How to compare ELISA kit performance between different vendors / Come confrontare le prestazioni del kit ELISA tra diversi fornitori

How to compare ELISA kit performance between different vendors / Come confrontare le prestazioni del kit ELISA tra diversi fornitori

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Introduction

 Selecting the right ELISA kit at the start of a long-term research project can help save time and other resources over the course of the study. This choice is not always easy because different vendors’ kits often have subtle differences in components and protocols that can significantly impact results. Antibodies, protein standards, buffer composition, and detection methods all contribute to the performance of an assay kit. A direct side-by-side comparison at the lab bench is usually necessary to find the optimal kit for a particular target and sample type. Here we share some tips on how to best compare ELISA kits from different vendors. 

What you should do

 Each ELISA kit should be run as indicated in the respective product information sheet. Each plate should have the same layout of standards, samples, and controls. Natural samples like serum, plasma, or cell culture supernatant should be split under the same conditions onto each plate (e.g., same freeze–thaw conditions and sample handling). Samples with normal and elevated protein levels should be examined, such as healthy and diseased serum samples. In addition, samples with elevated protein levels should be diluted a few times over the range of the assay. Linearity-of-dilution and spikeand-recovery experiments are recommended to assess the reliability of results over a range of protein concentrations.

 What you should avoid 

Protein standards should not be shared between kits. Recombinant proteins are often used as standards in ELISA kits. If the standard is not a full-length protein, the capture or detection antibody may not bind to the standard. Similarly, do not use reagents from one kit (e.g., wash solution) in another kit or skip any steps in the protocol. The same protocol should not be used with different kits. Each assay is designed and tested by the vendor using the kit-specific protocol for best performance. 

How to analyze results

 Use curve-fitting software to generate the standard curve for each kit. Ensure that raw data from both kits were run using the recommended 4-parameter logistic (4PL) curve-fitting algorithm. The standard curve from each kit should look similar to the result provided in the product documentation. This assessment includes examining the goodness of fit, or how well the assay fits the algorithm model. If any standard is outside of 70–130% of the expected value, consider omitting that data point.

 Duplicate runs should have a coefficient of variation (CV) of <10%. Samples with low and high protein levels should fall within the dynamic range of the assay, minimizing the need for sample manipulations. Linearity-of-dilution experiments should show measured concentrations at 80–120% of the expected value when diluting samples in the linear portion of the standard curve. Spike-and-recovery experiments should result in mean recoveries close to 100% of the expected value.

What to expect 

One kit may show an advantage over the other kit for a particular sample type and target. For example, one pair of capture and detection antibodies may offer greater sensitivity and specificity than another pair when using a complex sample matrix. Underestimates or overestimates of protein concentrations should become apparent when examining spike-and-recovery data. If the spiked-in protein has values outside of a 70–130% expected range, the assay may not be able to accurately quantitate that protein. It is common to see only minor differences in quantitation results, which can arise from differences in the calibration of protein standards between kits. In this scenario, you should see similar trends in protein quantitation in which measured concentrations are high, medium, or low for both kits. If the kits perform similarly, other factors such as ease of use and workflow time may impact your final choice. For example, Invitrogen™ Instant ELISA™ kits include plates precoated with capture antibody, detection antibody, streptavidin–HRP, and sample diluent. All of the preparation work has been done for you, which reduces workflow time and helps minimize variation.

How to interpret performance information

 Vendors typically provide a set of performance data for ELISA kits. This section is a summary of the most important performance parameters to assess before making a purchasing decision.

 • Analytical sensitivity: It is an industry standard for ELISA manufacturers to report the analytical sensitivity, more commonly known as the limit of detection (LOD). Analytical sensitivity is the lowest analyte concentration that can be detected above the background. The background concentration is calculated by adding 2 standard deviations to the mean optical density of the dilution medium. Analytical sensitivity should not be confused with functional sensitivity. Functional sensitivity, or the limit of lowest quantitation (LLOQ), is the lowest concentration at which the analyte can be reliably detected. While functional sensitivity might be more useful to researchers, analytical sensitivity is what is reported by most vendors.

 • Intra-assay precision: Intra-assay precision refers to sample replicates on the same plate. Replicate wells should give comparable results for each sample. The CV across the replicates should be less than 10%

. • Inter-assay precision: Inter-assay precision refers to sample replicates assayed on different days and different plates. This test tends to be more variable than the intra-assay precision, so CV values may be higher. Inter-assay precision helps ensure that results obtained will be consistent over time and between kits.

 • Spike and recovery: This test shows if the true concentration of a sample is obtained without interference. Some target proteins may be in complex matrices such as plasma or serum, which can cause issues with antibody capture and binding. To determine if all of a target protein is captured during the assay, a known concentration of the protein is spiked into the sample matrix and measured using the assay. Ideally, recovery should be close to 100%.

 • Parallelism: This test refers to similar accuracy of the assay with respect to the recombinant protein standard of the kit and the protein in the natural sample. The results for the natural sample protein and the recombinant standard should be parallel. 

• Linearity of dilution: A sample with low protein levels is spiked with a known amount of analyte and evaluated at different dilutions. Recovery should be close to 100% for spike concentrations in the linear portion of the standard curve.

Conclusion 

Before investing in a long-term or critical study, it is important to understand the performance of an ELISA kit with a particular research sample. Due to the wide variety of ELISA kits available from different vendors, the choice of kit is not always straightforward. The experimental approach and performance parameters outlined here are designed to help researchers choose the kit that best fits the needs of their project.

ITALIANO

Introduzione

Selezionare il giusto kit ELISA all'inizio di un progetto di ricerca a lungo termine può aiutare a risparmiare tempo ed altre risorse nel corso dello studio. Questa scelta non è sempre facile perché i kit di fornitori diversi spesso presentano sottili differenze nei componenti e nei protocolli che possono avere un impatto significativo sui risultati. Anticorpi, standard proteici, composizione del tampone e metodi di rilevamento contribuiscono tutti alle prestazioni di un kit di analisi. Di solito è necessario un confronto diretto fianco a fianco sul banco di laboratorio per trovare il kit ottimale per un particolare target e tipo di campione. Qui condividiamo alcuni suggerimenti su come confrontare al meglio i kit ELISA di diversi fornitori.

Cosa dovresti fare

Ciascun kit ELISA deve essere eseguito come indicato nella rispettiva scheda informativa del prodotto. Ciascuna piastra dovrebbe avere la stessa disposizione di standard, campioni e controlli. I campioni naturali come siero, plasma o surnatante di colture cellulari devono essere suddivisi nelle stesse condizioni su ciascuna piastra (ad esempio, stesse condizioni di congelamento-scongelamento e manipolazione del campione). Devono essere esaminati campioni con livelli proteici normali ed elevati, come campioni di siero sani e malati. Inoltre, i campioni con livelli proteici elevati devono essere diluiti alcune volte nell'intervallo del dosaggio. Si raccomandano esperimenti di linearità di diluizione e spike e recupero per valutare l'affidabilità dei risultati su un intervallo di concentrazioni proteiche.

 Cosa dovresti evitare

Gli standard proteici non dovrebbero essere condivisi tra i kit. Le proteine ​​ricombinanti sono spesso usate come standard nei kit ELISA. Se lo standard non è una proteina intera, l'anticorpo di cattura o rilevamento potrebbe non legarsi allo standard. Allo stesso modo, non utilizzare i reagenti di un kit (ad es. Soluzione di lavaggio) in un altro kit o saltare i passaggi del protocollo. Lo stesso protocollo non deve essere utilizzato con kit diversi. Ogni dosaggio è progettato e testato dal fornitore utilizzando il protocollo specifico del kit per ottenere le migliori prestazioni.

Come analizzare i risultati

 Utilizzare il software di adattamento della curva per generare la curva standard per ciascun kit. Assicurarsi che i dati grezzi di entrambi i kit siano stati eseguiti utilizzando l'algoritmo di adattamento della curva logistico (4PL) a 4 parametri consigliato. La curva standard di ciascun kit dovrebbe essere simile al risultato fornito nella documentazione del prodotto. Questa valutazione include l'esame della bontà dell'adattamento o della misura in cui il test si adatta al modello dell'algoritmo. Se uno standard è al di fuori del 70–130% del valore previsto, considerare di omettere quel punto dati.

 Le esecuzioni duplicate dovrebbero avere un coefficiente di variazione (CV) <10%. I campioni con livelli proteici bassi ed alti dovrebbero rientrare nell'intervallo dinamico del test, riducendo al minimo la necessità di manipolazioni del campione. Gli esperimenti sulla linearità della diluizione dovrebbero mostrare le concentrazioni misurate all'80–120% del valore atteso quando si diluiscono i campioni nella porzione lineare della curva standard. Gli esperimenti di picco e recupero dovrebbero portare a recuperi medi vicini al 100% del valore atteso.

Cosa aspettarsi

Un kit può mostrare un vantaggio rispetto all'altro kit per un particolare tipo di campione e target. Ad esempio, una coppia di anticorpi di cattura e rilevamento può offrire una maggiore sensibilità e specificità rispetto a un'altra coppia quando si utilizza una matrice di campioni complessa. Le sottostima o sovrastima delle concentrazioni proteiche dovrebbero diventare evidenti quando si esaminano i dati di picco e recupero. Se la proteina addizionata ha valori al di fuori di un intervallo previsto del 70-130%, il test potrebbe non essere in grado di quantificare accuratamente quella proteina. È comune vedere solo piccole differenze nei risultati di quantificazione, che possono derivare da differenze nella calibrazione degli standard proteici tra i kit. In questo scenario, dovresti vedere tendenze simili nella quantificazione delle proteine ​​in cui le concentrazioni misurate sono alte, medie o basse per entrambi i kit. Se i kit funzionano in modo simile, altri fattori come la facilità d'uso ed il tempo del flusso di lavoro possono influire sulla scelta finale. Ad esempio, i kit Invitrogen™ Instant ELISA™ includono piastre prerivestite con anticorpi di cattura, anticorpi di rilevamento, streptavidina–HRP e diluente per campioni. Tutto il lavoro di preparazione è stato svolto per te, il che riduce i tempi del flusso di lavoro e aiuta a ridurre al minimo le variazioni.

Come interpretare le informazioni sulle prestazioni

 I fornitori in genere forniscono una serie di dati sulle prestazioni per i kit ELISA. Questa sezione è una sintesi dei parametri di prestazione più importanti da valutare prima di prendere una decisione di acquisto.

 • Sensibilità analitica: è uno standard industriale per i produttori di ELISA per riportare la sensibilità analitica, più comunemente nota come limite di rilevamento (LOD). La sensibilità analitica è la concentrazione di analita più bassa che può essere rilevata sopra lo sfondo. La concentrazione di fondo viene calcolata aggiungendo 2 deviazioni standard alla densità ottica media del mezzo di diluizione. La sensibilità analitica non va confusa con la sensibilità funzionale. La sensibilità funzionale, o limite di quantificazione più bassa (LLOQ), è la concentrazione più bassa alla quale l'analita può essere rilevato in modo affidabile.

Mentre la sensibilità funzionale potrebbe essere più utile per i ricercatori, la sensibilità analitica è ciò che viene riportato dalla maggior parte dei fornitori.

 • Precisione intra-saggio: la precisione intra-saggio si riferisce ai replicati del campione sulla stessa piastra. I pozzetti replicati dovrebbero fornire risultati comparabili per ciascun campione. Il CV tra le repliche dovrebbe essere inferiore al 10%.

• Precisione inter-saggio: la precisione inter-saggio si riferisce a campioni replicati analizzati in giorni e piastre diverse. Questo test tende ad essere più variabile della precisione intra-test, quindi i valori CV possono essere più alti. La precisione tra i test aiuta a garantire che i risultati ottenuti siano coerenti nel tempo e tra i kit.

 • Picco e recupero: questo test mostra se la vera concentrazione di un campione è ottenuta senza interferenze. Alcune proteine ​​bersaglio possono trovarsi in matrici complesse come plasma o siero, che possono causare problemi con la cattura e il legame degli anticorpi. Per determinare se tutta una proteina bersaglio viene catturata durante il test, una concentrazione nota della proteina viene aggiunta nella matrice del campione e misurata utilizzando il test. Idealmente, il recupero dovrebbe essere vicino al 100%.

 • Parallelismo: questo test si riferisce a un'accuratezza simile del test rispetto allo standard proteico ricombinante del kit ed alla proteina nel campione naturale. I risultati per la proteina campione naturale e lo standard ricombinante dovrebbero essere paralleli.

• Linearità della diluizione: un campione con bassi livelli di proteine ​​viene addizionato con una quantità nota di analita e valutato a diverse diluizioni. Il recupero dovrebbe essere vicino al 100% per le concentrazioni di spike nella porzione lineare della curva standard.

Conclusione

Prima di investire in uno studio critico od a lungo termine, è importante comprendere le prestazioni di un kit ELISA con un particolare campione di ricerca. A causa dell'ampia varietà di kit ELISA disponibili da diversi fornitori, la scelta del kit non è sempre semplice. L'approccio sperimentale e i parametri di prestazione qui delineati sono progettati per aiutare i ricercatori a scegliere il kit che meglio si adatta alle esigenze del loro progetto.

Da:

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Technical-Notes/compare-elisa-kit-performance-between-different-vendors-tech-note.pdf?CID=EM5069207_T_.ProfileValues.EMEA&EMID=giuseppecotellessa@virgilio.it