono stati quindi centrifugati a 300 x g per 5 minuti e il surnatante è stato rimosso. L'HBSS è stato aggiunto a ciascun campione ed eseguito immediatamente sul Bigfoot Spectral Cell Sorter utilizzando SQS. Il campione utilizzato per lo smistamento è stato ulteriormente concentrato per consentire una maggiore frequenza di eventi e velocità di smistamento.

Flusso di lavoro spettrale

 In SQS, è stato selezionato un nuovo flusso di lavoro di ordinamento e progettato come esperimento spettrale. Sono stati selezionati i fluorofori richiesti e sono stati generati automaticamente campioni e modelli di controllo monocolore. Il controllo non colorato è stato posizionato sul caricatore multicampione ed eseguito sullo strumento. Le tensioni PMT sono state impostate automaticamente per garantire la risoluzione dei segnali di autofluorescenza. Senza ulteriori regolazioni della tensione, i controlli monocolore sono stati eseguiti in sequenza utilizzando il caricatore multicampione ed i modelli generati automaticamente sono stati popolati con i dati. Lo strumento ha ottenuto la firma spettrale per ciascun fluoroforo in tutti i canali di fluorescenza. L'algoritmo di unmixing applicava automaticamente i calcoli dopo che ogni controllo era stato acquisito e registrato. Nuovi "parametri non miscelati" sono quindi diventati selezionabili nei grafici e sono stati utilizzati per l'acquisizione e l'ordinamento nell'area di lavoro. I grafici spettrali sono stati creati automaticamente in tutti i canali di fluorescenza.

Esempi di grafici spettrali 

Il segnale di fondo dell'autofluorescenza viene catturato utilizzando il controllo non colorato. SQS utilizza un processo automatizzato di selezione del segnale positivo, il che spesso significa che è necessario solo un piccolo numero di eventi positivi per costruire il segnale di controllo a colore singolo. Per ogni segnale, il processo cerca automaticamente una separazione significativa dall'autofluorescenza del campione non colorato, garantendo così un segnale di controllo monocolore positivo robusto. Con queste informazioni, il software definisce le popolazioni positive, che vengono poi mostrate in modelli generati automaticamente. Sono stati eseguiti esperimenti di successo con un minimo di 50 eventi positivi, dimostrando che SQS può generare segnali spettrali di qualità in modo straordinariamente veloce. Queste efficienze significano meno spreco di campione e tempi di configurazione ridotti. Un grafico spettrale è incluso in ciascuno dei modelli di controllo singolo generati automaticamente che mostrano la firma delle celle positive in ciascun controllo. La variazione delle curve spettrali tra i diversi fluorofori è la chiave per gli algoritmi di scomposizione applicati ai dati. Configurazione dell'ordinamento delle cellule.

 Sono state selezionate sei popolazioni per l'ordinamento, evidenziando la capacità di combinare la separazione spettrale e l'ordinamento delle cellule. Queste popolazioni sono identificate dalla strategia di gating delineata. Il Bigfoot Spectral Cell Sorter è stato configurato con una punta dell'ugello di 100 µm, una pressione della guaina di 30 psi, un'ampiezza di azionamento della caduta di 13,3 volt e una frequenza di azionamento della caduta di 40.600 Hz. L'ordinamento è stato eseguito con un tasso di eventi di 5.000 eventi al secondo sulle popolazioni spettralmente non miste identificate. Le cellule sono state ordinate utilizzando la modalità di purezza in sei provette da 5 mL con 500 µL di HBSS filtrato e rianalizzate per la purezza.

 Risultati

 Dopo l'ordinamento, ogni provetta di raccolta è stata rianalizzata per la purezza. La capacità di scomposizione spettrale del Bigfoot Spectral Cell Sorter ha prodotto risultati con un'elevata efficienza ed una purezza superiore al 98%. Le prestazioni di smistamento sono equivalenti a strumenti che utilizzano la compensazione tradizionale. Questa parità consentirà agli utenti di passare senza problemi tra i due metodi all'aumentare della complessità dell'esperimento, migliorando così il flusso di lavoro del laboratorio di ricerca.

Discussione e conclusione

È stato dimostrato che la citometria spettrale completa aiuta i ricercatori a costruire pannelli complessi con numerose e nuove combinazioni di marcatori. I dati recuperati da questi esperimenti sono ben risolti e di maggiore risoluzione rispetto a quanto possibile con i metodi tradizionali. Tuttavia, il Bigfoot Spectral Cell Sorter porta questi miglioramenti al livello successivo consentendo di ordinare queste nuove combinazioni di marcatori in tempo reale. Inoltre, gli operatori possono selezionare fino a 18 sottopopolazioni di cellule e ordinarle in una provetta diversa in una singola corsa, oppure utilizzare la funzione di indice inverso per correlare un evento in un grafico con la posizione fisica dell'evento ordinato in una piastra per supportare il sequenziamento del DNA.

La capacità di confrontare due fluorocromi su più punti sui loro spettri riduce significativamente l'errore di correzione rispetto alla compensazione di due bande spettrali. L'ordinamento a spettro completo produrrà una migliore risoluzione della popolazione rispetto all'ordinamento non spettrale, e quindi si tradurrà in popolazioni ordinate superiori. L'elettronica del Bigfoot Spectral Cell Sorter include hardware a logica programmabile progettato su misura con algoritmi sviluppati specificamente per le sfide presentate dall'ordinamento. Sono state necessarie molteplici innovazioni ed iterazioni di progettazione per raggiungere una velocità di elaborazione dei dati superiore a sei terabit al secondo necessaria per il successo delle operazioni. L'architettura risultante consente agli operatori di utilizzare la compensazione o l'unmixing spettrale in tempo reale a una velocità di ordinamento di >70.000 eventi al secondo. Il Bigfoot Spectral Cell Sorter ha fino a nove laser con 3-12 PMT disponibili per ciascun percorso di rilevamento ed è quindi ideale per l'ampia gamma di intensità del segnale di fluorescenza presenti in diverse applicazioni di citometria a flusso. Le tensioni PMT possono essere impostate utilizzando un campione di controllo di celle non colorate o importando le impostazioni dell'applicazione derivate da un controllo QC a tre sfere. Il Bigfoot Spectral Cell Sorter è stato progettato utilizzando i PMT perché forniscono una forte potenza del segnale, che si traduce in un rapporto segnale-rumore più elevato rispetto ad altri metodi di raccolta. Inoltre, i PMT abbinati a filtri a canale singolo selezionati creano una migliore differenziazione degli spettri dei fluorofori e assicurano che il sistema non sia limitato a un'applicazione specifica. I PMT del Bigfoot Spectral Cell Sorter hanno un'apertura di 8 mm di diametro, che migliora significativamente la stabilità del segnale, con CV stretti e risultati coerenti tra le portate per l'intera giornata lavorativa. Il rivelatore e la configurazione ottica progettati nel Bigfoot Spectral Cell Sorter consentono agli investigatori la possibilità di visualizzare i dati in modalità spettrale multidimensionale o con compensazione; entrambi i metodi raggiungono prestazioni eccezionali. Nessun altro strumento può fornire questi vantaggi al ricercatore.

La potenza della citometria a flusso spettrale e l'ordinamento in tempo reale possono aiutare ad estendere la frontiera della scoperta del tipo di cellula nell'immediato futuro. La combinazione di opzioni di pannello espanse con l'ordinamento delle cellule ad alto rendimento consente l'interrogazione rapida di nuove popolazioni. Pertanto, il Bigfoot Spectral Cell Sorter offre una particolare promessa per sforzi esplorativi su larga scala come l'Atlante delle cellule umane, in cui l'ordinamento spettrale probabilmente amplierà la capacità di identificare ed isolare nuove popolazioni cellulari (Regev 2017). Inoltre, ci si aspetta che questi nuovi pannelli multiparametrici forniscano informazioni estese sull'espressione delle proteine ​​per completare la caratterizzazione trascrizionale di nuovi tipi di cellule umane mediante sequenziamento ad alto rendimento. Come parte dei nostri continui sforzi per essere reattivi ai professionisti che lavorano nella citometria a flusso, il nostro gruppo si impegna in un dialogo continuo con esperti del settore per fornire le caratteristiche e le prestazioni necessarie per la strumentazione di fascia alta. Il Bigfoot Spectral Cell Sorter è il prodotto di decenni di esperienza nella citometria a flusso, ingegneria innovativa e collaborazione costante. Come primo selezionatore di cellule spettrali, il Bigfoot Spectral Cell Sorter amplierà le capacità di ricerca e fornirà innovazione per servire coloro che sono alla ricerca di una maggiore conoscenza scientifica.

Da:

http://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Reference-Materials/bigfoot-spectral-cell-sorter-sasquatch-software-worlds-first-real-time-spectral-cell-sorter-white-paper.pdf