Engineering chimeric antigen receptor-natural killer cells for cancer immunotherapy / Ingegnerizzazione di cellule killer naturali del recettore dell'antigene chimerico per l'immunoterapia del cancro

 Engineering chimeric antigen receptor-natural killer cells for cancer immunotherapy / Ingegnerizzazione di cellule killer naturali del recettore dell'antigene chimerico per l'immunoterapia del cancro

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Structures of first- to fourth-generation chimeric antigen receptors. CM: Costimulatory molecule; ITAM: Immunoreceptor tyrosine-based activation motif; SCFV: Single-chain variable fragment; TM: Transmembrane / Strutture dei recettori per l'antigene chimerico di prima e quarta generazione. CM: Molecola costimolatoria; ITAM: Motivo di attivazione basato sulla tirosina degli immunorecettori; SCFV: Frammento variabile a catena singola; TM: Transmembrana

Adoptive cell transfer has attracted considerable attention as a treatment for cancer. The success of chimeric antigen receptor (CAR)-engineered T (CAR-T) cells for the treatment of haematologic tumors has demonstrated the potential of CAR. In this review, we describe the current CAR-engineered natural killer (CAR-NK) cell construction strategies, including the design principles and structural characteristics of the extracellular, transmembrane and intracellular regions of the CAR structure. In addition, we review different cellular carriers used to develop CAR-NK cells, highlighting existing problems and challenges. We further discuss possible ways to optimize CAR from the perspective of the tumor microenvironment to harness the strength of CAR-NK cells and provided rationales to combine CAR-NK cells with other treatment regimens to enhance antitumor effects.

A chimeric antigen receptor (CAR), originally proposed by Gross et al. is a structure that is used to reconstruct autogeneic T cells, generating CAR-T cells that can be successfully used for the treatment of patients with hematological tumors, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), Hodgkin’s lymphoma and non-Hodgkin’s lymphoma, and other B lymphomas. Although CAR-T have demonstrated great efficacy against these hematological tumors, they also have many limitations. For example, CAR-T therapy requires pretreatment of the patient, primarily through chemotherapy and irradiation, and the quality of the pretreatment directly affects the efficacy. After infusion of CAR-T, patients are prone to adverse reactions, such as the cytokine storm and graft-versus-host disease (GVHD), both of which can be life threatening in severe cases. In addition, the construction of CAR-T requires the collection of autologous T cells from the patient’s own peripheral blood (PB), thus limiting their broader clinical application. Some heavily treated patients are not even suitable for this produce because of immune toxicity caused by intensive chemotherapy or radiation. Above all, the major challenge is that the outcome of CAR-T treatment of solid tumors is not satisfactory. Therefore, researchers have been motivated to modify innate immune cells, especially natural killer (NK) cells, to develop CAR-engineered NK cells (CAR-NK) for cancer immunotherapy. The most significant promise of CARNK cells that is not provided by CAR-T is that they might provide an over-the-counter cellular immunotherapy product and improve the survival rate of patients with refractory solid tumors. Because the killing of NK cells is not dependent on matching human leukocyte antigen (HLA), allogeneic CAR-NK cells can be generated from different sources, such as PB, umbilical cord blood cells (CB), induced pluripotent stem cells (iPSCs) and even NK cell lines, thus having broad applications for different malignancies. The primary mechanism by which tumor cells escape CAR-T-cell therapy is the loss of the targeted antigen. Although the CAR-restricted killing is shared by both CAR-T and CAR-NK cells, allogeneic CAR-NK cells may be less susceptible to this inhibitory mechanism because they can kill target cells through mechanisms other than CAR, such as various specific natural cytotoxicity receptors (NCRs), including NKG2D, NKP30, NKP44 and NKP46, as well as through antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Notably, allogeneic CAR-NK cells do not match the patient’s HLA, and thus, they can escape interference by inhibitory signals mediated by the ‘self’ HLA molecules expressed on tumor cells. Moreover, CAR-NK cells are safer for clinical use compared with CAR-T cells. CAR-NK cells have a shorter lifespan after infusion and, therefore, do not persist in the circulation for long periods of time, reducing ontarget/off-tumor toxicity, which is a significant concern for the use of CAR-T cells. For instance, CD19-targeting CAR-T cells can cause profound and long-lasting B-cell deficiencies due to persistent CAR-T activity against normal mature and progenitor B cells. On the other hand, the shorter lifespan of NK cells may limit their efficacy in vivo. Recent studies have demonstrated that cytokines such as interleukin IL-12, IL-15 and IL-18 can induce the differentiation of memory-like NK cells, with enhanced persistent proliferation and antitumor capacity. Consistently, human cord blood NK cells, expressing the CD19-specific CAR gene and IL-15 gene, were able to survive for several months and effectively kill tumor cells in a lymphoma mouse model. Compared with CAR-T cells, which can function for up to several years after treatment, these memory-like CAR-NK cells, which live for several months, will be unlikely to cause significant on-target/off-tumor toxicity. In addition, activated NK cells predominately release IFN-γ and GM-CSF, which can promote continuous killing of one target to another without producing excessive pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-1 and IL-6. These pro-inflammatory cytokines are implicated in the cytokine storm observed with the use of CAR-T cells. In addition to NK cells, other innate immune cells, such as NKT and γδT cells, which possess unique features, can be engineered to express CAR. Preclinical trials have also demonstrated the effectiveness and feasibility of using CAR-NKT and CAR-γδT cells. In this review, we mainly outline the recent advances in the development of CAR-NK cells, focusing on CAR constructs, cellular carriers and strategies to enhance CAR-NK-mediated immunotherapy. Structure & construction of CAR The structure of CARs used in CAR-T cells has evolved for four generations. As shown in Figure 1, the CAR structure is mainly composed of an extracellular single-chain variable fragment (scFv) derived from an antibody against a tumor antigen, a transmembrane domain (TM), and an intracellular signaling domain (ICD). The intracellular structure of the first generation contains only a CD3ζ chain. That of the second generation contains CD3ζ chains and one costimulatory molecule, such as CD28, 4-1BB, CD134 (OX40), or an inducible T-cell costimulator (ICOS), to enhance cytotoxicity and proliferative activity. That of the third generation contains a CD3ζ chain and two or more different costimulatory molecules. The fourth generation of CAR refer to those designs that allow the expression of cytokines or costimulatory ligands upon T-cell activation mediated by the CAR. For example, by using a nuclear factor of the activated T-cell (NFAT)-responsive promoter to drive an IL-12 gene in CAR-T cells (Figure 1), CAR engagement and subsequent T-cell activation induced promoter activity and finally IL-12 production and release. IL-12 improved CAR-T activation, modified the tumor microenvironment, and augmented the antitumor effects of CAR-T therapy in orthotopic human ovarian mouse models. In view of the cytokine storm that occurs during the application of CAR-T, a suicide gene can be inserted into the new generation of CAR to add a controllable switch to the cells, so that when the risk of death occurs, a relevant drug can be used to induce apoptosis in time to terminate treatment. Although CAR-NK cells share the same construction strategy as CAR-T, certain aspects have been modified to better suit the NK cells. The CAR-NK cell designs in recent years are described below. 

Extracellular domain 

The extracellular region mainly refers to the scFv for the tumor-specific antigen, that is, the VH and LH of the antibody, which are connected by a linker. Currently, many CAR-NK cell assays have been developed against different tumor antigens, such as the B-cell acute and chronic leukemia targets CD19 and CD20, the breast cancer target HER2, the neuroblastoma and melanoma target GD2, the multiple myeloma target CD138, the T-cell lymphoma target CD4, and EGFR, which is frequently overexpressed in various solid tumors. In addition, some researchers have focused on certain immunosuppressive cells of the human body, such as M2 macrophages and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), to design CAR-NK cells targets for these cells, which enhances the efficacy of other tumor killing strategies by eliminating inhibitory cells. Moreover, researchers have also attempted to construct a bispecific CAR structure, that is, an extracellular scFv that can recognize two antigens. The structures of the bispecific CARs shown in Figure 2A, 2B and 2C have the advantage of high sensitivity. Many tumor cells express a variety of tumor-associated antigens (TAA). Such CARs can effectively kill target cells, and to a certain extent, avoid immune escape induced by tumor tolerance. However, the disadvantages of such CARs are reduced specificity and damage to certain normal tissues that express one of the antigens. On this basis, researchers developed a fourth structure shown in Figure 2D. Since the activation of T cells requires two signals, only when both scFvs bind to the corresponding antigens can the CAR structure be fully activated to kill target cells. However, this design may not apply to NK cells. Studies have shown that when this type of CAR is engrafted on the NK92 cells, the association of the antigen with the one containing a costimulatory domain alone can activate the CAR structure in vitro, without requiring an association of the antigen with the one containing the CD3ζ domain. The costimulatory domain in this construct consists of CD28 and CD244, and CD244 may be the molecule that plays a key role, which will be discussed later. In addition to using scFv as the extracellular region of CAR-NK cells, some different design ideas have been proposed, such as the use of NKG2D as an extracellular region. This design has been applied in both CAR-T and CAR-NK cells and is based on the knowledge that NKG2D ligands are upregulated in a variety of tumor cells as well as on the surface of MDSCs, which are readily recruited by solid tumors. Since NKG2D activation of NK cells requires interaction with DAP10 protein, researchers have constructed the NKG2D-DAP10-CD3ζ structure in human peripheral blood NK cells and T cells, which demonstrated good efficacy in mouse models of osteosarcoma.

 Transmembrane domain 

Most of the CAR-NK structures contain a transmembrane domain derived from CD8a, CD28 or CD3; some special ones are from NKG2D. It is currently believed that the transmembrane domain has little impact on the overall structure. Alabanza et al. compared different transmembrane domains in CAR-T cells. They used two different scFvs targeting CD19 and two different transmembrane domains from either CD8a or CD28, and they designed four CAR structures in human peripheral blood T cells. The results showed that although the two transmembrane domains were not significantly different in their ability to eliminate human primary chronic lymphocytic leukemia cells in mice, in both CD4+ and CD8+ T cells, degranulation and release of cytokines by CAR-T using CD28 as the transmembrane domain were higher than in those using CD8a as the transmembrane domain. Guedan et al. demonstrated that the effect of the ICOS intracellular signaling domain was better than that of CD28 in CAR-T cells, as indicated by enhanced CAR-T persistence and tumor killing in mice, and additional findings suggested that the unique transmembrane region of ICOS was the key, rather than the cytoplasmic domains. Furthermore, combining ICOS and 4-1BB intracellular signaling domains in a thirdgeneration CAR-T targeting mesothelin-expressing human cancer cell lines displayed superior antitumor effects in xenograft models. Interestingly, the ICOS intracellular signaling domain must be positioned proximal to the cell membrane and linked to the ICOS transmembrane domain. Therefore, this information suggests that the transmembrane region of CAR-NK cells may contain unrecognized features that await further exploration. 

Intracellular signaling domain 

As the key component of the functional structure, the importance of the intracellular signaling region is self-evident. Most CAR-NK cells use CD3ζ as a signaling domain to conduct signal transduction and use the ITAM of CD3ζ to initiate NK cell killing. The CD3ζ dimer can transmit signals from CD16 and can thus contribute to ADCC. Moreover, similar to experiments with CAR-T, in the construction of CAR-NK cells, Schonfeld et al. also compared a variety of different intracellular signaling regions in NK-92 cells. The results showed that with only a single domain of CD3ζ, the CAR-NK92 cells could not effectively lyse ErbB2-expressing human tumor cells in vitro due to insufficient stimulatory signals. Therefore, more costimulatory domains are required, including the commonly used CD28, CD137 (4-1BB), or CD244 (2B4). Interestingly, both CD28 and CD137 are important costimulatory molecules that function during human T-cell activation even though neither CD28 nor CD137 is expressed in human NK cells, and the classical activation pathway of NK cells is not dependent on a costimulatory signal like they are in T cells. Therefore, why is the effect of a single CD3ζ not ideal, and what roles do CD28 and CD137 play in the activation of CAR-NK cells? These questions deserve an in-depth discussion for the construction of effective CAR. Studies have found that the stimulatory effect of the CD244 cytoplasmic domain in CAR-expressing NK92 cells is better than that of CD137 in vitro and in acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) xenograft mice. CD244 is a costimulatory molecule of NK cell activation and belongs to a receptor family related to lymphocyte activation signaling molecules. The cytoplasmic domain of CD244 contains an immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM), which can bind to lymphocyte activation signaling molecule (SLAM)-associated protein (SAP) and recruit and activate tyrosine kinases to initiate activation signals, which suggests that CD244 may be more suitable as an intracellular signaling domain in CAR-NK cells. Using an ovarian cancer xenograft model, Li et al. found that when CD244 and CD3ζ were simultaneously used as signaling domains, mutation of key amino acids of CD3ζ did not significantly affect the function of CAR; however, mutations in key amino acids of CD244 resulted in a tremendous impact on the killing effect of human iPSC-derived CAR-NK cells. These results evoke questions of whether CD244 can replace CD3ζ as the intracellular region of CAR-NK cells, which awaits confirmation in future experiments. In addition to the use of CD244, Muller et al. have attempted to replace CD3ζ with DAP12 in CAR-expressing YTS-NK cells and evaluated their killing effect in glioblastoma xenografts. Compared with CD3ζ, however, the intracellular region of DAP12 contains only one ITAM structure. The results showed that DAP12 demonstrated a better effect than CD3ζ as a signaling domain, which can recruit and phosphorylate ZAP70, and then further phosphorylate downstream signals to mediate the CAR-NK cells killing effects. 

Figure 2. Bispecific CARs employed in CAR-T and CAR-NK cells. (A) Extracellular scFv is designed to target a common epitope of two different antigens, which allows CAR-modified cells to kill target cells expressing both antigens. (B) Two scFvs are linked together and can simultaneously target two different antigens. The binding of either antigen activates this CAR structure. (C) Two complete CAR structures are placed in parallel . (D) Two different scFvs are each connected to the costimulatory molecule and to CD3ζ . / CAR bispecifici impiegati nelle cellule CAR-T e CAR-NK. (A) scFv extracellulare è progettato per colpire un epitopo comune di due diversi antigeni, che consente alle cellule modificate con CAR di uccidere le cellule bersaglio che esprimono entrambi gli antigeni. (B) Due scFv sono collegati tra loro e possono mirare contemporaneamente a due diversi antigeni. Il legame di entrambi gli antigeni attiva questa struttura CAR. (C) Due strutture CAR complete sono poste in parallelo. (D) Due diversi scFv sono collegati ciascuno alla molecola costimolatoria e al CD3ζ.

Cell carriers used for CAR-NK cells 

Currently, commonly used cell carriers for CAR-NK development are human peripheral blood NK cells and the NK92 cell line. The two types of cells are compared below. From the perspective of timeliness and practicality of treatment, the NK-92 cell line is undoubtedly superior to human peripheral blood NK cells, and studies have shown that the levels of perforin, granzyme and a series of cytokines with killing effects produced by NK-92 cells are higher than those produced by peripheral blood NK cells. In addition to NK-92 cells, other NK cell lines were also used to express CAR. For example, Murakami et al. first attempted to construct a CAR structure targeting EGFRvIII using another human NK cell line, KHYG. The results showed that KHYG cells demonstrated similar cytotoxic effects as NK-92 cells in human glioblastoma xenografts. However, which of the two cell lines exhibits better and safer treatment effects awaits further verification. In recent years, stem cell-derived NK cells, including embryonic stem cells (ESCs), CB stem cells, and induced pluripotent stem cells (iPSCs), have also attracted substantial attention. Since embryonic stem cells are difficult to obtain and their applications have ethical concerns, they are used less frequently. CB can be stored frozen and its application is more convenient than that of embryonic stem cells. At present, some techniques have been developed that can greatly amplify CB-derived NK cells in a short period of time, and these cells showed significant in vivo activity against multiple myeloma in a xenogenic mouse model. iPSCs are a type of pluripotent stem cell that can be generated directly from adult cells, such as skin cells, and then induced to differentiate into NK cells. The iPSC-derived NK cells have advantages of both human peripheral blood NK cells and NK-92 cells, and standardized methods have been established for large-scale induction and amplification of NK-like cells in a short period of time. Moreover, these NK-like cells can express biological levels of killer activation receptors (KARs), and they express a low level of killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) compared with peripheral blood NK cells. Li et al. have successfully constructed a CAR structure in iPSC-derived NK cells. Compared with traditional CAR-T, ovarian cancer mouse models transplanted with the iPSC-derived CAR-NK cells showed a higher survival rate and fewer toxic side effects. However, it is worth noting that the same CAR structure may have different effects in differenT-cell carriers, which indicates that we cannot directly apply the CAR that is suitable for one type of carrier to another and must experimentally determine the most suitable CAR structures for different applications.

Figure 3. Chimeric antigen receptors modulate immune cell infiltration. It is difficult for NK cells or T cells to infiltrate the solid tumor microenvironment because of the presence of a large number of immunosuppressive cells. When NK cells or T cells are modified to express CAR and chemokine receptor genes, such as CXCR2 or CXCR4, which activates CXCR2/CXCL1/2 or CXCR4/CXCL12 axis, respectively, these cells may be able to enter tumor tissues in large numbers and exert a killing effect. MDSC: Myeloid-derived suppressor cell; NK: Natural killer; TAM: Tumor-associated macrophage. / I recettori chimerici dell'antigene modulano l'infiltrazione delle cellule immunitarie. È difficile per le cellule NK o le cellule T infiltrarsi nel microambiente del tumore solido a causa della presenza di un gran numero di cellule immunosoppressive. Quando le cellule NK o le cellule T vengono modificate per esprimere i geni del recettore CAR e delle chemochine, come CXCR2 o CXCR4, che attivano rispettivamente l'asse CXCR2/CXCL1/2 o CXCR4/CXCL12, queste cellule possono essere in grado di entrare nei tessuti tumorali in gran numero e esercitare un effetto letale. MDSC: Cellula soppressore di derivazione mieloide; NK: killer naturale; TAM: Macrofago associato al tumore.

Clinical trials using CAR-NK cells against various tumors 

Here, we list some ongoing clinical studies on CAR-NK cells. In these trials, the primary cell carrier is the NK-92 cell line. CARs were designed to target antigens that are known to be specific for various tumors, and the designs mainly adopted the first- or second-generation structure. In addition, more studies used CD137 rather than CD244 as the costimulatory molecule, which we previously discussed. It is worth mentioning that in clinical study NCT03056339, Rezvani et al. adopted a TRUCKS-like strategy to design the CAR, adding the IL-15 gene to enhance the antitumor activity of CB derived CAR-NK cells. To improve the safety, they took advantage of an inducible caspase-9 suicide gene, whose expression can be turned on using a specific chemical inducer of dimerization. 

Future perspective 

In tumor immunotherapy, the tumor microenvironment is an essential factor that must be taken into account. Although NK cells might be more effective in attracting solid tumors than T cells, their infiltration can be blocked by a tumor microenvironment that is composed of various inhibitory factors. Therefore, enabling better infiltration of NK cells into the solid tumor and overcoming the inhibition of the tumor microenvironment are crucial for their antitumor activity. By inducing a permissive tumor microenvironment for immune cell infiltration, we could greatly improve the efficacy of CAR-NK treatment for solid tumors. For example, CXCL12 has been proven to be abundant in the tumor microenvironment, and it can recruit CXCR4+ regulatory T cells and MDSCs into solid tumors, promoting immune suppression and tumor progression. CXCL1 and CXCL2 are highly expressed by breast cancer cells, leading to increase infiltration of CXCR2+ pro-tumorigenic myeloid cells. Thus, we may be able to improve the infiltration of CAR-NK cells by modifying NK cells to express CAR and the receptor of chemokine that are elevated in the tumor microenvironment (Figure 3). Moreover, in the tumor microenvironment, the inhibitory effect of cytokines such as TGF-β on immune cells cannot be ignored. It plays important roles in the differentiation of protumorigenic immune cells, such as regulatory T cells (Treg) and M2-like TAM. If CAR-NK cells are loaded with structures that enable secretion of the soluble receptors of these cytokines, which can competitively bind to TGF-β and then inhibit TGF-β activity, the suppression of various immune cells by the tumor microenvironment might be reinvigorated. In addition, the combination of CAR and other treatments is worth exploring. Here, we present some experiments using CAR-NK in combination with chemotherapeutic drugs, antibodies and nanomolecules. These studies mainly sought to increase the expression of the targeted antigen or to enhance the infiltration and function of CAR-T or CAR-NK cells. For instance, Chu et al. found that romidepsin significantly increased the expression of the NKG2D ligand MICA/B in Burkitt lymphoma cells and enhanced CAR-NK cytotoxic activity through the interaction between MICA/B and NKG2D in vitro and in vivo. Zhang et al. demonstrated that EpCAM-specific CAR-NK-92 cells combined with regorafenib, which enhanced the infiltration of CAR-NK-92 cells, could effectively kill tumor cells in a colorectal cancer murine model. Therefore, a rational design of the combination therapy strategy may be an important direction for future CAR-NK research. 

Conclusion

 It is undeniable that CAR-NK cell therapy has tremendous potential and feasibility as a new means of adoptive immunotherapy. However, many issues still need to be addressed, such as how to improve the transfection efficiency of CAR-NK cells, exploration of the optimal CAR structures, selection of the appropriate cell carriers, the best introduction point for combined treatments, and how to eliminate possible adverse reactions after application in humans. These are all concerns that need to be resolved before CAR-NK cells can be used in clinical practice. If these problems are resolved, it is believed that CAR-NK cells will become a powerful weapon against tumors.

Executive summary

Chimeric antigen receptor

 • Chimeric antigen receptor (CAR) structure was first used in T cells, and the constructed CAR-T have demonstrated a good effect in clinical treatment of hematological tumors. To further explore the antitumor potential of CAR, CAR-NK cells have been developed. CAR-NK cell structure 

• The extracellular domain is mainly composed of scFv that can bind to the target antigen and a hinge domain. As the starting point of signal transmission, the specificity and sensitivity of scFv directly determine the effects of the entire structure. Currently, there are two designs for scFv: mono-specificity and bi-specificity.

 • CD8a, CD28 and CD3ζ are commonly used for constructing the transmembrane domain, and it is generally believed that different transmembrane regions have little effect on the killing effect of CAR. 

• The intracellular region consists of costimulatory molecules and a signaling domain containing ITAM. The CAR-NK cells with costimulatory molecules demonstrate significantly higher cytotoxicity than CAR-NK cells without costimulatory molecules. This is an interesting phenomenon due to the finding that, unlike T cells, the activation of NK cells does not require two signals. The ITAM-containing signaling domain used by CAR-NK cells are mainly CD3ζ and DAP12. 

Cell carriers 

• Peripheral blood NK cells and the NK-92 cell line are the most commonly used cell carriers. In addition, NK cells derived from IPSCs also demonstrate great potential. It is worth noting that the same CAR is not necessarily suitable for all cell carriers. Determining the most suitable CAR according to the characteristics of different carriers is also a problem that needs to be resolved. Combined treatments 

• In existing studies, the combination of CAR-NK cells with other treatments shows a synergistic effect (1 + 1>2). For example, some drugs can enhance the activity of NK cells or can specifically upregulate specific antigens on the surface of target cells, thereby promoting a stronger killing effect of CARs against this antigen.

 Future perspective 

• The tumor microenvironment is a forbidden area for human immune cells such as T cells and NK cells. The various inhibitory factors located there prevent the massive infiltration of NK cells. We believe that loading CAR-NK cells with “navigation” that directs them to the interior of the tumor will maximize the therapeutic effect of CAR-NK cells

ITALIANO

Il trasferimento di cellule adottive ha attirato una notevole attenzione come trattamento per il cancro. Il successo delle cellule T (CAR-T) ingegnerizzate dal recettore chimerico dell'antigene (CAR) per il trattamento dei tumori ematologici ha dimostrato il potenziale del CAR. In questa recensione, descriviamo le attuali strategie di costruzione delle cellule natural killer (CAR-NK) progettate da CAR, inclusi i principi di progettazione e le caratteristiche strutturali delle regioni extracellulari, transmembrana e intracellulari della struttura CAR. Inoltre, esaminiamo diversi vettori cellulari utilizzati per sviluppare cellule CAR-NK, evidenziando problemi e sfide esistenti. Discutiamo ulteriormente i possibili modi per ottimizzare la CAR dal punto di vista del microambiente tumorale per sfruttare la forza delle cellule CAR-NK e abbiamo fornito motivazioni per combinare le cellule CAR-NK con altri regimi di trattamento per migliorare gli effetti antitumorali.

Un recettore chimerico dell'antigene (CAR), originariamente proposto da Gross et al. è una struttura che viene utilizzata per ricostruire le cellule T autogene, generando cellule CAR-T che possono essere utilizzate con successo per il trattamento di pazienti con tumori ematologici, come la leucemia linfoblastica acuta (ALL), linfociti cronici leucemia (LLC), linfoma di Hodgkin e linfoma non Hodgkin e altri linfomi B. Sebbene i CAR-T abbiano dimostrato una grande efficacia contro questi tumori ematologici, hanno anche molti limiti. Ad esempio, la terapia CAR-T richiede un pretrattamento del paziente, principalmente attraverso la chemioterapia e l'irradiazione, e la qualità del pretrattamento influisce direttamente sull'efficacia. Dopo l'infusione di CAR-T, i pazienti sono soggetti a reazioni avverse, come la tempesta di citochine e la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD), che possono essere entrambe pericolose per la vita nei casi gravi. Inoltre, la costruzione di CAR-T richiede la raccolta di cellule T autologhe dal sangue periferico (PB) del paziente, limitando così la loro più ampia applicazione clinica. Alcuni pazienti pesantemente trattati non sono nemmeno adatti a questo prodotto a causa della tossicità immunitaria causata dalla chemioterapia intensiva o dalle radiazioni. Soprattutto, la sfida principale è che l'esito del trattamento CAR-T dei tumori solidi non è soddisfacente. Pertanto, i ricercatori sono stati motivati ​​a modificare le cellule immunitarie innate, in particolare le cellule natural killer (NK), per sviluppare cellule NK ingegnerizzate con CAR (CAR-NK) per l'immunoterapia del cancro. La promessa più significativa delle cellule CARNK che non è fornita da CAR-T è che potrebbero fornire un prodotto di immunoterapia cellulare da banco e migliorare il tasso di sopravvivenza dei pazienti con tumori solidi refrattari. Poiché l'uccisione delle cellule NK non dipende dalla corrispondenza dell'antigene leucocitario umano (HLA), le cellule CAR-NK allogeniche possono essere generate da diverse fonti, come PB, cellule del sangue del cordone ombelicale (CB), cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e anche linee cellulari NK, avendo così ampie applicazioni per diverse neoplasie. Il meccanismo principale attraverso il quale le cellule tumorali sfuggono alla terapia con cellule CAR-T è la perdita dell'antigene bersaglio. Sebbene l'uccisione limitata da CAR sia condivisa sia dalle cellule CAR-T che da quelle CAR-NK, le cellule CAR-NK allogeniche possono essere meno suscettibili a questo meccanismo inibitorio perché possono uccidere le cellule bersaglio attraverso meccanismi diversi da CAR, come come vari recettori naturali specifici della citotossicità (NCR), inclusi NKG2D, NKP30, NKP44 e NKP46, nonché attraverso la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC). In particolare, le cellule CAR-NK allogeniche non corrispondono all'HLA del paziente e, quindi, possono sfuggire all'interferenza dei segnali inibitori mediati dalle molecole HLA "auto" espresse sulle cellule tumorali. Inoltre, le cellule CAR-NK sono più sicure per l'uso clinico rispetto alle cellule CAR-T. Le cellule CAR-NK hanno una vita più breve dopo l'infusione e, quindi, non persistono nella circolazione per lunghi periodi di tempo, riducendo la tossicità ontarget/off-tumor, che è una preoccupazione significativa per l'uso delle cellule CAR-T. Ad esempio, le cellule CAR-T mirate al CD19 possono causare carenze di cellule B profonde e di lunga durata a causa della persistente attività CAR-T contro le normali cellule B mature e progenitrici. D'altra parte, la durata più breve delle cellule NK può limitare la loro efficacia in vivo. Recenti studi hanno dimostrato che citochine come l'interleuchina IL-12, IL-15 e IL-18 possono indurre la differenziazione delle cellule NK simil-memoria, con accresciuta proliferazione persistente e capacità antitumorale. Coerentemente, le cellule NK del sangue cordonale umano, che esprimono il gene CAR specifico per CD19 e il gene IL-15, sono state in grado di sopravvivere per diversi mesi e uccidere efficacemente le cellule tumorali in un modello murino di linfoma. Rispetto alle cellule CAR-T, che possono funzionare fino a diversi anni dopo il trattamento, è improbabile che queste cellule CAR-NK simili alla memoria, che vivono per diversi mesi, causino una significativa tossicità on-target/off-tumor .

Oltre alle cellule NK, altre cellule immunitarie innate, come le cellule NKT e γδT, che possiedono caratteristiche uniche, possono essere ingegnerizzate per esprimere CAR. Gli studi preclinici hanno anche dimostrato l'efficacia e la fattibilità dell'uso delle cellule CAR-NKT e CAR-γδT. In questa recensione, delineiamo principalmente i recenti progressi nello sviluppo delle cellule CAR-NK, concentrandoci su costrutti CAR, vettori cellulari e strategie per migliorare l'immunoterapia mediata da CAR-NK. Struttura e costruzione dei CAR La struttura dei CAR utilizzati nelle celle CAR-T si è evoluta per quattro generazioni. Come mostrato nella Figura 1, la struttura CAR è composta principalmente da un frammento variabile extracellulare a catena singola (scFv) derivato da un anticorpo contro un antigene tumorale, un dominio transmembrana (TM) e un dominio di segnalazione intracellulare (ICD). La struttura intracellulare della prima generazione contiene solo una catena CD3ζ. Quella della seconda generazione contiene catene CD3ζ e una molecola costimolatoria, come CD28, 4-1BB, CD134 (OX40), o un costimolatore delle cellule T inducibile (ICOS), per migliorare la citotossicità e l'attività proliferativa. Quella di terza generazione contiene una catena CD3ζ e due o più molecole costimolatorie differenti. La quarta generazione di CAR si riferisce a quei progetti che consentono l'espressione di citochine o ligandi costimolatori all'attivazione delle cellule T mediata dal CAR. Ad esempio, utilizzando un fattore nucleare del promotore responsivo alle cellule T attivate (NFAT) per guidare un gene IL-12 nelle cellule CAR-T (Figura 1), l'impegno CAR e la successiva attivazione delle cellule T hanno indotto l'attività del promotore e infine Produzione e rilascio di IL-12. IL-12 ha migliorato l'attivazione di CAR-T, ha modificato il microambiente tumorale e ha aumentato gli effetti antitumorali della terapia con CAR-T in modelli di topo ovarico umano ortotopico. In vista della tempesta di citochine che si verifica durante l'applicazione di CAR-T, un gene suicida può essere inserito nella nuova generazione di CAR per aggiungere un interruttore controllabile alle cellule, in modo che quando si verifica il rischio di morte, un farmaco rilevante può essere utilizzato per indurre l'apoptosi in tempo per terminare il trattamento. Sebbene le cellule CAR-NK condividano la stessa strategia di costruzione di CAR-T, alcuni aspetti sono stati modificati per adattarsi meglio alle cellule NK. I progetti di cellule CAR-NK negli ultimi anni sono descritti di seguito.

Dominio extracellulare

La regione extracellulare si riferisce principalmente all'scFv per l'antigene tumore-specifico, cioè VH e LH dell'anticorpo, che sono collegati da un linker. Attualmente, molti test delle cellule CAR-NK sono stati sviluppati contro diversi antigeni tumorali, come i target della leucemia acuta e cronica delle cellule B CD19 e CD20, il target del cancro al seno HER2, il target del neuroblastoma e del melanoma GD2, il bersaglio del mieloma multiplo CD138, il bersaglio del linfoma a cellule T CD4 e l'EGFR, che è frequentemente sovraespresso in vari tumori solidi. Inoltre, alcuni ricercatori si sono concentrati su alcune cellule immunosoppressive del corpo umano, come i macrofagi M2 e le cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC), per progettare obiettivi di cellule CAR-NK per queste cellule, che migliorano l'efficacia di altre strategie di uccisione del tumore eliminando le cellule inibitorie. Inoltre, i ricercatori hanno anche tentato di costruire una struttura CAR bispecifica, ovvero un scFv extracellulare in grado di riconoscere due antigeni. Le strutture dei CAR bispecifici mostrate in Figura 2A, 2B e 2C hanno il vantaggio di un'elevata sensibilità. Molte cellule tumorali esprimono una varietà di antigeni associati al tumore (TAA). Tali CAR possono uccidere efficacemente le cellule bersaglio e, in una certa misura, evitare la fuga immunitaria indotta dalla tolleranza al tumore. Tuttavia, gli svantaggi di tali CAR sono la ridotta specificità e il danneggiamento di alcuni tessuti normali che esprimono uno degli antigeni. Su questa base, i ricercatori hanno sviluppato una quarta struttura mostrata nella Figura 2D. Poiché l'attivazione delle cellule T richiede due segnali, solo quando entrambi gli scFv si legano agli antigeni corrispondenti la struttura CAR può essere completamente attivata per uccidere le cellule bersaglio. Tuttavia, questo design potrebbe non essere applicabile alle cellule NK. Gli studi hanno dimostrato che quando questo tipo di CAR viene innestato sulle cellule NK92, l'associazione dell'antigene con quello contenente un dominio costimolatorio da solo può attivare la struttura CAR in vitro, senza richiedere un'associazione dell'antigene con quello contenente il CD3ζ dominio. Il dominio costimolatorio in questo costrutto è costituito da CD28 e CD244 e CD244 potrebbe essere la molecola che svolge un ruolo chiave, di cui parleremo più avanti. Oltre all'utilizzo di scFv come regione extracellulare delle cellule CAR-NK, sono state proposte alcune diverse idee progettuali, come l'uso di NKG2D come regione extracellulare. Questo progetto è stato applicato sia nelle cellule CAR-T che nelle cellule CAR-NK e si basa sulla conoscenza che i ligandi NKG2D sono sovraregolati in una varietà di cellule tumorali e sulla superficie delle MDSC, che sono prontamente reclutate dai tumori solidi.

Poiché l'attivazione di NKG2D delle cellule NK richiede l'interazione con la proteina DAP10, i ricercatori hanno costruito la struttura NKG2D-DAP10-CD3ζ nelle cellule NK e T del sangue periferico umano, che ha dimostrato una buona efficacia nei modelli murini di osteosarcoma.

 Dominio transmembrana

La maggior parte delle strutture CAR-NK contiene un dominio transmembrana derivato da CD8a, CD28 o CD3; alcuni speciali sono di NKG2D. Attualmente si ritiene che il dominio transmembrana abbia un impatto minimo sulla struttura complessiva. Alabanza et al. confrontato diversi domini transmembrana nelle cellule CAR-T. Hanno usato due diversi scFv mirati a CD19 e due diversi domini transmembrana da CD8a o CD28 e hanno progettato quattro strutture CAR nelle cellule T del sangue periferico umano. I risultati hanno mostrato che sebbene i due domini transmembrana non fossero significativamente differenti nella loro capacità di eliminare le cellule di leucemia linfatica cronica primaria umana nei topi, sia nelle cellule T CD4+ che CD8+, la degranulazione ed il rilascio di citochine da parte di CAR-T utilizzando CD28 come dominio transmembrana erano superiori a quelli che utilizzavano CD8a come dominio transmembrana. Guedan et al. hanno dimostrato che l'effetto del dominio di segnalazione intracellulare ICOS era migliore di quello del CD28 nelle cellule CAR-T, come indicato dalla persistenza di CAR-T migliorata e dall'uccisione del tumore nei topi, e ulteriori risultati hanno suggerito che la regione transmembrana unica di ICOS era la chiave , piuttosto che i domini citoplasmatici. Inoltre, la combinazione di domini di segnalazione intracellulare ICOS e 4-1BB in un CAR-T di terza generazione mirato a linee cellulari tumorali umane che esprimono mesotelina ha mostrato effetti antitumorali superiori nei modelli di xenotrapianto. È interessante notare che il dominio di segnalazione intracellulare ICOS deve essere posizionato prossimalmente alla membrana cellulare e collegato al dominio transmembrana ICOS. Pertanto, queste informazioni suggeriscono che la regione transmembrana delle cellule CAR-NK potrebbe contenere caratteristiche non riconosciute che attendono ulteriori esplorazioni.

Dominio di segnalazione intracellulare

Come componente chiave della struttura funzionale, l'importanza della regione di segnalazione intracellulare è evidente. La maggior parte delle cellule CAR-NK utilizza CD3ζ come dominio di segnalazione per condurre la trasduzione del segnale e utilizza l'ITAM di CD3ζ per avviare l'uccisione delle cellule NK. Il dimero CD3ζ può trasmettere segnali da CD16 e può quindi contribuire all'ADCC. Inoltre, analogamente agli esperimenti con CAR-T, nella costruzione di cellule CAR-NK, Schonfeld et al. ha anche confrontato una varietà di diverse regioni di segnalazione intracellulare nelle cellule NK-92. I risultati hanno mostrato che con un solo dominio di CD3ζ, le cellule CAR-NK92 non potevano lisare efficacemente le cellule tumorali umane che esprimono ErbB2 in vitro a causa di segnali stimolatori insufficienti. Pertanto, sono necessari più domini costimolatori, inclusi i comunemente usati CD28, CD137 (4-1BB) o CD244 (2B4). È interessante notare che sia CD28 che CD137 sono importanti molecole di costimolazione che funzionano durante l'attivazione delle cellule T umane anche se né CD28 né CD137 sono espressi nelle cellule NK umane e la via di attivazione classica delle cellule NK non dipende da un segnale di costimolazione come in cellule T. Quindi, perché l'effetto di un singolo CD3ζ non è ideale e quali ruoli svolgono CD28 e CD137 nell'attivazione delle cellule CAR-NK? Queste domande meritano un approfondimento per la costruzione di una CAR efficace. Gli studi hanno scoperto che l'effetto stimolatorio del dominio citoplasmatico CD244 nelle cellule NK92 che esprimono CAR è migliore di quello del CD137 in vitro e nei topi xenotrapianti con leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). CD244 è una molecola costimolatoria dell'attivazione delle cellule NK e appartiene a una famiglia di recettori correlati alle molecole di segnalazione dell'attivazione dei linfociti. Il dominio citoplasmatico di CD244 contiene un motivo di commutazione basato sulla tirosina immunorecettore (ITSM), che può legarsi alla proteina associata (SAP) alla molecola di segnalazione di attivazione dei linfociti (SLAM) e reclutare e attivare le tirosin chinasi per avviare segnali di attivazione, il che suggerisce che CD244 può essere più adatto come dominio di segnalazione intracellulare nelle cellule CAR-NK. Utilizzando un modello di xenotrapianto di cancro ovarico, Li et al. ha scoperto che quando CD244 e CD3ζ sono stati utilizzati contemporaneamente come domini di segnalazione, la mutazione degli amminoacidi chiave di CD3ζ non ha influenzato significativamente la funzione di CAR; tuttavia, le mutazioni negli amminoacidi chiave di CD244 hanno avuto un enorme impatto sull'effetto letale delle cellule CAR-NK umane derivate da iPSC. Questi risultati sollevano dubbi sul fatto che CD244 possa sostituire CD3ζ come regione intracellulare delle cellule CAR-NK, che attende conferma in esperimenti futuri. Oltre all'uso di CD244, Muller et al. hanno tentato di sostituire CD3ζ con DAP12 in cellule YTS-NK che esprimono CAR e hanno valutato il loro effetto letale negli xenotrapianti di glioblastoma. Rispetto a CD3ζ, tuttavia, la regione intracellulare di DAP12 contiene solo una struttura ITAM.

I risultati hanno mostrato che DAP12 ha dimostrato un effetto migliore di CD3ζ come dominio di segnalazione, che può reclutare e fosforilare ZAP70, e quindi fosforilare ulteriormente i segnali a valle per mediare gli effetti di uccisione delle cellule CAR-NK.

Portatori di cellule utilizzati per le cellule CAR-NK

Attualmente, i vettori cellulari comunemente usati per lo sviluppo di CAR-NK sono le cellule NK del sangue periferico umano e la linea cellulare NK92.  Dal punto di vista della tempestività e praticità del trattamento, la linea cellulare NK-92 è indubbiamente superiore alle cellule NK del sangue periferico umano, e studi hanno dimostrato che i livelli di perforina, granzima e una serie di citochine con effetti letali prodotti da NK-92 le cellule sono più alte di quelle prodotte dalle cellule NK del sangue periferico. Oltre alle cellule NK-92, sono state utilizzate anche altre linee cellulari NK per esprimere CAR. Ad esempio, Murakami et al. ha tentato per la prima volta di costruire una struttura CAR mirata a EGFRvIII utilizzando un'altra linea di cellule NK umane, KHYG. I risultati hanno mostrato che le cellule KHYG hanno dimostrato effetti citotossici simili alle cellule NK-92 negli xenotrapianti di glioblastoma umano. Tuttavia, quale delle due linee cellulari mostra effetti di trattamento migliori e più sicuri attende ulteriori verifiche. Negli ultimi anni, anche le cellule NK derivate da cellule staminali, comprese le cellule staminali embrionali (ESC), le cellule staminali CB e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), hanno attirato una notevole attenzione. Poiché le cellule staminali embrionali sono difficili da ottenere e le loro applicazioni hanno preoccupazioni etiche, vengono utilizzate meno frequentemente. Il CB può essere conservato congelato e la sua applicazione è più conveniente rispetto a quella delle cellule staminali embrionali. Al momento, sono state sviluppate alcune tecniche che possono amplificare notevolmente le cellule NK derivate da CB in un breve periodo di tempo e queste cellule hanno mostrato una significativa attività in vivo contro il mieloma multiplo in un modello murino xenogenico. Le iPSC sono un tipo di cellula staminale pluripotente che può essere generata direttamente da cellule adulte, come le cellule della pelle, e quindi indotta a differenziarsi in cellule NK. Le cellule NK derivate da iPSC presentano vantaggi sia delle cellule NK del sangue periferico umano che delle cellule NK-92 e sono stati stabiliti metodi standardizzati per l'induzione e l'amplificazione su larga scala di cellule simili a NK in un breve periodo di tempo. Inoltre, queste cellule simili a NK possono esprimere livelli biologici di recettori di attivazione killer (KAR) ed esprimono un basso livello di recettore simile a immunoglobulina delle cellule killer (KIR) rispetto alle cellule NK del sangue periferico. Li et al. hanno costruito con successo una struttura CAR in cellule NK derivate da iPSC. Rispetto ai tradizionali CAR-T, i modelli murini di cancro ovarico trapiantati con le cellule CAR-NK derivate da iPSC hanno mostrato un tasso di sopravvivenza più elevato e meno effetti collaterali tossici. Tuttavia, vale la pena notare che la stessa struttura CAR può avere effetti diversi in diversi vettori di cellule, il che indica che non possiamo applicare direttamente il CAR adatto per un tipo di vettore a un altro e dobbiamo determinare sperimentalmente il più adatto Strutture CAR per diverse applicazioni.

Studi clinici che utilizzano cellule CAR-NK contro vari tumori

In queste prove, il vettore cellulare primario è la linea cellulare NK-92. I CAR sono stati progettati per colpire antigeni noti per essere specifici per vari tumori e i progetti adottavano principalmente la struttura di prima o seconda generazione. Inoltre, più studi hanno utilizzato CD137 anziché CD244 come molecola costimolatoria, di cui abbiamo discusso in precedenza. Vale la pena ricordare che nello studio clinico NCT03056339, Rezvani et al. ha adottato una strategia simile a TRUCKS per progettare il CAR, aggiungendo il gene IL-15 per migliorare l'attività antitumorale delle cellule CAR-NK derivate da CB. Per migliorare la sicurezza, hanno sfruttato un gene suicida inducibile della caspasi-9, la cui espressione può essere attivata utilizzando uno specifico induttore chimico di dimerizzazione.

Prospettiva futura

Nell'immunoterapia tumorale, il microambiente tumorale è un fattore essenziale che deve essere preso in considerazione. Sebbene le cellule NK possano essere più efficaci nell'attrarre tumori solidi rispetto alle cellule T, la loro infiltrazione può essere bloccata da un microambiente tumorale composto da vari fattori inibitori. Pertanto, consentire una migliore infiltrazione delle cellule NK nel tumore solido e superare l'inibizione del microambiente tumorale sono cruciali per la loro attività antitumorale. Inducendo un microambiente tumorale permissivo per l'infiltrazione delle cellule immunitarie, potremmo migliorare notevolmente l'efficacia del trattamento CAR-NK per i tumori solidi. Ad esempio, CXCL12 ha dimostrato di essere abbondante nel microambiente tumorale e può reclutare cellule T regolatorie CXCR4+ e MDSC in tumori solidi, promuovendo la soppressione immunitaria e la progressione del tumore [89,90]. CXCL1 e CXCL2 sono altamente espressi dalle cellule del cancro al seno, portando ad un aumento dell'infiltrazione di cellule mieloidi pro-tumorigene CXCR2+. Pertanto, potremmo essere in grado di migliorare l'infiltrazione delle cellule CAR-NK modificando le cellule NK per esprimere CAR e il recettore delle chemochine che sono elevati nel microambiente tumorale (Figura 3). Inoltre, nel microambiente tumorale, l'effetto inibitorio di citochine come il TGF-β sulle cellule immunitarie non può essere ignorato. Svolge ruoli importanti nella differenziazione delle cellule immunitarie protumorigene, come le cellule T regolatorie (Treg) e TAM simili a M2. Se le cellule CAR-NK sono caricate con strutture che consentono la secrezione dei recettori solubili di queste citochine, che possono legarsi in modo competitivo al TGF-β e quindi inibire l'attività del TGF-β, la soppressione di varie cellule immunitarie da parte del microambiente tumorale potrebbe essere rinvigorita. Inoltre, vale la pena esplorare la combinazione di CAR e altri trattamenti. Qui, presentiamo alcuni esperimenti utilizzando CAR-NK in combinazione con farmaci chemioterapici, anticorpi e nanomolecole. Questi studi hanno principalmente cercato di aumentare l'espressione dell'antigene mirato o di migliorare l'infiltrazione e la funzione delle cellule CAR-T o CAR-NK. Ad esempio, Chu et al. hanno scoperto che la romidepsina ha aumentato significativamente l'espressione del ligando NKG2D MICA/B nelle cellule di linfoma di Burkitt e ha potenziato l'attività citotossica CAR-NK attraverso l'interazione tra MICA/B e NKG2D in vitro e in vivo. Zhang et al. hanno dimostrato che le cellule CAR-NK-92 specifiche per EpCAM combinate con regorafenib, che ha potenziato l'infiltrazione delle cellule CAR-NK-92, potrebbero uccidere efficacemente le cellule tumorali in un modello murino di cancro del colon-retto. Pertanto, una progettazione razionale della strategia della terapia combinata può essere una direzione importante per la futura ricerca CAR-NK.

Conclusione

È innegabile che la terapia cellulare CAR-NK ha un enorme potenziale e fattibilità come nuovo mezzo di immunoterapia adottiva. Tuttavia, molte questioni devono ancora essere affrontate, come come migliorare l'efficienza di trasfezione delle cellule CAR-NK, l'esplorazione delle strutture CAR ottimali, la selezione dei portatori cellulari appropriati, il miglior punto di introduzione per i trattamenti combinati e come eliminare possibili reazioni avverse dopo l'applicazione nell'uomo. Queste sono tutte preoccupazioni che devono essere risolte prima che le cellule CAR-NK possano essere utilizzate nella pratica clinica. Se questi problemi verranno risolti, si ritiene che le cellule CAR-NK diventeranno una potente arma contro i tumori.

Sintesi

Recettore dell'antigene chimerico

 • La struttura del recettore chimerico dell'antigene (CAR) è stata utilizzata per la prima volta nelle cellule T e il CAR-T costruito ha dimostrato un buon effetto nel trattamento clinico dei tumori ematologici. Per esplorare ulteriormente il potenziale antitumorale di CAR, sono state sviluppate cellule CAR-NK. Struttura cellulare CAR-NK

• Il dominio extracellulare è composto principalmente da scFv che può legarsi all'antigene bersaglio ea un dominio cerniera. Come punto di partenza della trasmissione del segnale, la specificità e la sensibilità di scFv determinano direttamente gli effetti dell'intera struttura. Attualmente, ci sono due design per scFv: mono-specificità e bi-specificità.

• CD8a, CD28 e CD3ζ sono comunemente usati per costruire il dominio transmembrana e si ritiene generalmente che diverse regioni transmembrana abbiano scarso effetto sull'effetto letale di CAR.

• La regione intracellulare è costituita da molecole costimolatorie e da un dominio di segnalazione contenente ITAM. Le cellule CAR-NK con molecole di costimolazione dimostrano una citotossicità significativamente maggiore rispetto alle cellule CAR-NK senza molecole di costimolazione. Questo è un fenomeno interessante dovuto alla scoperta che, a differenza delle cellule T, l'attivazione delle cellule NK non richiede due segnali. I domini di segnalazione contenenti ITAM utilizzati dalle cellule CAR-NK sono principalmente CD3ζ e DAP12.

Portatori di cellule

• Le cellule NK del sangue periferico e la linea cellulare NK-92 sono i portatori di cellule più comunemente usati. Inoltre, anche le cellule NK derivate da IPSC dimostrano un grande potenziale. Vale la pena notare che lo stesso CAR non è necessariamente adatto a tutti i vettori cellulari. Anche la determinazione del CAR più adatto in base alle caratteristiche dei diversi vettori è un problema da risolvere. Trattamenti combinati

• Negli studi esistenti, la combinazione di cellule CAR-NK con altri trattamenti mostra un effetto sinergico (1 + 1>2). Ad esempio, alcuni farmaci possono potenziare l'attività delle cellule NK o possono specificamente sovraregolare antigeni specifici sulla superficie delle cellule bersaglio, promuovendo così un più forte effetto letale dei CAR contro questo antigene.

 Prospettiva futura

• Il microambiente tumorale è un'area proibita per le cellule immunitarie umane come le cellule T e le cellule NK. I vari fattori inibitori che si trovano lì impediscono la massiccia infiltrazione di cellule NK. Riteniamo che caricare le cellule CAR-NK con una "navigazione" che le diriga all'interno del tumore massimizzerà l'effetto terapeutico delle cellule CAR-NK

Da:

https://info.biotechniques.com/hubfs/BTN/BTN%20-%20Thermo%20Fisher%20-%20eBook%20-%20Oct%2021/BTN%20Thermo%20Cell%20Therapies%20eBook_v3.pdf