L'inibizione dell'infiammazione blocca la morte retinica in modelli animali di cecità incurabile / Inhibiting Inflammation Blocks Retinal Death in Animal Models of an Untreatable Blindness
L'inibizione dell'infiammazione blocca la morte retinica in modelli animali di cecità incurabile / Inhibiting Inflammation Blocks Retinal Death in Animal Models of an Untreatable Blindness
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
In alcuni pazienti, nelle fasi avanzate della degenerazione maculare senile (AMD), le regioni della retina si consumano, determinando una "geografia dell'atrofia" che crea un punto cieco in graduale espansione nel campo visivo.
In un nuovo studio, gli scienziati dell'Università della Virginia, School of Medicine, mostrano DNA complementare trascritto inversamente da RNA non codificante chiamato retrotrasposoni Alu - elementi di DNA ripetitivi che comprendono oltre il 10% del genoma umano - si accumulano nella parte posteriore dell'occhio sotto la retina, nell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Questi cDNA Alu innescano l'attivazione dell'inflammasoma, un complesso multiproteico del sistema immunitario innato nel citosol cellulare che innesca l'infiammazione, causando la condizione patologica non trattabile chiamata atrofia geografica.
In uno studio precedente, i ricercatori avevano dimostrato che l'RNA di Alu induce l'attivazione dell'inflammasoma che porta alla morte cellulare nell'RPE. In uno studio più recente hanno dimostrato che l' RNA di Alu è retrotrascritto nel citosol. Nell'attuale studio riportato nell'articolo Science Advances , "Il DNA complementare di Alu è arricchito nella degenerazione maculare atrofica e innesca la tossicità dell'epitelio pigmentato retinico tramite l'immunità innata citosolica ", il gruppo mostra che il cDNA di Alu attiva anche l'inflammasoma per indurre la morte cellulare nell'atrofia geografica.
I risultati stabiliscono un nuovo percorso molecolare nella fisiopatologia dell'atrofia geografica e forniscono un razionale per i test clinici di farmaci inibitori dell'inflammasoma per questa forma di cecità non trattabile.
Jayakrishna Ambati, MD, professore di oftalmologia presso l'Università della Virginia e autore senior dello studio, afferma: "Decine di studi clinici per l'atrofia geografica non hanno avuto successo. Quasi tutti questi studi hanno preso di mira la via del complemento. Tuttavia, l'atrofia geografica è una malattia multifattoriale in cui sono presenti un eccesso di più sostanze tossiche tra cui alluminio, beta-amiloide, complemento e ferro. Riteniamo che un approccio diverso, mirato a un percorso comune finale [attivazione dell'inflammasoma], abbia maggiori probabilità di avere successo nell'atrofia geografica".
Meccanismi atrofici
In individui giovani sani, un enzima chiamato DICER1 tiene sotto controllo i livelli di ripetizioni di Alu, fungendo da scudo protettivo per l'RPE. Sfortunatamente, i livelli di DICER1 diminuiscono con l'età.
“Nell'atrofia geografica, livelli ridotti di DICER1 portano all'accumulo di Alu RNA. Mostriamo che l'accumulo di Alu RNA porta alla formazione di cDNA di Alu tramite l'attività della trascrittasi inversa L1 ", afferma Ambati.
Infatti, Alu cDNA è più tossico per l'RPE rispetto all'Alu RNA. “Ciò potrebbe riflettere inefficienze stechiometriche nella trascrizione inversa di Alu RNA. Inoltre, è ipotizzabile che una parte del pool di Alu RNA non incontri la trascrittasi inversa", spiega Ambati.
Come parte del meccanismo scoperto nello studio, i ricercatori mostrano che Alu cDNA attiva un enzima di rilevamento del DNA chiamato cGAS per innescare la fuga del DNA mitocondriale nel citosol della cellula. Questo, a sua volta, amplifica il cGAS in un ciclo di feedback e innesca l'inflammasoma, con conseguente degenerazione dell'RPE.
Il meccanismo che innesca la lesione iniziale dell'RPE ed il meccanismo mediante il quale l'atrofia delle cellule dell'RPE si diffonde in modo centrifugo, portando con sé la retina sovrastante e determinando una visibile "geografia dell'atrofia" è rimasto un mistero di vecchia data.
Maria Grant, MD, del Dipartimento di oftalmologia e scienze visive dell'Università dell'Alabama a Birmingham, che non è coinvolta nello studio attuale, afferma: "Studiando meticolosamente campioni di occhi umani e identificando il cDNA di Alu endogeno come arricchito nel bordo d'attacco attivo della lesione in crescita, questo straordinario lavoro fornisce una potenziale risposta a questa domanda”.
"Anche se non lo sappiamo per certo, riteniamo che la lesione iniziale sia una combinazione del guasto del sistema che accompagna l'invecchiamento e l'accumulo di varie molecole tossiche", afferma Ambati. “L'eziologia della diffusione centrifuga è ben studiata ma poco compresa. La nostra scoperta che il cDNA di Alu tossico è arricchito all'inizio della lesione in crescita negli occhi dell'atrofia geografica umana, fornisce un forte indizio che questa sostanza tossica è coinvolta nell'espansione centrifuga della degenerazione.
Andrew Dick, FMedSci, professore di oftalmologia, Università di Bristol, Regno Unito, che non è coinvolto nello studio attuale, afferma: "L'attivazione terminale dell'inflammasoma è sempre stata un enigma sul fatto che questo sia fondamentale per la degenerazione dell'RPE nell'AMD o geografica. Questo lavoro va a supportare questa atrofia, almeno sperimentalmente, dimostrando i meccanismi del ruolo dell'Alu RNA e dell'attivazione dell'inflammasoma. L'implicazione per l'AMD è significativa laddove la dimostrazione nell'uomo e nei roditori dell'arricchimento del cDNA di Alu e dell'attivazione dell'inflammasoma tramite cGAS apre strade terapeutiche.
Carl Schmid, PhD, professore emerito, Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, College of Biological Sciences dell'UC Davis, che non è coinvolto nello studio, afferma: "Ricordando che le ripetizioni Alu e L1 sono ampiamente considerate come DNA spazzatura, questa attività deleteria potrebbe derivare da una funzione altrimenti normale andata storta o dal semplice rischio che tali retrotrasposoni comportano. Gli autori mostrano che l'RNA endogeno L1 e il cDNA di Alu si accumulano all'interno dell'RPE degli occhi dell'Atrofia Geografica umana, implicandoli direttamente nella degenerazione maculare e dimostrano inoltre un percorso specifico attraverso il quale il cDNA di Alu promuove la degenerazione dell'RPE. Di particolare importanza, le loro nuove scoperte in biologia molecolare avanzano ipotesi verificabili per il trattamento di questa malattia dell'occhio”.
Come parte dello studio, gli autori sviluppano un nuovo metodo che chiamano "equator blotting" per rilevare e dimensionare il cDNA di Alu extracromosomico. “Abbiamo coniato questo termine perché presenta aspetti delle procedure di Northern e Southern blotting, utilizzate rispettivamente per studiare l'RNA e il DNA genomico. L'Equator blot è come un Southern blot in quanto sonda una sequenza di DNA bersaglio. Tuttavia, non comporta la digestione restrittiva del DNA perché vogliamo determinare la dimensione delle specie di DNA, che è importante per stabilire che il cDNA di Alu non è genomico e non è incorporato. Piuttosto, il DNA viene separato senza subire digestione enzimatica prima dell'ibridazione, come il Northern blotting", afferma Ambati.
Trattamenti di monitoraggio
Verso lo sviluppo di un trattamento per questa patologia intrattabile, i ricercatori dimostrano che gli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTI) approvati dalla FDA e i loro derivati alchilati (Kamuvudine) inibiscono l'attivazione dell'inflammasoma indotta dal cDNA di Alu, bloccando efficacemente la degenerazione retinica.
Gli NRTI tossici inibiscono sia la trascrizione inversa di Alu RNA nel cDNA citoplasmatico di Alu che l'attivazione dell'inflammasoma, mentre le Kamuvudine, più sicure, inibiscono l'attivazione dell'inflammasoma ma non la trascrizione inversa dell'Alu RNA.
Grant afferma: "Questo lavoro mostra che gli inibitori dell'inflammasoma a piccole molecole chiamati Kamuvudines hanno bloccato gli effetti tossici dell'Alu cDNA. Sarebbe interessante testare questi farmaci negli studi clinici per l'atrofia geografica perché, al momento, non esiste un trattamento per questa malattia devastante".
Ambati ed il suo gruppo hanno scelto di prendere di mira l'inflammasoma piuttosto che i punti a monte del percorso con conseguente atrofia geografica, come il trasporto di cDNA di Alu a cGAS o rilascio mediato da cGAS di DNA mitocondriale.
Giustificando la logica alla base di questo approccio, Ambati afferma: "Alu cDNA causa la degenerazione dell'RPE tramite il sensore di DNA cGAS. Tuttavia, ci sono altre sostanze tossiche come beta-amiloide, complemento e ferro, che svolgono anche un ruolo nell'atrofia geografica. Pertanto, riteniamo che le Kamuvudine che bloccano l'attivazione dell'inflammasoma indotta da queste varie sostanze tossiche siano un approccio terapeutico razionale per bloccare questo assalto su più fronti.
"L'attrazione dei dati che mostrano NRTI o derivati bloccano la morte dell'RPE indotta dal cDNA di Alu e l'attivazione dell'inflammasoma terminale, domande su quando durante l'AMD o l'atrofia geografica si inizia a considerare di riutilizzare l'uso di NRTI se si prende di mira questo percorso. Data la lenta progressione dell'atrofia geografica, rimane senza risposta quale protezione sia operativa per prevenire una perdita di RPE più evidente, acuta o subacuta durante la diffusione atrofica geografica. Tuttavia, i loro dati sono convincenti", afferma Dick.
Ambati concorda sul fatto che la progressione dell'atrofia geografica è davvero lenta, a partire dalla metà della periferia della retina e si irradia verso l'esterno per inghiottire il centro della retina per un periodo da 2 a 2,5 anni. “Sappiamo dal nostro precedente articolo che l'attivazione dell'inflammasoma è evidente negli occhi umani in questa fase dell'atrofia geografica. Pertanto, lo studio clinico pianificato arruolerà pazienti che presentano fasi iniziali di atrofia geografica, che non coinvolgono il centro della retina. L'obiettivo del trattamento con Kamuvudine è arrestare o ridurre la velocità di progressione della malattia. Questa è stata la strategia tipica della maggior parte degli studi clinici fino ad oggi con altri candidati farmaci”.
James Rosenbaum, MD, professore di oftalmologia, Oregon Health & Science University, che non è coinvolto nello studio, afferma: "I limiti di questo lavoro includono la dipendenza da modelli animali ed in vitro e l'estrapolazione dall'atrofia geografica, una forma molto grave di maculare degenerazione, alla degenerazione maculare in generale. Il laboratorio Ambati ha anche precedentemente implicato una forma di amiloide come causa di un risultato simile. Nonostante queste limitazioni, un nuovo approccio alla degenerazione maculare secca sarebbe un importante progresso clinico, quindi questa è una gradita aggiunta alla comprensione di questa malattia potenzialmente accecante».
Guardando avanti
Inflammasome Therapeutics, una società privata con sede a Newton, nel Massachusetts, fondata da Ambati e Paul Ashton, PhD, ha concesso in licenza Kamuvudines ed è pronta a iniziare gli studi clinici il prossimo anno.
Ambati afferma: “Perseguiremo ogni opportunità per accelerare lo sviluppo di Kamuvudines. Gli studi clinici di fase III per l'atrofia geografica durano in genere per 12-24 mesi. Ovviamente dovremo dimostrare sicurezza ed efficacia, ma la cosa grandiosa di Kamuvudines è che mentre il processo di sperimentazione clinica potrebbe non essere più veloce, possiamo essere più sicuri del risultato a causa delle analisi del database dell'assicurazione sanitaria che mostrano che l'uso di NRTI è associato alla protezione contro la malattia nelle persone”.
Grant afferma: "Scoprendo l'esistenza di Alu cDNA endogeno in una malattia umana, questo lavoro solleva l'intrigante domanda se potrebbe svolgere un ruolo anche in altre malattie in cui l'attività della trascrittasi inversa è potenziata".
L'elenco delle malattie infiammatorie è lungo e variegato e comprende malattie come l'Alzheimer, la sclerosi multipla e il morbo di Parkinson. L'obiettivo efficace dell'infiammazione per controllare il progresso della degenerazione maculare legata all'età può lanciare strategie terapeutiche analoghe per altre malattie in cui l'infiammazione è l'effettore terminale che guida la progressione della malattia.
ENGLISH
In some patients, at advanced stages of age-related macular degeneration (AMD), regions of the retina waste away, resulting in a “geography of atrophy” that creates a gradually expanding blind spot in the visual field.
In a new study, scientists at the University of Virginia, School of Medicine show complementary DNA reverse transcribed from noncoding RNA called Alu retrotransposons—repetitive DNA elements that comprise over 10% of the human genome—pile up in the back of the eye under the retina, in the retinal pigmented epithelium (RPE). These Alu cDNAs trigger the activation of the inflammasome—a multiprotein complex of the innate immune system in the cell cytosol that triggers inflammation—causing the untreatable pathological condition called Geographic Atrophy.
In an earlier study, the researchers had shown Alu RNA induces inflammasome activation leading to cell death in the RPE. In a more recent study they showed Alu RNA is reverse transcribed in the cytosol. In the current study reported in Science Advances article, “Alu complementary DNA is enriched in atrophic macular degeneration and triggers retinal pigmented epithelium toxicity via cytosolic innate immunity,” the team shows Alu cDNA also activates the inflammasome to induce cell death in Geographic Atrophy.
The findings establish a new molecular pathway in the pathophysiology of Geographic Atrophy and provide a rationale for clinical testing of inflammasome-inhibiting drugs for this untreatable form of blindness.
Jayakrishna Ambati, MD, Professor of Ophthalmology at the University of Virginia and senior author on the study says, “Dozens of clinical trials for Geographic Atrophy have not succeeded. Nearly all these trials have targeted the complement pathway. However, Geographic Atrophy is a multifactorial disease where an excess of multiple toxic substances including Alu, amyloid-beta, complement, and iron are present. We believe a different approach—one that targets a final common pathway [inflammasome activation]—is more likely to be successful in Geographic Atrophy.”
Atrophic mechanisms
In healthy young individuals, an enzyme called DICER1 keeps the levels of Alu repeats in check, acting as a protective shield for the RPE. Unfortunately, DICER1 levels decline with age.
“In Geographic Atrophy, reduced levels of DICER1 lead to accumulation of Alu RNA. We show Alu RNA accumulation leads to Alu cDNA formation via L1 reverse transcriptase activity,” says Ambati.
In fact, Alu cDNA is more toxic to the RPE than Alu RNA. “This might reflect stoichiometric inefficiencies in reverse transcription of Alu RNA. In addition, it is conceivable that some fraction of the pool of Alu RNA does not encounter reverse transcriptase,” explains Ambati.
As part of the mechanism uncovered in the study, the researchers show Alu cDNA engages a DNA sensing enzyme called cGAS to trigger the escape of mitochondrial DNA into the cell’s cytosol. This, in turn, amplifies cGAS in a feedback loop and triggers the inflammasome, resulting in the degeneration of the RPE.
The mechanism that triggers the initial RPE lesion and the mechanism by which the atrophy of RPE cells spreads centrifugally, taking along with it the overlying retina and resulting in a visible “geography of atrophy” has remained a longstanding mystery.
Maria Grant, MD, from the Department of Ophthalmology and Visual Science at the University of Alabama at Birmingham, who is not involved in the current study, says “By meticulously studying human eye specimens and identifying endogenous Alu cDNA as enriched in the active leading edge of the growing lesion, this stunning work provides a potential answer to this question.”
“Although we don’t know for certain, we believe that the initial lesion is a combination of the systems failure that accompanies aging coupled with accumulation of various toxic molecules,” says Ambati. “The etiology of centrifugal spread is well studied but poorly understood. Our finding that toxic Alu cDNA is enriched at the leading edge of the growing lesion in human Geographic Atrophy eyes, provides a strong clue that this toxic substance is involved in the centrifugal expansion of the degeneration.”
Andrew Dick, FMedSci, professor of Ophthalmology, University of Bristol, U.K., who is not involved in the current study says, “The terminal activation of the inflammasome has always been an enigma as to whether this is pivotal to RPE degeneration in AMD or Geographic Atrophy. This work goes toward supporting this, at least experimentally, by demonstrating mechanisms of the role of Alu RNA and inflammasome activation. The implication for AMD is significant where demonstrating in human and rodent the enrichment of Alu cDNA and inflammasome activation via cGAS opens therapeutic avenues.”
Carl Schmid, PhD, professor emeritus, Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Sciences at UC Davis, who also is not involved in the study says, “Remembering that Alu and L1 repeats are widely regarded as junk DNA, this deleterious activity might result from an otherwise normal function gone awry or from the simple risk that such retrotransposons pose. The authors show endogenous L1 RNA and Alu cDNA accumulate within the RPE of human Geographic Atrophy eyes, thereby, directly implicating them in macular degeneration and they further demonstrate a specific pathway by which Alu cDNA promotes RPE degeneration. Of special significance, their novel findings in molecular biology advance testable hypotheses for treating this eye disease.”
As part of the study, the authors develop a new method they call “equator blotting” to detect and size extrachromosomal Alu cDNA. “We coined this term because it has aspects of both northern and Southern blotting procedures, which are used to study RNA and genomic DNA, respectively. Equator blotting is like a Southern blot in that it probes for a target DNA sequence. However, it does not involve restriction digestion of the DNA because we want to determine the size of the DNA species, which is important in establishing that Alu cDNA is non-genomic and non-embedded. Rather, the DNA is separated without undergoing enzymatic digestion prior to hybridization, like northern blotting,” says Ambati.
Tracking Treatments
Toward developing a treatment for this intractable pathology, the researchers demonstrate that FDA-approved nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) and their alkylated derivatives (Kamuvudines) inhibit Alu cDNA-induced activation of the inflammasome, effectively blocking retinal degeneration.
Toxic NRTIs inhibit both the reverse transcription of Alu RNA into cytoplasmic Alu cDNA and inflammasome activation while the safer Kamuvudines, inhibit inflammasome activation but not the reverse transcription of Alu RNA.
Grant says, “This work shows that small-molecule inflammasome inhibitors called Kamuvudines blocked the toxic effects of Alu cDNA. It would be interesting to test these drugs in clinical trials for Geographic Atrophy because, at present, there is no treatment for this devastating disease.”
Ambati and his team chose to target the inflammasome rather than upstream points of the pathway resulting in Geographic Atrophy, such as the transport of Alu cDNA to cGAS or cGAS mediated release of mitochondrial DNA.
Justifying the rationale behind this approach, Ambati says, “Alu cDNA causes RPE degeneration via the DNA sensor cGAS. However, there are other toxic substances such as amyloid-beta, complement, and iron, which also play a role in Geographic Atrophy. Therefore, we believe that Kamuvudines which block inflammasome activation induced by these various toxic substances are a rational therapeutic approach to block this multipronged assault.”
“The enticement of data showing NRTIs or derivatives block Alu cDNA induced RPE death and terminal inflammasome activation, questions when during AMD or Geographic Atrophy do you start considering repurposing NRTI use if targeting this pathway. Given the slow progression of Geographic Atrophy, what protection is operative to prevent a more evident, acute, or subacute RPE loss during geographic atrophic spread remains unanswered. Their data nevertheless is compelling,” says Dick.
Ambati agrees that the progression of Geographic Atrophy is indeed slow, starting in the mid-periphery of the retina and radiating outward to engulf the center of the retina over a 2-to-2.5-year period. “We know from our earlier paper that inflammasome activation is evident in human eyes at this stage of Geographic Atrophy. Therefore, the planned clinical trial will enroll patients who have early stages of Geographic Atrophy, not involving the center of the retina. The goal of Kamuvudine treatment is to stop or reduce the rate of progression of the disease. This has been the typical strategy of most clinical trials to date with other drug candidates.”
James Rosenbaum, MD, professor of ophthalmology, Oregon Health & Science University who is not involved in the study says, “Limitations of this work include the reliance on animal and in vitro models and the extrapolation from Geographic Atrophy, a very severe form of macular degeneration, to macular degeneration in general. The Ambati lab has also previously implicated a form of amyloid as a cause of a similar result. Despite these limitations, a novel approach to dry macular degeneration would be a major clinical advance so this is a welcome addition to the understanding of this potentially blinding disease.”
Looking ahead
Inflammasome Therapeutics, a private company in Newton, Massachusetts founded by Ambati and Paul Ashton, PhD, has licensed Kamuvudines and is poised to start clinical trials next year.
Ambati says, “We will pursue every opportunity to accelerate the development of Kamuvudines. Phase III clinical trials for Geographic Atrophy typically run for 12–24 months. We will, of course, have to demonstrate safety and efficacy, but the great thing about Kamuvudines is that while the clinical trial process may not be faster we can be more confident about the outcome because of the health insurance database analyses showing that NRTI use is associated with protection against the disease in people.”
Grant says, “By discovering the existence of endogenous Alu cDNA in a human disease, this work raises the intriguing question of whether it might also be playing a role in other diseases where reverse transcriptase activity is enhanced.”
The list of inflammatory diseases is long and varied and includes diseases such as Alzheimer’s, Multiple Sclerosis, and Parkinson’s disease. Successful targeting of inflammation to check the progress of age-related macular degeneration may launch analogous therapeutic strategies for other diseases where inflammation is the terminal effector that drives disease progression.
Da:
https://www.genengnews.com/insights/inhibiting-inflammation-blocks-retinal-death-in-animal-models-of-an-untreatable-blindness/?fbclid=IwAR3cuTf9g-1tCBqJmIU9f5QizYiy7EYslsKO7vwWNZrF2eYDdZyJ7pMM7aw
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