Immuno-oncology / Immuno-oncologia

 Immuno-oncology / Immuno-oncologia

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

A complicated relationship:

Deciphering tumor–immune interactions

The role of immune cells in tumor microenvironments (TME) is as complex as the immune system itself. While some immune cells play a critical role in immunosurveillance, or rejection of cells recognized as malignant tumor cells, chronic inflammation has been linked to the promotion of tumor cell growth, survival, and angiogenesis. Our growing understanding of the communication between tumor and immune cells, such as immune checkpoint pathways, underlying these diverse functions has been critical to revolutionizing cancer treatment with immunotherapies.

Key focus areas of immuno-oncology studies include defining the immune cell types in the TME,

understanding the fundamental mechanisms of these cells in cancer pathogenesis, searching for

novel immunotherapy targets, and/or characterizing therapeutic responses of potential candidates.

Regardless of the goal, a common challenge faced by scientists is the frequently low abundance of

immune cells within the TME and their heterogeneous nature. Bulk analysis methods, such as RNA-seq and microarray studies, whose readouts may be dominated by the most abundant cell populations, lack resolution for these investigations. Single cell multiomics technologies, however, are enabling the high-resolution molecular phenotyping of immune infiltrating cells and other cells present within a tumor. In addition to parsing the transcriptional and/or protein expression profiles of single cells, single cell immune profiling enables full-length, paired T-cell or B-cell receptor sequencing, providing a direct correlation between cell phenotype and clonotype, as well as clonal lineage tracking.

Figure 1. Exploring the complex interactions of the immune and tumor microenvironment contexture. / / Esplorare le complesse interazioni del contesto del microambiente immunitario e tumorale. 

1) How does cellular function and spatial organization affect immune cell accessibility and recruitment? / In che modo la funzione cellulare e l'organizzazione spaziale influenzano l'accessibilità e il reclutamento delle cellule immunitarie?

2) What immune cell types shape the tumor microenvironment during cancer progression and metastasis? / Quali tipi di cellule immunitarie modellano il microambiente tumorale durante la progressione e la metastasi del cancro?

3) What are the growth factors and receptors induced by inflammatory pathways that

contribute to tumor angiogenesis? / Quali sono i fattori di crescita e i recettori indotti dalle vie infiammatorie che contribuiscono all'angiogenesi tumorale?

4) What cells and molecular pathways have the highest therapeutic potential?  / Quali cellule e vie molecolari hanno il più alto potenziale terapeutico?

Characterizing response to immune checkpoint blockade

Several immune checkpoint blockade therapies, such as anti-CTLA-4 and anti-PD-1/PD-L1, are

currently on the market with many patients experiencing durable clinical response. However,

the mechanism of T-cell response to checkpoint blockade is still being characterized. Yost et al.

investigated the origins of T-cell receptor (TCR) clones and transcriptional phenotypes observed

following anti-PD-1 blockade therapy in patients with basal or squamous cell carcinoma. From

paired 5’ scRNA-seq and TCR sequencing data of 79,046 cells, an enrichment of exhausted CD8+

T cells featuring transcriptional signatures consistent with chronic activation, tumor reactivity,

and T-cell dysfunction was observed post-treatment. Immune repertoire analysis revealed

that the TCR clonotypes identified following blockade were largely novel when compared to the

pre-treatment repertoire, which suggests that T cells from peripheral blood are responsible for the

T-cell response generated by anti-PD-1 blockade.

Despite the successful application of immune checkpoint blockade approaches, some tumors

have proven resistant while others acquire resistance over time. This diversity in response

indicates that there are secrets yet to be unearthed when it comes to comprehending the intricate

interplay between cancer and immune cells. Some researchers are turning to the epigenome for

those hidden clues. Satpathy et al. performed a single cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (scATAC-seq) to dissect the role of epigenomic landscapes in T-cell responsiveness to PD-1 blockade. Focusing on exhausted CD8+ T cells, the authors discovered that PD-1 blockade leads to large-scale remodeling of the chromatin accessibility landscape and identified key regulatory elements with accessibility specific to the post-treatment exhaustion state.

Importantly, the team discovered that this exhausted T-cell state is not reversed by checkpoint

blockade, further corroborating the finding that the anti-tumor response is driven by a

replenishment of T cells from outside the tumor.

Profiling responses to engineered cell therapies

Targeting T cells to tumors via engineered chimeric antigen receptors (CARs) and TCRs represents

another major cancer immunotherapy strategy. Since the success of these therapies is based

on the expansion of the engineered T cells in vivo, Sheih et al. turned to paired single cell TCR

sequencing and RNA-seq to understand the fate of these cells post-infusion. In particular,

the group was interested in understanding the phenotypic behaviors driving clonal expansion and

shrinkage observed over time in patients. The transcriptional profiles of CD8+ CAR-T cells circulating in the blood increasingly diverged from the initial activated signatures of the infusion product throughout post-infusion timepoints without evidence of an exhaustion state. Tracking of the TCR clonotypes revealed a variation in the contribution of the various clonotypes to the circulating CAR-T cell pool.

Stadtmauer et al. similarly used scRNA-seq for tracking the transcriptomic evolution of CRISPR

engineered T cells. A novel multiplex editing strategy was implemented to target three genes

simultaneously. The genes encoding the cells’ TCR alpha and beta chains were deleted to prevent

mispairing of the transgenic TCR with these endogenous chains. Additionally, the gene encoding

PD-1 was also knocked down to improve anti-tumor immunity. Transcriptomic analysis allowed

the tracking of the engineered T cells in one of the patients for up to four months in vivo. The infused

cells showed phenotypic heterogeneity over time with a subset going on to establish a gene expression signature state associated with acquired central memory. It is worth noting that a culture of these cells obtained from the patient nine months after infusion still retained anti-tumor cytotoxicity.

Much like traditional cancer therapies, immune cell therapies are not exempt from acquired

resistance. Comprehending the fundamental biology that drives this process is crucial to allow the development of actionable strategies for its prevention or treatment. Paulson et al. investigated the mechanism of acquired resistance to a combination immunotherapy strategy, using both autologous CD8+ T cells and immune checkpoint inhibitors, for metastatic Merkel cell carcinoma. For one patient’s samples, scRNA-seq of tumor digests showed that resistance was driven by a novel immune escape mechanism involving the transcriptional downregulation of the human leukocyte antigen gene, meaning that the antigen targeted by the combo immunotherapy was lost.

 This result was validated in a second patient.

 Excitingly, the study went on to show that this downregulation was reversible with hypomethylating agents in vitro.

Conclusion

To harness the full power of immunotherapies, scientists must more completely understand the

foundations of immune cell function in the context of cancer. Single cell multiomics is paving the

way for immuno-oncology researchers to decipher the complex communication between immune

cells—both endogenous and from adoptive cell therapies—and cells in the tumor microenvironment.

ITALIANO

Una relazione complicata:

Decifrare le interazioni tra tumore e sistema immunitario

Il ruolo delle cellule immunitarie nei microambienti tumorali (TME) è complesso quanto il sistema immunitario stesso. Mentre alcune cellule immunitarie svolgono un ruolo fondamentale nell'immunosorveglianza o nel rigetto delle cellule

riconosciute come cellule tumorali maligne, l'infiammazione cronica è stata collegata alla promozione di crescita, sopravvivenza e angiogenesi delle cellule tumorali. La nostra crescente comprensione della comunicazione

tra il tumore e le cellule immunitarie, come le vie del checkpoint immunitario, alla base di queste diverse funzioni è stato fondamentale per rivoluzionare il trattamento del cancro con le immunoterapie.

Le principali aree di interesse degli studi di immuno-oncologia includono la definizione dei tipi di cellule immunitarie nella TME, comprendere i meccanismi fondamentali di queste cellule nella patogenesi del cancro, ricercare nuovi bersagli immunoterapici e/o caratterizzazione delle risposte terapeutiche di potenziali candidati.

Indipendentemente dall'obiettivo, una sfida comune affrontata dagli scienziati è l'abbondanza spesso bassa di cellule immunitarie all'interno del TME e la loro natura eterogenea. Metodi di analisi di massa, come studi di RNA-seq e microarray, le cui letture possono essere dominate dalla cellula più abbondante nelle popolazioni, mancano di risoluzione per queste indagini. Le tecnologie multiomiche unicellulari, tuttavia, stanno consentendo la fenotipizzazione molecolare ad alta risoluzione di cellule immunitarie infiltranti ed altre

cellule presenti all'interno di un tumore. Oltre ad analizzare l'espressione trascrizionale e/o proteica dei profili di singole cellule, la profilazione immunitaria a cellula singola consente il sequenziamento dei recettori dei  linfociti T o linfociti B accoppiati a lunghezza intera, fornendo una correlazione diretta tra fenotipo cellulare e clonotipo, così come il tracciamento del lignaggio clonale.

Risposta caratterizzante al blocco del checkpoint immunitario

Diverse terapie di blocco del checkpoint immunitario, come anti-CTLA-4 e anti-PD-1/PD-L1, sono attualmente sul mercato con molti pazienti che sperimentano una risposta clinica duratura.

 Tuttavia, il meccanismo della risposta dei linfociti T al blocco del checkpoint è ancora in fase di caratterizzazione. Yost et al. ha studiato le origini dei cloni del recettore delle cellule T (TCR) ed i fenotipi trascrizionali osservati in seguito a terapia di blocco anti-PD-1 in pazienti con carcinoma a cellule basali o squamose. A partire dall'accoppiato 5' scRNA-seq e dati di sequenziamento TCR di 79.046 cellule, un arricchimento di CD8+ esaurito

Linfociti T caratterizzati da firme trascrizionali coerenti con attivazione cronica, reattività tumorale,

e la disfunzione dei linfociti T è stata osservata dopo il trattamento. Rivelata l'analisi del repertorio immunitario che i clonotipi TCR identificati in seguito al blocco erano in gran parte nuovi rispetto al repertorio pre-trattamento, il che suggerisce che i linfociti T del sangue periferico siano responsabili della risposta dei linfociti T generata dal blocco anti-PD-1.

Nonostante l'applicazione di successo degli approcci di blocco del checkpoint immunitario, alcuni tumori si sono dimostrati resistenti mentre altri acquisiscono resistenza nel tempo. Questa diversità in risposta indica che ci sono segreti ancora da scoprire quando si tratta di comprendere l'intricata interazione tra cancro e cellule immunitarie. Alcuni ricercatori si stanno rivolgendo all'epigenoma per quegli indizi nascosti. Satpatia et al. eseguito un test a cellula singola per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (scATAC-seq) per analizzare il ruolo dei paesaggi epigenomici nella reattività dei linfociti T al blocco PD-1. Concentrandosi sulle cellule T CD8+ esaurite, gli autori hanno scoperto che il blocco PD-1 porta ad un rimodellamento su larga scala del panorama dell'accessibilità della cromatina e alla chiave identificata da elementi normativi con accessibilità specifica allo stato di esaurimento post-trattamento.

È importante sottolineare che il gruppo ha scoperto che questo stato esausto dei linfociti T non viene invertito dal blocco del  checkpoint, corroborando ulteriormente la constatazione che la risposta antitumorale è guidata dal rifornimento di cellule T dall'esterno del tumore.

Risposte di profilazione alle terapie cellulari ingegnerizzate

Rappresenta il targeting delle cellule T ai tumori tramite i recettori dell'antigene chimerico ingegnerizzati (CAR) ed i TCR un'altra importante strategia di immunoterapia del cancro. Dal momento che il successo di queste terapie si basa

sull'espansione delle cellule T ingegnerizzate in vivo, Sheih et al. ha trasformato in TCR a cellula singola accoppiato al sequenziamento e RNA-seq per comprendere il destino di queste cellule dopo l'infusione. In particolare, il gruppo era interessato a comprendere i comportamenti fenotipici che guidano l'espansione clonale e restringimento osservato nel tempo nei pazienti. I profili trascrizionali delle cellule CD8+ CAR-T circolanti

nel sangue si discostava sempre più dalle firme attivate iniziali del prodotto per infusione

durante i punti temporali post-infusione senza evidenza di uno stato di esaurimento. Tracciamento dei clonotipi TCR hanno rivelato una variazione nel contributo dei vari clonotipi alla circolazione del

pool di cellule CAR-T .

Stadtmauer et al. scRNA-seq hanno utilizzato in modo simile per monitorare l'evoluzione trascrittomica di CRISPR in cellule T ingegnerizzate. È stata implementata una nuova strategia di editing multiplex per prendere di mira tre geni contemporaneamente. I geni che codificano per le catene TCR alfa e beta delle cellule sono stati eliminati per prevenire mispairing del TCR transgenico con queste catene endogene. Inoltre, la codifica del gene PD-1 è stato anche abbattuto per migliorare l'immunità antitumorale. 

Analisi trascrittomica ha consentito il monitoraggio delle cellule T ingegnerizzate in uno dei pazienti fino a quattro mesi in vivo. L'infuso delle cellule ha mostrato eterogeneità fenotipica nel tempo con un sottoinsieme che ha continuato a stabilire un'espressione genica nello stato della firma associato alla memoria centrale acquisita. Vale la pena notare che una cultura di queste cellule ottenute dal paziente nove mesi dopo l'infusione conservavano ancora la citotossicità antitumorale.

Proprio come le terapie antitumorali tradizionali, le terapie con cellule immunitarie non sono esenti da quelle con acquisizione di resistenza. Comprendere la biologia fondamentale che guida questo processo è fondamentale per consentire lo sviluppo di strategie attuabili per la sua prevenzione o cura. Paulson et al. hanno studiato il meccanismo di resistenza acquisita a una strategia di immunoterapia combinata, utilizzando entrambe le autologhe cellule T CD8+ e inibitori del checkpoint immunitario, per carcinoma a cellule di Merkel metastatico. Per campioni del paziente, scRNA-seq del tumore digerito ha mostrato che la resistenza era guidata da un nuovo meccanismo di fuga del sistema immunitario che coinvolge la downregulation trascrizionale dell'antigene del gene leucocitario umano, il che significa che l'antigene preso di mira dall'immunoterapia combinata è stato perso. Questo risultato è stato validato in un secondo paziente. Emozionante, lo studio ha continuato a dimostrare che questa downregulation

era reversibile con agenti ipometilanti in vitro.

Conclusione

Per sfruttare tutta la potenza delle immunoterapie, gli scienziati devono comprendere in modo più completo fondamenti della funzione delle cellule immunitarie nel contesto del cancro. La multiomica unicellulare sta spianando il campo per i ricercatori di immuno-oncologia in modo da decifrare la complessa comunicazione tra immuni cellule, sia endogene che da terapie cellulari adottive, e cellule nel microambiente tumorale.

Da:

https://ebooks.10xgenomics.com/view/259473531/22-23/