I vantaggi dell'utilizzo della tecnologia PCR digitale a goccia: un'intervista a Mark White / The advantages of using droplet digital PCR technology: an interview with Mark White

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

In questa intervista, Mark White (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) discute la gamma di applicazioni di terapia cellulare che utilizzano la tecnologia digitale delle gocce (ddPCR), i vantaggi e le sfide che devono affrontare nello sviluppo di saggi accurati per la quantificazione lentivirale e approcci alternativi per il processo. Oltre a questo, ascoltiamo i suoi pensieri sul futuro della quantificazione lentivirale e sui nuovi test e kit attualmente in fase di sviluppo da Bio-Rad per supportare i ricercatori che lavorano sulle terapie cellulari.

Quali sono le principali sfide nello sviluppo di un dosaggio accurato per la quantificazione lentivirale?

Ci sono due sfide principali da affrontare quando si cerca di quantificare con precisione le particelle lentivirali o il numero di copie vettoriali delle cellule trasdotte. Il primo è la variabilità intrinseca dell'intero stack di strumento, processo e operatore. Ciò può portare a coefficienti di variabilità nell'intervallo 20-50% quando si confrontano corse, strumenti o operatori. La seconda sfida è la necessità di mantenere il materiale di riferimento per eseguire una curva standard per la quantificazione. Questo materiale deve essere molto preciso ed è costoso da realizzare, mantenere e passare da un lotto all'altro.

Quali sono i vantaggi dell'utilizzo della ddPCR rispetto ad approcci alternativi, come qPCR o NGS, per una quantificazione accurata del vettore virale?

Il primo vantaggio chiave di ddPCR per la quantificazione accurata del vettore virale è il fatto che ddPCR è un conteggio assoluto delle molecole di DNA, eliminando la necessità di utilizzare e mantenere materiale di riferimento per una curva standard. Ciò consente di risparmiare tempo e denaro, oltre a liberare circa il 25% del prezioso immobile su un piatto di pozzo. Inoltre, la ddPCR è molto più tollerante ai comuni inibitori presenti nelle matrici utilizzate nel processo del vettore virale.

Quali sono le insidie più comuni da evitare durante la transizione da qPCR o NSG a ddPCR?

Una delle insidie più comuni è il presupposto che qPCR e ddPCR dovrebbero produrre lo stesso titolo virale o numero di copie del vettore quando si analizza lo stesso campione. I due metodi, sebbene basati sullo stesso metodo di PCR, presentano molte differenze nei fattori di processo e sperimentali, nonché nelle ipotesi sulle prestazioni di ciascun metodo. Ad esempio, se il materiale di riferimento per una curva standard qPCR non viene quantificato con precisione, questo può incresparsi nel resto dell'esperimento e influenzare la quantificazione virale finale. Inoltre, mentre molti set di primer qPCR possono essere trasferiti a ddPCR, potrebbero essere necessarie alcune ottimizzazioni per la temperatura di ricottura/estensione e l'aggiunta di un enzima di restrizione per aumentare l'accessibilità dell'amplicone.

Puoi dirci di più sulla gamma di applicazioni di terapia cellulare che utilizzano la tecnologia ddPCR?

ddPCR è attualmente utilizzato in un'ampia gamma di applicazioni di terapia cellulare. Uno dei più comuni è stimare il numero di copie del vettore per cellula misurando il numero di molecole del gene di riferimento per stimare il numero di cellule diploidi, quindi misurare un componente del vettore virale per stimare le copie del vettore. Inoltre, una recente aggiunta al flusso di lavoro ddPCR ha consentito l'incapsulamento di un'intera cellula viva in una gocciolina ddPCR, seguita da lisi e ddPCR per quantificare il DNA presente in ciascuna cellula. Ciò consente a un ricercatore di quantificare la % di cellule che contengono un vettore virale. È stato utilizzato anche il monitoraggio del DNA contaminante da cellule ospiti come HEK293, nonché macchinari genici competenti per la replicazione. Infine, la ddPCR può essere utilizzata per monitorare l'espressione genica del vettore virale nelle cellule bersaglio, nonché per monitorare i conteggi del vettore virale nei campioni dei pazienti.

Esistono soluzioni già disponibili per mirare a terapie cellulari specifiche?

Bio-Rad dispone attualmente di due saggi di progettazione esperta che prendono di mira i costrutti CD-19 CAR-T. Un test mira al costrutto axicabtagene ciloleucel (axi-cel, venduto con il marchio Yescarta) e un secondo test mira a una sequenza condivisa dai costrutti axi-cel e tisagenlecleucel (tisa-cel).

Secondo lei, dove vede il futuro della quantificazione lentivirale?

Vedo una grande spinta per quantificare più componenti del costrutto lentivirale utilizzando un test multiplex. L'effetto terapeutico di una terapia a base di lentivirali si basa sulla sequenza del gene di interesse, nonché sulle sequenze promotore, potenziatore e coda di poliA su entrambi i lati. Potresti avere il gene di interesse, ma se il resto del costrutto viene troncato in qualche modo, la terapia avrà meno probabilità di funzionare. Vedo gli sviluppatori di terapie che iniziano a misurare il titolo o il numero di copie di più componenti del vettore, nonché l'interesse degli organismi di regolamentazione nel definire le terapie in modo più completo con questi approcci multiplex.

Cosa sta sviluppando Bio-Rad nel prossimo futuro per le terapie cellulari?

Bio-Rad sviluppa costantemente nuovi test e kit per supportare i ricercatori che lavorano sulle terapie cellulari. Abbiamo recentemente lanciato un nuovo motore di progettazione di test di terapia cellulare e genica che aiuta i ricercatori a progettare test completamente personalizzati e ottimizzati per la ddPCR in pochi minuti per qualsiasi sequenza genica. L'anno prossimo, siamo entusiasti di rilasciare un nuovo prodotto nella nostra famiglia di kit di controllo qualità Vericheck.

ENGLISH

In this interview, Mark White (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) discusses the range of cell therapy applications using digital droplet technology (ddPCR), the benefits and challenges they face in developing accurate assays for lentiviral quantification and alternative approaches to the process. In addition to this, we listen to his thoughts on the future of lentiviral quantification and the new tests and kits currently being developed by Bio-Rad to support researchers working on cell therapies.

What are the main challenges in developing an accurate assay for lentiviral quantification?

There are two main challenges to be faced when trying to accurately quantify lentiviral particles or the vector copy number of transduced cells. The first is the inherent variability of the entire stack of instrument, process and operator. This can lead to coefficients of variability in the range of 20-50% when comparing strokes, tools or operators. The second challenge is the need to keep the reference material to perform a standard curve for quantification. This material needs to be very accurate and is expensive to make, maintain, and run from batch to batch.

What are the advantages of using ddPCR over alternative approaches, such as qPCR or NGS, for accurate viral vector quantification?

The first key benefit of ddPCR for accurate viral vector quantification is the fact that ddPCR is an absolute count of DNA molecules, eliminating the need to use and maintain reference material for a standard curve. This saves time and money, as well as freeing up about 25% of the valuable real estate on a well plate. Furthermore, ddPCR is much more tolerant to common inhibitors present in the matrices used in the viral vector process.

What are the most common pitfalls to avoid when transitioning from qPCR or NSG to ddPCR?

One of the most common pitfalls is the assumption that qPCR and ddPCR should produce the same viral titer or vector copy number when running the same sample. The two methods, although based on the same PCR method, have many differences in process and experimental factors, as well as in the assumptions about the performance of each method. For example, if the reference material for a qPCR standard curve is not precisely quantified, this can ripple in the remainder of the experiment and affect the final viral quantification. Additionally, while many qPCR primer sets can be transferred to ddPCR, some optimizations may be required for the annealing / extension temperature and the addition of a restriction enzyme to increase amplicon accessibility.

Can you tell us more about the range of cell therapy applications using ddPCR technology?

ddPCR is currently used in a wide range of cell therapy applications. One of the most common is to estimate vector copy number per cell by measuring the number of reference gene molecules to estimate the number of diploid cells, then measuring a viral vector component to estimate vector copies. Additionally, a recent addition to the ddPCR workflow allowed for the encapsulation of an entire live cell in a ddPCR droplet, followed by lysis and ddPCR to quantify the DNA present in each cell. This allows a researcher to quantify the% of cells that contain a viral vector. Monitoring of contaminating DNA from host cells such as HEK293 as well as replication competent gene machinery was also used. Finally, ddPCR can be used to monitor viral vector gene expression in target cells, as well as to monitor viral vector counts in patient samples.

Are there solutions already available to target specific cell therapies?

Bio-Rad currently has two expert design assays that target CD-19 CAR-T constructs. One test targets the axicabtagene ciloleucel (axi-cel, sold under the Yescarta brand) construct and a second test targets a sequence shared by the axi-cel and tisagenlecleucel (tisa-cel) constructs.

In your opinion, where do you see the future of lentiviral quantification?

I see a big push to quantify more components of the lentiviral construct using a multiplex test. The therapeutic effect of a lentiviral therapy is based on the gene sequence of interest as well as the promoter, enhancer and polyA tail sequences on both sides. You may have the gene of interest, but if the rest of the construct is truncated in some way, the therapy will be less likely to work. I see therapy developers starting to measure the titer or copy number of multiple vector components, as well as the interest of regulatory bodies in defining therapies more comprehensively with these multiplex approaches.

What is Bio-Rad developing in the near future for cell therapies?

Bio-Rad is constantly developing new tests and kits to support researchers working on cell therapies. We recently launched a new cell and gene therapy test design engine that helps researchers design fully customized, ddPCR-optimized tests in minutes for any gene sequence. Next year, we are excited to release a new product in our Vericheck quality control kit family.

Da:

https://www.regmednet.com/the-advantages-of-using-droplet-digital-pcr-technology-an-interview-with-mark-white/?utm_campaign=RMN%20-%20Spotlight%20-%20BioRad%20-%20Q4%202021&utm_medium=email&_hsmi=187443737&_hsenc=p2ANqtz-_YgObr-fHx0DdRxkPPpuQxqY2d6gRiG6Naf2TOZMWHAs5FO9J1Tye-yCUtAUkTRs2fZNp1_WMu561NmPXCHKWlBQmgkNAN0S52T1W75-LolzhXc7w&utm_content=187232125&utm_source=hs_email

Cerca nel blog

GENIO italiano Giuseppe Cotellessa