Why qPCR is the gold standard for COVID-19 testing / Perché qPCR è il gold standard per i test COVID-19
Why qPCR is the gold standard for COVID-19 testing / Perché qPCR è il gold standard per i test COVID-19
Every day there’s a new headline about the best ways to test for SARS-CoV-2 virus, the virus that causes COVID-19. In the following Q&A, Joshua Trotta, Senior Director Business Development, discusses what you need to know about qPCR, the gold standard for COVID-19 testing. This is a follow-up to our “How does a COVID-19 test work?” interview with Joshua on Science with a Twist earlier this year.
What is an RT-qPCR test?
“PCR” is shorthand for “polymerase chain reaction,” a scientific methodology to make millions and billions of copies of a specific DNA sample, which for the past 25 years has been one of the most widely used techniques in molecular biology.
The genetic material in SARS-CoV-2 virus is stored in RNA. In the case of COVID-19 testing, RNA from a SARS-CoV-2 sample is first converted to its complementary DNA sequence by a process called reverse transcription (RT). The DNA thus transcribed is amplified by qPCR, where “q” stands for “quantitative”; hence the technique is called RT-qPCR.
RT-qPCR can detect the genetic information (RNA) of the novel coronavirus—even if the virus is present in extremely small amounts. Researchers estimate that RT-qPCR can detect as little as ~1,000 copies of viral RNA per milliliter, or 10 copies per analytical limit of detection (LoD). This means it is possible to diagnose someone as positive for COVID-19 even when their sample contains a very small amount of virus.
This means that COVID-19 RT-qPCR tests are not only able to detect the virus’s genetic information, they are also able to quantify the amount of that genetic information that is present in a sample. The Applied Biosystems TaqPath COVID-19 Combo Kit from Thermo Fisher Scientific is designed to detect the presence of the virus at very low levels and uses an algorithm to provide a positive or negative result.
How is a SARS-CoV-2 sample collected for RT-qPCR testing?
Samples can be collected in a few different ways. To test if someone with COVID-19 symptoms is infected with SARS-CoV-2, a health official might collect cells from the person’s nose and/or throat usually by using a nasal, throat or nasopharyngeal swab. Alternatively, a saliva sample can be collected.
As organizations look for routine testing solutions in workplaces and universities, they are also exploring options for self-collection. These self-collected samples are then sent to a lab where the RT-qPCR test is run, which takes about two to four hours to complete.
What is an antigen COVID-19 test?
While an RT-qPCR COVID-19 test detects the genetic material of the novel coronavirus, an antigen-based COVID-19 test is designed to detect something different: proteins on or within the virus.
For someone getting an antigen COVID-19 test, the sample is collected in the same way as for the RT-qPCR COVID-19 test—usually by nasopharyngeal swab. However, in the case of an antigen COVID-19 test, the sample does not need to be sent to a lab for analysis. Instead, it can be analyzed at the point of care in a process that can take as little as 15 minutes.
The trade-off for the speed and convenience of an antigen COVID-19 test is specificity. The antigen COVID-19 test requires a higher viral load in the sample to yield a positive result. As a result, someone who tests negative with an antigen test may actually have an active COVID-19 infection, but there are too few virus proteins present in the sample to register positive on the test. That same person my take an antigen test the next day and get a positive result, simply because they have more of the virus in their system.
What are the main differences between the different types of COVID-19 tests?
When it comes to COVID-19 testing, your choice of test type usually is a choice between accuracy and speed. You need to fully understand the tools available in the toolkit, and then pull out the right one at the right time.
A COVID-19 antigen test can provide results quickly, but RT-qPCR is considered the gold standard for COVID-19 testing as it provides a more definitive answer as to whether an individual has the virus in their body.
In fact, in situations where antigen testing is used for rapid screening, negative results are often sent to the lab for confirmatory RT-qPCR testing to verify if the individual is indeed virus-free.
In addition, there is a third type of test: a COVID-19 antibody test. An antibody test is a blood test that does not detect active virus. Instead, it detects antibodies to SARS-CoV-2. The presence of antibodies indicates that someone is actively dealing with, or recovered from, a COVID-19 infection.
What factors can lead to a false-positive or false-negative test result?
It’s also important to understand that, like any other diagnostic test, the results of COVID-19 tests can be impacted by sample collection. The reliability and accuracy of these tests depend on:
- How the sample was collected—it is always recommended to follow the manufacturer’s Instructions for Use (IFU) on the proper use of the test and approved sample collection methods.
- How many samples were collected—for nasopharyngeal and nasal swabs, samples from both nostrils are recommended.
- When the sample was collected—for example, someone who is newly infected may not have detectable amounts of virus in their system.
- How long ago the sample was taken—samples should arrive at the lab within 72 hours after collection.
- How the sample was stored before analysis—again, it is important to follow the manufacturer’s IFU, as extreme temperatures or other harsh conditions can damage viral molecular integrity.
What lies ahead for COVID-19 testing?
Health officials predict an increase in SARS-CoV-2 infections and they continue to weigh the pros and cons of different testing methodologies and protocols.
qPCR testing is going to become even more important given its ability to detect SARS-CoV-2 even when it’s present in extremely small quantities, like when someone has been recently infected and has a relatively small viral load.
With qPCR, it’s possible to make a diagnosis early on in the infection, meaning the infected individual can go into isolation earlier to prevent passing the virus on to others. Until a vaccine is widely available, testing is the key to stopping this crisis.
ITALIANO
Ogni giorno c'è un nuovo titolo sui modi migliori per testare il virus SARS-CoV-2, il virus che causa il COVID-19. Nella seguente sessione di domande e risposte, Joshua Trotta, Senior Director Business Development, discute ciò che devi sapere su qPCR, il gold standard per i test COVID-19. Questo è il seguito del nostro "Come funziona un test COVID-19?" intervista con Joshua su Science with a Twist all'inizio di quest'anno.
Che cos'è un test RT-qPCR?
"PCR" è l'abbreviazione di "reazione a catena della polimerasi", una metodologia scientifica per produrre milioni e miliardi di copie di un campione di DNA specifico, che negli ultimi 25 anni è stata una delle tecniche più utilizzate nella biologia molecolare.
Il materiale genetico nel virus SARS-CoV-2 è immagazzinato nell'RNA. Nel caso del test COVID-19, l'RNA di un campione SARS-CoV-2 viene prima convertito nella sua sequenza di DNA complementare mediante un processo chiamato trascrizione inversa (RT). Il DNA così trascritto viene amplificato mediante qPCR, dove “q” sta per “quantitativo”; quindi la tecnica è chiamata RT-qPCR.
RT-qPCR è in grado di rilevare le informazioni genetiche (RNA) del nuovo coronavirus, anche se il virus è presente in quantità estremamente ridotte. I ricercatori stimano che RT-qPCR sia in grado di rilevare fino a circa 1.000 copie di RNA virale per millilitro o 10 copie per limite di rilevamento analitico (LoD). Ciò significa che è possibile diagnosticare qualcuno come positivo al COVID-19 anche quando il suo campione contiene una quantità molto piccola di virus.
Ciò significa che i test COVID-19 RT-qPCR non solo sono in grado di rilevare le informazioni genetiche del virus, ma sono anche in grado di quantificare la quantità di tali informazioni genetiche presente in un campione. Il kit combinato Applied Biosystems TaqPath COVID-19 di Thermo Fisher Scientific è progettato per rilevare la presenza del virus a livelli molto bassi e utilizza un algoritmo per fornire un risultato positivo o negativo.
Come viene raccolto un campione SARS-CoV-2 per il test RT-qPCR?
I campioni possono essere raccolti in diversi modi. Per verificare se qualcuno con sintomi COVID-19 è infetto da SARS-CoV-2, un funzionario sanitario potrebbe raccogliere cellule dal naso e/o dalla gola della persona di solito utilizzando un tampone nasale, della gola o del nasofaringe. In alternativa, è possibile prelevare un campione di saliva.
Mentre le organizzazioni cercano soluzioni di test di routine nei luoghi di lavoro e nelle università, stanno anche esplorando opzioni per l'auto-raccolta. Questi campioni auto-raccolti vengono quindi inviati a un laboratorio in cui viene eseguito il test RT-qPCR, che richiede da due a quattro ore per essere completato.
Che cos'è un test per l'antigene COVID-19?
Mentre un test RT-qPCR COVID-19 rileva il materiale genetico del nuovo coronavirus, un test COVID-19 basato sull'antigene è progettato per rilevare qualcosa di diverso: proteine su od all'interno del virus.
Per qualcuno che riceve un test dell'antigene COVID-19, il campione viene raccolto nello stesso modo del test RT-qPCR COVID-19, di solito mediante tampone nasofaringeo. Tuttavia, nel caso di un test dell'antigene COVID-19, non è necessario inviare il campione a un laboratorio per l'analisi. Invece, può essere analizzato presso il punto di cura in un processo che può richiedere fino a 15 minuti.
Il compromesso per la velocità e la comodità di un test dell'antigene COVID-19 è la specificità. Il test dell'antigene COVID-19 richiede una carica virale più elevata nel campione per produrre un risultato positivo. Di conseguenza, qualcuno che risulta negativo con un test dell'antigene potrebbe effettivamente avere un'infezione attiva da COVID-19, ma ci sono troppo poche proteine virali presenti nel campione per risultare positive al test. Quella stessa persona il giorno dopo fa un test dell'antigene ed ottiene un risultato positivo, semplicemente perché ha più virus nel suo sistema.
Quali sono le principali differenze tra i diversi tipi di test COVID-19?
Quando si tratta di test COVID-19, la scelta del tipo di test di solito è una scelta tra precisione e velocità. È necessario comprendere appieno gli strumenti disponibili nel toolkit, quindi estrarre quello giusto al momento giusto.
Un test dell'antigene COVID-19 può fornire risultati rapidamente, ma RT-qPCR è considerato il gold standard per il test COVID-19 in quanto fornisce una risposta più definitiva sul fatto che un individuo abbia il virus nel proprio corpo.
Infatti, nelle situazioni in cui il test dell'antigene viene utilizzato per lo screening rapido, i risultati negativi vengono spesso inviati al laboratorio per il test RT-qPCR di conferma per verificare se l'individuo è effettivamente privo di virus.
Inoltre, esiste un terzo tipo di test: un test degli anticorpi COVID-19. Un test anticorpale è un esame del sangue che non rileva il virus attivo. Invece, rileva gli anticorpi contro SARS-CoV-2. La presenza di anticorpi indica che qualcuno sta affrontando attivamente o si sta riprendendo da un'infezione da COVID-19.
Quali fattori possono portare a un risultato del test falso positivo o falso negativo?
È anche importante capire che, come qualsiasi altro test diagnostico, i risultati dei test COVID-19 possono essere influenzati dalla raccolta del campione. L'affidabilità e l'accuratezza di questi test dipendono da:
Modalità di raccolta del campione: si consiglia sempre di seguire le Istruzioni per l'uso (IFU) del produttore sull'uso corretto del test e sui metodi di raccolta del campione approvati.
Quanti campioni sono stati raccolti: per i tamponi nasofaringei e nasali, si consigliano campioni da entrambe le narici.
Quando il campione è stato raccolto, ad esempio, qualcuno che è stato recentemente infettato potrebbe non avere quantità rilevabili di virus nel proprio sistema.
Quanto tempo fa è stato prelevato il campione: i campioni dovrebbero arrivare al laboratorio entro 72 ore dalla raccolta.
Come è stato conservato il campione prima dell'analisi: ancora una volta, è importante seguire le istruzioni per l'uso del produttore, poiché temperature estreme o altre condizioni difficili possono danneggiare l'integrità molecolare virale.
Cosa ci aspetta per i test COVID-19?
I funzionari sanitari prevedono un aumento delle infezioni da SARS-CoV-2 e continuano a valutare i pro ed i contro di diverse metodologie e protocolli di test.
Il test qPCR diventerà ancora più importante data la sua capacità di rilevare SARS-CoV-2 anche quando è presente in quantità estremamente ridotte, come quando qualcuno è stato infettato di recente e ha una carica virale relativamente piccola.
Con qPCR, è possibile fare una diagnosi all'inizio dell'infezione, il che significa che l'individuo infetto può isolarsi prima per evitare di trasmettere il virus ad altri. Fino a quando un vaccino non sarà ampiamente disponibile, i test sono la chiave per fermare questa crisi.
Da:
https://www.thermofisher.com/blog/clinical-conversations/why-qpcr-is-the-gold-standard-for-covid-19-testing/?CID=EM5079252_T_.WebForm.EMEA&EMID=giuseppecotellessa@virgilio.it
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