I sistemi CRISPR-Cas ottengono flessibilità locale, mantengono la specificità globale / Local Flexibility, Retain Global Specificity

I sistemi CRISPR-Cas ottengono flessibilità locale, mantengono la specificità globale / Local Flexibility, Retain Global Specificity

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

 

Nell'editing del genoma, è possibile avere troppe cose buone, una cosa buona nota come specificità. Di solito, la specificità è molto desiderata. Aiuta a ridurre al minimo il potenziale di effetti fuori bersaglio. Tuttavia, la specificità può avere un aspetto negativo. Può rendere più difficile riconoscere le sequenze di DNA che contengono polimorfismi naturali.

Considera le implicazioni pratiche. Ad esempio, se un sistema di modifica del genoma è altamente specifico, può prendere di mira un gene particolare ignorando variazioni leggermente diverse di quel gene. Inoltre, nelle applicazioni diagnostiche, gli strumenti di modifica del genoma possono essere eccessivamente precisi, rilevando solo uno dei numerosi agenti patogeni strettamente correlati.

Per evitare problemi come questi, i ricercatori dell'Università di Toronto hanno sviluppato sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas che sono un po' meno discriminatori, almeno quando è nel posto giusto, più o meno. Questi sistemi hanno un piccolo margine di manovra perché incorporano RNA guida che sostituiscono basi "universali" per una o più delle solite quattro basi RNA.

Che sia naturale o sintetica, una base universale è indiscriminata. Cioè, è disposto ad accoppiarsi con basi di altro tipo, non solo con basi di un tipo particolare.

"Funziona come un asterisco o un carattere jolly in una ricerca digitale, in aree in cui prevediamo variazioni o non abbiamo dati", ha affermato Basil Hubbard, PhD, professore associato di farmacologia e tossicologia all'Università di Toronto. “Con la terapia, possiamo indirizzare varianti comuni dello stesso gene da persona a persona, come i polimorfismi a singolo nucleotide. Per la diagnostica, possiamo rilevare più varianti evolute dello stesso patogeno".

Hubbard è stato il principale ricercatore in un progetto di ricerca culminato in un nuovo articolo, " Gli RNA guida contenenti basi universali consentono il riconoscimento Cas9/Cas12a di sequenze polimorfiche ". Questo documento, apparso su Nature Communications , ha introdotto una strategia per espandere le capacità di CRISPR-Cas al riconoscimento di "bersagli di acidi nucleici con elevata variabilità e quelli per i quali sono disponibili solo informazioni di sequenza incomplete".

"[Noi] dimostriamo che Cas9 può tollerare l'inclusione di basi universali nei singoli RNA guida, consentendo il targeting simultaneo di sequenze polimorfiche", hanno riferito gli autori dell'articolo. "Dimostriamo l'applicabilità di questa tecnologia al targeting di più SNP umani presenti in natura con RNA guida individuali e alla progettazione di sonde DETECTR basate su Cas12a/Cpf1 in grado di identificare molteplici varianti evolute del gene della proteasi dell'HIV".

Le terapie sperimentali CRISPR hanno dimostrato il potenziale per eliminare i disturbi genetici, tra cui l'anemia falciforme e la distrofia muscolare. Ma queste terapie non sempre funzionano in parte a causa delle variazioni genetiche naturali tra gli individui, secondo alcuni studi.

Hubbard ha detto che l'approccio del suo gruppo potrebbe aiutare ad affrontare questo problema, ma che attualmente funziona meglio in vitro e che dovrebbe funzionare più velocemente nell'ambiente cellulare, forse con un enzima Cas riprogettato.

La tecnologia mostra più promesse per l'applicazione immediata nella diagnostica. Il laboratorio di Hubbard ha testato la funzione del sistema in otto varianti dell'HIV, ciascuna con diversa resistenza agli attuali farmaci antivirali. Un RNA guida standard senza basi universali ha rilevato solo tre delle otto varianti, mentre un sistema con solo tre sostituzioni di basi universali ha rilevato tutte e otto le varianti.

"Esiste un'enorme diversità tra i patogeni, in particolare virus e batteri, e si evolvono molto rapidamente", ha sottolineato Hubbard. "Il sistema funziona molto bene per rilevare questo tipo di variazione e pensiamo che potrebbe essere utile in tutte le condizioni cliniche".

Hubbard ha concepito l'idea di utilizzare basi universali mentre lavorava per rendere più specifici i sistemi CRISPR-Cas. Il suo laboratorio, allora con sede presso l'Università dell'Alberta, ha dimostrato che l'inserimento di acidi nucleici sintetici o "xeno" negli RNA guida potrebbe ridurre drasticamente l'editing genico fuori bersaglio con CRISPR-Cas9. (Lo scorso autunno Hubbard ha trasferito il suo laboratorio all'Università di Toronto.)

Gli effetti fuori bersaglio che tagliano un gene errato potrebbero avere conseguenze dannose per la salute di un paziente, compreso lo sviluppo di tumori.

"Il nostro studio attuale ci offre più opzioni per personalizzare la specificità di CRISPR", ha affermato Hubbard. "È importante sottolineare che la specificità di questo sistema viene interrotta solo nella regione in cui incorporiamo basi universali ed è preservata in altre aree della sequenza, riducendo così al minimo gli effetti fuori bersaglio".

Il laboratorio di Hubbard ha depositato un brevetto sulla tecnologia e sta cercando di collaborare con un'azienda specializzata in diagnostica CRISPR. È fiducioso che il sistema aiuterà a fornire un modo rapido, accurato ed economico per diagnosticare diverse malattie tra cui COVID-19.

ENGLISH

In genome editing, it is possible to have too much of a good thing—a good thing known as specificity. Usually, specificity is much desired. It helps minimize the potential for off-target effects. However, specificity can have a downside. It can make it harder to recognize DNA sequences that contain naturally occurring polymorphisms.

Consider the practical implications. For example, if a genome editing system is highly specific, it may target a particular gene while ignoring slightly different variations of that gene. Also, in diagnostic applications, genome editing tools may be overly precise, detecting just one of several closely related pathogens.

To avoid problems such as these, researchers at the University of Toronto have developed CRISPR-Cas genome editing systems that are a little less discriminating, at least when it is in the right place, more or less. These systems have a little wriggle room because they incorporate guide RNAs that substitute “universal” bases for one or more of the usual four RNA bases.

Whether it is natural or synthetic, a universal base is indiscriminate. That is, it is willing to pair with bases of other kinds, not just bases of a particular kind.

“It functions like an asterisk or wildcard in a digital search, in areas where we expect variation or don’t have data,” said Basil Hubbard, PhD, an associate professor of pharmacology and toxicology at the University of Toronto. “With therapeutics, we can target common variants of the same gene from person to person, such as single nucleotide polymorphisms. For diagnostics, we can detect multiple evolved variants of the same pathogen.”

Hubbard served as the principal investigator in a research project that culminated in a new paper, “Guide RNAs containing universal bases enable Cas9/Cas12a recognition of polymorphic sequences.” This paper, which appeared in Nature Communications, introduced a strategy for expanding the capabilities of CRISPR-Cas to the recognition of “nucleic acid targets with high variability and those for which only incomplete sequence information is available.”

“[We] demonstrate that Cas9 can tolerate the inclusion of universal bases in individual guide RNAs, enabling simultaneous targeting of polymorphic sequences,” the article’s authors reported. “We demonstrate the applicability of this technology to targeting multiple naturally occurring human SNPs with individual guide RNAs and to the design of Cas12a/Cpf1-based DETECTR probes capable of identifying multiple evolved variants of the HIV protease gene.”

Experimental CRISPR therapies have shown potential to eliminate genetic disorders, including sickle-cell anemia and muscular dystrophy. But these therapies do not always work in part due to natural genetic variations among individuals, according to some studies.

Hubbard said that his group’s approach could help address this problem, but that it currently works best in vitro and it would need to run faster in the cellular environment, perhaps with a re-engineered Cas enzyme.

The technology shows more promise for immediate application in diagnostics. Hubbard’s laboratory tested the system’s function in eight variants of HIV, each with differing resistance to current antiviral drugs. A standard guide-RNA without universal bases detected only three of the eight variants, while a system with just three universal-base substitutions found all eight variants.

“There is tremendous diversity among pathogens, especially viruses and bacteria, and they evolve very quickly,” Hubbard pointed out. “The system works very well to detect that kind of variation, and we think it could be useful across clinical conditions.”

Hubbard conceived the idea of using universal bases while working to make CRISPR-Cas systems more specific. His laboratory, then based at the University of Alberta, showed that insertion of synthetic or “xeno” nucleic acids into guide RNAs could dramatically reduce off-target gene editing with CRISPR-Cas9. (Hubbard moved his laboratory to the University of Toronto last fall.)

Off-target effects that cut an incorrect gene could have detrimental health consequences in a patient, including the development of cancers.

“Our current study gives us more options for tailoring CRISPR specificity,” Hubbard asserted. “Importantly, the specificity of this system is disrupted only at the region where we incorporate universal bases and is preserved in other areas of the sequence, thereby keeping off-target effects to a minimum.”

Hubbard’s laboratory has filed a patent on the technology and is looking to partner with a company that specializes in CRISPR diagnostics. He is hopeful the system will help provide a fast, accurate, and cost-effective way to diagnose several diseases including COVID-19.

Da:

https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/crispr-cas-systems-gain-local-flexibility-retain-global-specificity/?fbclid=IwAR0FqxBCkGnvC5ioR2CyQVQSmwlH4tXS0eOv6_iwl6J1wEfCrUCUhPcY4vo