Cryo-EM fa avanzare la ricerca sul cancro al seno e alle ovaie. / Cryo-EM Advances Breast and Ovarian Cancer Research.
Cryo-EM fa avanzare la ricerca sul cancro al seno e alle ovaie. Il procedimetno del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione. / Cryo-EM Advances Breast and Ovarian Cancer Research. The procedure of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this application.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Utilizzando una tecnologia di imaging avanzata, gli scienziati della Mayo Clinic hanno fornito una migliore comprensione del complesso proteico BRCA1-BARD1, che è spesso mutato in pazienti con cancro al seno o alle ovaie. Il loro articolo (" Mechanisms of BRCA1-BARD1 nucleosome Recognition and ubiquitylation "), pubblicato su Nature , identifica aspetti di come funziona BRCA1-BARD1, supportando la futura ricerca traslazionale, gli sforzi di prevenzione del cancro e lo sviluppo di farmaci.
“Il soppressore tumorale BRCA1-BARD1 è una ubiquitina ligasi E3 necessaria per la riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA mediante ricombinazione omologa. Il complesso BRCA1-BARD1 si localizza nella cromatina danneggiata dopo la replicazione del DNA e catalizza l'ubiquitilazione dell'istone H2A e di altri bersagli cellulari. Le basi molecolari per il reclutamento alle rotture del doppio filamento e il riconoscimento del bersaglio di BRCA1-BARD1 rimangono sconosciute", scrivono i ricercatori.
“Qui usiamo la microscopia crioelettronica per mostrare che la ripetizione dell'anchirina ed i domini BRCT tandem in BARD1 adottano una piega compatta e si legano agli istoni nucleosomiali, al DNA ed alla monoubiquitina attaccati all'amino-terminale H2A K13 o K15, due segnali noti per essere specifici per rotture a doppio filamento. Mostriamo inoltre che i domini RING in BRCA1-BARD1 orientano un enzima coniugante l'ubiquitina E2 in cima al nucleosoma in una conformazione dinamica, innescato per il trasferimento dell'ubiquitina alle code flessibili carbossi-terminali di H2A e variante H2AX.
“Il nostro lavoro rivela una diafonia regolatoria in cui il riconoscimento della monoubiquitina da parte di BRCA1-BARD1 al capolinea N di H2A blocca la formazione di catene di poliubiquitina e promuove cooperativamente l'ubiquitilazione al capolinea C di H2A. Questi risultati chiariscono i meccanismi del reclutamento della cromatina BRCA1-BARD1 e della specificità di ubiquitilazione, evidenziano le funzioni chiave di BARD1 in entrambi i processi e spiegano come BRCA1-BARD1 promuove la ricombinazione omologa opponendosi alla proteina di riparazione del DNA 53BP1 nella cromatina post-replicativa.
"Questi dati forniscono un quadro strutturale per valutare le varianti di BARD1 ed aiutano a identificare le mutazioni che guidano lo sviluppo del cancro".
“BRCA1-BARD1 è importante per la riparazione del DNA. Ha una rilevanza diretta per il cancro perché centinaia di mutazioni nei geni BRCA1 e BARD1 sono state identificate in pazienti affetti da cancro", afferma Georges Mer, PhD, biologo strutturale e biochimico della Mayo Clinic che è l'autore principale dell'articolo. “Ma nessuno sa se queste mutazioni, o varianti di significato sconosciuto, predispongono o meno al cancro perché non sappiamo se le varianti si trovano in una regione di BRCA1-BARD1 che è importante per la funzione. Ora, poiché possiamo vedere come funziona BRCA1-BARD1, abbiamo una buona idea di quali regioni di BRCA1-BARD1 sono importanti per il funzionamento".
DNA e complesso proteico dell'istone
In una cellula, il complesso di DNA e proteine istoniche è complessato in cromatina e confezionato in nucleosomi. Le proteine di risposta al danno del DNA devono accedere alla cromatina per riparare il DNA danneggiato. BRCA1-BARD1 contribuisce a fissare i filamenti di DNA rotti, il che aiuta nel mantenimento e nella sopravvivenza delle cellule. Ma è anche una funzione che potrebbe essere bloccata o inattivata se questa è una strategia utilizzata da una cellula cancerosa per sopravvivere alla chemioterapia.
"Abbiamo utilizzato due tecniche, microscopia crioelettronica e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, per capire a una risoluzione quasi atomica come BRCA1-BARD1 si associa al nucleosoma, l'unità ripetitiva della cromatina, e come BRCA1-BARD1 modifica la cromatina", spiega Mer.
Nella microscopia crioelettronica, i BRCA1-BARD1 purificati legati ai nucleosomi, denominati insieme macromolecole, vengono congelati flash e quindi ripresi utilizzando un microscopio elettronico. Le macromolecole sono orientate in vari modi all'interno del campione, quindi un programma per computer valuta tutti i dati di orientamento per creare una struttura 3D. Mer ed il suo gruppo hanno anche esaminato i complessi nucleosomi BRCA1-BARD1 con la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, che utilizza un forte magnete per sondare le posizioni relative degli atomi all'interno delle macromolecole. Utilizzando questi strumenti di imaging, gli scienziati hanno potuto visualizzare BRCA1-BARD1 in azione e scoprire una nuova funzione del complesso.
"Abbiamo mostrato come BRCA1-BARD1 attacca l'ubiquitina al nucleosoma, ma abbiamo anche determinato che BRCA1-BARD1 riconosce l'ubiquitina già attaccata al nucleosoma, che funge da segnale per il DNA rotto", afferma Mer. "Abbiamo scoperto un inaspettato cross-talk attraverso il quale il riconoscimento dell'ubiquitina da parte di BRCA1-BARD1 migliora la sua attività di attaccamento all'ubiquitina e questo ci aiuta a capire meglio come BRCA1-BARD1 svolge la sua funzione".
I ricercatori hanno creato un video dai dati della microscopia crioelettronica per mostrare dove il complesso proteico interagisce con il nucleosoma.
Mer ed il suo gruppo si aspettano che le immagini ad alta risoluzione di BRCA1-BARD1 possano aiutare a guidare la cura del paziente ed il futuro trattamento del cancro in due modi: classificando varianti di significato sconosciuto e indirizzando lo sviluppo di farmaci con maggiore precisione.
"Con queste strutture 3D, dovremmo essere in grado di convertire diverse varianti di significato sconosciuto in varianti probabili predisponenti al cancro", afferma Mer. “Si prevede che questo lavoro avrà anche un impatto sullo sviluppo di farmaci a lungo termine perché le strutture 3D di BRCA1-BARD1 in complesso con il nucleosoma che abbiamo generato possono aiutare nella progettazione di piccole molecole che potrebbero, ad esempio, inattivare BRCA1-BARD1 .”
ENGLISH
Using advanced imaging technology, Mayo Clinic scientists have provided a better understanding of the BRCA1-BARD1 protein complex, which is often mutated in patients with breast or ovarian cancer. Their paper (“Mechanisms of BRCA1–BARD1 nucleosome recognition and ubiquitylation”), published in Nature, identifies aspects of how BRCA1-BARD1 functions, supporting future translational research, cancer prevention efforts and drug development.
“The BRCA1–BARD1 tumor suppressor is an E3 ubiquitin ligase necessary for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. The BRCA1–BARD1 complex localizes to damaged chromatin after DNA replication and catalyzes the ubiquitylation of histone H2A and other cellular targets. The molecular bases for the recruitment to double-strand breaks and target recognition of BRCA1–BARD1 remain unknown,” write the investigators.
“Here we use cryo-electron microscopy to show that the ankyrin repeat and tandem BRCT domains in BARD1 adopt a compact fold and bind to nucleosomal histones, DNA and monoubiquitin attached to H2A amino-terminal K13 or K15, two signals known to be specific for double-strand breaks. We further show that RING domains in BRCA1–BARD1 orient an E2 ubiquitin-conjugating enzyme atop the nucleosome in a dynamic conformation, primed for ubiquitin transfer to the flexible carboxy-terminal tails of H2A and variant H2AX.
“Our work reveals a regulatory crosstalk in which recognition of monoubiquitin by BRCA1–BARD1 at the N terminus of H2A blocks the formation of polyubiquitin chains and cooperatively promotes ubiquitylation at the C terminus of H2A. These findings elucidate the mechanisms of BRCA1–BARD1 chromatin recruitment and ubiquitylation specificity, highlight key functions of BARD1 in both processes and explain how BRCA1–BARD1 promotes homologous recombination by opposing the DNA repair protein 53BP1 in post-replicative chromatin.
“These data provide a structural framework to evaluate BARD1 variants and help to identify mutations that drive the development of cancer.”
“BRCA1-BARD1 is important for DNA repair. It has direct relevance to cancer because hundreds of mutations in the BRCA1 and BARD1 genes have been identified in cancer patients,” says Georges Mer, PhD, a Mayo Clinic structural biologist and biochemist who is the lead author of the paper. “But no one knows if these mutations, or variants of unknown significance, are cancer-predisposing or not because we do not know whether the variants are located in a region of BRCA1-BARD1 that is important for function. Now because we can see how BRCA1-BARD1 works, we have a good idea of what regions of BRCA1-BARD1 are important for function.”
DNA and histone protein complex
In a cell, the complex of DNA and histone proteins are complexed into chromatin and packaged into nucleosomes. DNA damage response proteins need to access chromatin to repair damaged DNA. BRCA1-BARD1 contributes to fixing broken DNA strands, which helps in the maintenance and survival of cells. But it is also a function that could possibly be blocked or inactivated if this is a strategy a cancer cell uses to survive chemotherapy.
“We used two techniques―cryo-electron microscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy―to understand at near-atomic resolution how BRCA1-BARD1 associates with the nucleosome, the repeating unit of chromatin, and how BRCA1-BARD1 modifies chromatin,” explains Mer.
In cryo-electron microscopy, purified BRCA1-BARD1 bound to nucleosomes, together referred to as macromolecules, are flash-frozen then imaged using an electron microscope. The macromolecules are oriented in various ways within the sample, so a computer program evaluates all the orientation data to create a 3D structure. Mer and his team also examined BRCA1-BARD1 nucleosome complexes with nuclear magnetic resonance spectroscopy, which uses a strong magnet to probe the relative positions of atoms within macromolecules. Using these imaging tools, the scientists could visualize BRCA1-BARD1 in action and uncover a new function of the complex.
“We showed how BRCA1-BARD1 attaches ubiquitin to the nucleosome, but we also determined that BRCA1-BARD1 recognizes ubiquitin already attached to the nucleosome, which serves as a signal for broken DNA,” says Mer. “We discovered an unexpected cross-talk by which ubiquitin recognition by BRCA1-BARD1 enhances its ubiquitin attachment activity, and this helps us better understand how BRCA1-BARD1 performs its function.”
The researchers created a video from the cryo-electron microscopy data to show where the protein complex interacts with the nucleosome.
Mer and his team expect that high-resolution images of BRCA1-BARD1 can help guide patient care and future treatment of cancer in two ways: classifying variants of unknown significance and directing drug development with more accuracy.
“With these 3D structures, we should be able to convert several variants of unknown significance to likely cancer-predisposing variants,” says Mer. “This work is also expected to have an impact on drug development in the long term because the 3D structures of BRCA1-BARD1 in complex with the nucleosome we generated may help in the design of small molecules that could, for example, inactivate BRCA1-BARD1.”
Da:
https://www.genengnews.com/news/cryo-em-advances-breast-and-ovarian-cancer-research/
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