CRISPR: Pooled vs. Arrayed Workflows / CRISPR: flussi di lavoro in pool e in array

 CRISPR: Pooled vs. Arrayed Workflows / CRISPR: flussi di lavoro in pool e in array

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Steps of a pooled CRISPR screen. / Passaggi di una schermata CRISPR in pool.

 1. Library Construction: Plasmids encoding sgRNAs are PCR-amplified and validated via NGS to ensure that equal representation is maintained. The plasmids are then packaged into lentiviral particles (one guide per vector) containing a selectable marker (e.g., antibiotic resistance gene). Typically, more than one sgRNA is designed per gene to increase confidence in genotype to phenotype correlations. Libraries can also be purchased as pre-packaged viral particles.  / Costruzione della libreria: i plasmidi che codificano per gli sgRNA sono amplificati tramite PCR e convalidati tramite NGS per garantire che venga mantenuta una rappresentazione uguale. I plasmidi vengono quindi confezionati in particelle lentivirali (una guida per vettore) contenenti un marcatore selezionabile (ad esempio, gene di resistenza agli antibiotici). Tipicamente, più di un sgRNA è progettato per gene per aumentare la fiducia nelle correlazioni tra genotipo e fenotipo. Le biblioteche possono anche essere acquistate come particelle virali preconfezionate.

2. Library Delivery: The viral particles are then introduced to a single group of cells at low multiplicity of infection (MOI) to ensure that, on average, only one viral particle will enter each cell and insert the sgRNA sequence into the genome. Cas9 is expressed by using a Cas9-expressing cell line or through co-transduction. The population is then enriched for transduced cells (antibiotic selection) and subsequently expanded. Cells that proliferate pass on the sgRNA sequence to successive generations. /  Le particelle virali vengono quindi introdotte in un singolo gruppo di cellule a bassa molteplicità di infezione (MOI) per garantire che, in media, solo una particella virale entri in ciascuna cellula e inserisca la sequenza di sgRNA nel genoma. Cas9 viene espresso utilizzando una linea cellulare che esprime Cas9 o tramite co-trasduzione. La popolazione viene quindi arricchita per cellule trasdotte (selezione antibiotica) e successivamente ampliata. Le cellule che proliferano trasmettono la sequenza di sgRNA alle generazioni successive.

3. Selection: A positive or negative selective pressure is applied to select for the desired viability phenotype. Positive selection identifies knockouts that provide a growth advantage in the presence of the selective agent, whereas negative selection identifies knockouts that confer a survival disadvantage in the presence of the selective agent.  / Selezione: viene applicata una pressione selettiva positiva o negativa per selezionare il fenotipo di vitalità desiderato. La selezione positiva identifica i knockout che forniscono un vantaggio di crescita in presenza dell'agente selettivo, mentre la selezione negativa identifica i knockout che conferiscono uno svantaggio di sopravvivenza in presenza dell'agente selettivo.

4. Analysis: The frequency of each sgRNA in the cell population is measured via next-generation sequencing (NGS). The enrichment or depletion of particular sgRNAs following selection iimplicates gene perturbations that desensitize or sensitize cells to the selective agent. Note that the identity and relative abundance of sgRNAs in the manipulated cell population is the readout and not the edits made to the targeted genes. / Analisi: la frequenza di ciascun sgRNA nella popolazione cellulare viene misurata tramite il sequenziamento di nuova generazione (NGS). L'arricchimento o l'esaurimento di particolari sgRNA dopo la selezione implica perturbazioni geniche che desensibilizzano o sensibilizzano le cellule all'agente selettivo. Si noti che l'identità e l'abbondanza relativa di sgRNA nella popolazione cellulare manipolata è la lettura e non le modifiche apportate ai geni mirati.

Now that we have explored different types of functional assays, let’s look at how they are applied to CRISPR screening workflows. There are two types of CRISPR screening formats: pooled and arrayed. While both can be used for target identification and validation, they differ in methodology, equipment, and assay compatibility. Pooled screens involve delivering a mixed population of sgRNA-containing viral constructs into a single tube of cells, while arrayed screens target each gene separately with sgRNA across a multiwell plate. Below, we provide an overview of each. 

Pooled Screens 

Pooled screens involve introducing a “pool” of sgRNAs into a single population of cells. This is accomplished by packaging sgRNA-containing plasmids into lentiviral particles (one per vector), and then transducing host cells. The stable expression of guide (along with Cas9) facilities the knockouts of targeted genes. Because knockouts of all the targets occur in a single tube of cells, it is challenging to link the phenotype of each individual cell with the underlying genetic perturbation. Pooled screens are thus only compatible with binary assays that physically separate edited cells exhibiting a phenotype of interest from those that do not. After the cells are sorted, the integrated sgRNAs are deep sequenced and data must be deconvoluted. Enriched or depleted sgRNAs in the population confer information about the involvement of corresponding genes with the phenotype. See Figure 2 for the steps of a pooled screen that utilizes a positive/negative viability assay

Arrayed Screens 

Arrayed screening is a newer technology that is more versatile in both methodology and analysis than its pooled counterpart. Arrayed screens involve targeting one gene per well in a multiwell plate format. Library delivery may be accomplished through transient transfection or lentiviral transduction. Because gene targets are separated across wells, phenotypes do not need to be selected for and sequencing/ data deconvolution are not required to associate phenotypes with genotypes. Arrayed screens are compatible with both binary and multiparametric assays. See Figure  for a step-by-step description of an arrayed screen workflow.

Figure 2 : Steps of an arrayed CRISPR screen. / Passaggi di una schermata CRISPR in serie.

1. Library Construction: sgRNA libraries can be produced in a variety of formats: plasmid, lentivirus, or RNA oligonucleotides (synthetic sgRNA).  / Costruzione della libreria: le librerie di sgRNA possono essere prodotte in una varietà di formati: plasmide, lentivirus o oligonucleotidi di RNA (sgRNA sintetico).

2. Library Delivery: The sgRNA is introduced to cells (one target per well) through one of a variety of methods. Cas9 is either co-transfected as plasmid or protein (RNP), or a Cas9-expressing cell line is used.  /  Consegna della libreria: lo sgRNA viene introdotto nelle cellule (un bersaglio per pozzetto) attraverso uno di una varietà di metodi. Cas9 viene co-trasfettato come plasmide o proteina (RNP) oppure viene utilizzata una linea cellulare che esprime Cas9.

3. Selection (*optional): A selective pressure, may be applied to arrayed screens in order to test what genes, when ablated, affect one or more cellular phenotypes when under certain contexts.  /  Selezione (*opzionale): una pressione selettiva, può essere applicata a schermi disposte per testare quali geni, quando ablati, influenzano uno o più fenotipi cellulari quando in determinati contesti.

4. Analysis: Edited cells are assessed using an appropriate functional assay. Because each target is separated across wells, direct genotype-phenotype associations can be made. / Analisi: le cellule modificate vengono valutate utilizzando un saggio funzionale appropriato. Poiché ogni bersaglio è separato tra i pozzetti, è possibile creare associazioni dirette genotipo-fenotipo.

When to Use a Pooled or Arrayed Screen? 

Choosing a screening format based on a number of considerations, including the assay, cell model, and labor, among others. Below, we outline some of the advantages and disadvantages of each. Assay As described above, pooled screens are restricted to binary assays, with simple readouts, such as a cell survival/death or sortable biomarkers. Arrayed screens are compatible with binary and multiparametric assays, including those that assess complex phenotypes. Given these differences in versatility, it is important to consider what phenotype(s) would be most informative for answering your research question. For instance, if identifying genes that sensitize/desensitize a disease cell type to a given drug is the goal, then a pooled screen may be adequate. However, if the objective is to identify gene disruptions that cause changes in multiple morphological features, then an arrayed screen may be more appropriate. 

Cell Model 

The type of screen one chooses also depends on the cell model used. Appropriate cell models often depend on the stage of the screening workflow and disease of interest. For instance, whereas an immortalized cell line may be sufficient for primary screens, a more clinically relevant cell type may be preferred for secondary screens. Because pooled screens require the integration of sgRNA into the genome and passage to daughter cells, they are most appropriate for use with activelydividing cells. Pooled screens are thus not well-suited for primary cells and neurons, which have a limited capacity to proliferate. Alternatively, arrayed screens do not require an extended period of expansion and can be used with a wide variety of cell types. 

Time and Labor

Time and labor is another important factor. Pooled screens require a considerable amount of upfront work if viral packaging is done oneself. Also, because cells with different gene knockouts are mixed together in pooled screens, data deconvolution is necessary to untangle the genotype-phenotype relationships. Alternatively, arrayed screens have options that can save time and labor. For instance, some library formats (e.g., synthetic sgRNA) require little preparation and analysis can be relatively straightforward. However, optimization is required for these screens in order to ensure high editing efficiencies. 

Equipment 

Pooled and arrayed screens require different equipment. Whereas pooled screens can be conducted with a standard laboratory setup, arrayed screens may require specialized equipment and automation capabilities. In addition, a high-content system may be necessary to analyze image-based phenotypes. 

Financial Cost 

Pooled screens are relatively cost-effective to run, and thus offer a feasible way to interrogate the genome. Arrayed screens have a higher upfront cost, but can provide an abundance of high-quality information. Thus, these screens can ultimately save money in the long run if researchers do not need to conduct as many follow-up studies. 

Thinking Big Picture: Leveraging a Combination of Screen Types 

It is important to remember that pooled and arrayed screens can both be useful in screening workflows. For instance, if one aims to identify new drug targets, a pooled format may be appropriate as a primary screen to identify a broad set of target genes in an easy-to-transfect cell model (e.g., immortalized cell line). An arrayed format may then be used in a secondary screen to validate the hits using a more realistic model (e.g., primary cells). When designing a target identification experiment, consider all the tools at your disposal. 

CRISPR Reagents and Delivery Formats for Arrayed Screens 

All CRISPR screens involve the introduction of sgRNAs and Cas9 into cells. Whereas pooled screens always deliver sgRNA libraries using viral transduction, arrayed screens can deliver CRISPR components in a variety of ways. Let’s take a look at the different options.

Guide RNA Format

 DNA (plasmid) 

One way to deliver sgRNA libraries is through expression plasmids. A main benefit of this format is the large packaging capacity, such that multiple sgRNAs targeting a single gene can be cloned into one vector. Additionally, selection markers can be included in the backbone so that transfected cells can be easily isolated. However, the plasmid format has several drawbacks that should be taken into consideration. For instance, plasmids can remain active in cells for several weeks and thus can increase off-target effects. Unintended integration events into the genome can also disrupt surrounding genes. Lastly, plasmids have low transfection efficiency in some cell types, including primary cells. 

Lentivirus

Relative to plasmids, virus is a more popular method of library delivery for CRISPR screens. As in pooled screens, lentivirus can be used to stably transduce cells for arrayed screens. An advantage of lentivirus is its efficiency at delivering sgRNA libraries to a variety of cell types. Like plasmids, selectable markers can be used to isolate transduced cells. However, conducting large-scale arrayed screens using lentivirus is challenging, as vectors for hundreds of targets must be packaged separately. In addition, these screens are prone to cross contamination and often have high well-to-well titer variability. Moreover, continuous sgRNA expression can increase off-target effects, and random genomic integration can disrupt essential genes. Lastly, because additional time is required for selection of transduced cells and for transcription of sgRNA, the time to assay may be long. This presents a challenge for working in multiwell plates that are not conducive to long culture periods. Adeno-associated viruses (AAV) are another option for transgene delivery. These vectors usually remain in an extrachromosomal state, but have limited cargo capacity (~ 4.5 kb). Working with either virus requires extra safety requirements, including a BSL2 facility with appropriate training and infrastructure. 

Synthetic sgRNA

Single guide RNA can be produced at scale through synthetic manufacturing. A main benefit of synthetic production (as opposed to in vitro transcription) is that guides can be chemically modified to increase stability and prevent the triggering of innate immune responses within host cells.12 These modified sgRNAs have higher editing efficiencies than unmodified guides in a variety of cell types, including primary cells. Another benefit of the RNA format is that assays can be performed relatively quickly (sometimes only days post-transfection) compared to viral and plasmid formats. A drawback of synthetic guides is that transfection optimization is required to ensure high editing efficiencies. 

Cas9 Format

 Cas9-expressing cell lines are often preferred for arrayed screens, as it simplifies the workflow (i.e., only the sgRNA library needs to be delivered). However, because primary cells have limited capabilities for expansion, immortalized cells and iPS cells can only be used to develop stable Cas9-expressing cell lines. Alternatively, Cas9 can be co-transfected in a plasmid format. However, plasmid transfection risks cytotoxicity in sensitive cells and requires more time between transfection and assay (to allow transcription and translation of Cas9).

Lastly, Cas9 can be introduced as pre-complexed ribonucleoproteins (RNPs). One major advantage of this format is that editing is limited to a   short time frame (reducing the risk of off-target effects). Also, RNPs yield high editing efficiencies across a variety of cell types, including primary cells, iPS cells, and immortalized cells. 

Transfection Method

Arrayed screens are compatible with viral transduction, as well as several non-viral transfection methods. Lipid-based transfection (lipofection) uses cationic lipid reagents to deliver CRISPR components (e,g, plasmid, RNPs) into cells. The process first involves constructing lipid-soluble structures, called liposomes, around the components. The components are then transported into the cell through endocytosis, a process in which the plasma membrane surrounds the components on the exterior side, and buds off inside the cell. The CRISPR components then escape the endosomal pathway and diffuse through the cytoplasm. Lipid-based transfection is cost-effective, does not require special equipment, and is well-suited for high-throughput workflows. While this technique is commonly used for screening immortalized cells, it is not recommended for primary or stem cells. Electroporation is another popular transfection method for highthroughput screening. This technique involves suspending cells in a conductive solution and briefly applying high-voltage electrical pulses. The application of electricity induces the formation of temporary pores in the plasma membrane and the electrical potential across the membrane causes charged molecules (e.g., sgRNA/RNPs) to enter the cytoplasm through the pores. Transfection is often highly efficient and is appropriate for a variety of cell types (including primary and stem cells). However, it does require access to specialized equipment, such as an electroporator or NucleofectorTM.

Library Design 

Guide RNA

Design Guide design can have a profound effect on the outcome of a screen. For instance, sgRNA libraries that do not robustly knock out targets may not produce enough detectable signal, and hence lead to false negatives. Additionally, sgRNAs that have off-target editing can introduce noise into the system and ultimately complicate the analysis of results. Several factors can be taken into account to increase the robustness and specificity of sgRNA libraries. For instance, it is recommended that guides target early exons of protein-coding genes (to ensure protein function is completely terminated) and that guide sequences be evaluated in silico to minimize off-target editing. Also, multiple guides may be designed per target to increase the likelihood of a knockout. Guides may also be designed to strategically bias a type of genomic disruption. Most libraries are designed to depend on the generation of traditional frameshift-induced indels. However, because some indels are a multiple of three nucleotides (and do not shift the reading frame), the associated proteins may retain their function. Thus, knockout efficiencies may vary widely.

Synthego has addressed this issue by designing libraries that comprise multi-guide sgRNA, in which each gene is strategically targeted by up to three guides. The guides are designed to concurrently cut a target locus in an early exon, causing one or more fragment deletions. This strategy results in higher knockout efficiencies (and lower variance) than when the same guides are introduced individually. Now that we have outlined some factors of library design, let’s look at various libraries that are available for purchase. 

Types of Libraries 

Depending on the goal, researchers may want to target a large collection of genes that span the genome, or just or a small subset of candidates. To meet these needs, several vendors offer libraries in standard and custom formats.

Standard Libraries 

Standard libraries are pre-made “off the shelf” collections of sgRNA. These libraries are often used for primary screens that aim to assess a large number of genes for their involvement in a disease or pathway. The most comprehensive standard libraries are updated frequently to account for new genes, gene reclassifications, and SNV re-definitions. Synthego currently offers 30 standard libraries, including the whole human (19,753 genes), druggable, deubiquitinating enzymes (DUBS), GPCRs, kinases, and immuno-oncology targets, among others. All of these libraries are curated using multiple gene ontology and drug databases. 

Custom Libraries 

Custom libraries are subsets of gene targets that are chosen by the researcher. These libraries are often used in secondary screens to validate gene target hits from primary screens. Small custom libraries are also used in assay development to optimize conditions and timing, as well as to miniaturize the assay to a plate format.

Conclusion

 CRISPR has proved to be a compelling tool for functional genomics, as it enables researchers to associate changes in phenotypes with highly specific knockouts. CRISPR-mediated LOF screens are now commonplace for elucidating drug targets for therapeutic development across a variety of disease areas. Effective drug identification often forms the foundation of entire drug discovery programs and is critical to the success of bringing medications to market. Two screen types— pooled and arrayed—differ in both methodology and versatility. Whereas pooled screens rely on viral transduction and are limited to assessing binary phenotypes, arrayed screens can be used with a variety of delivery formats and can evaluate complex cellular characteristics. This latter method is becoming increasingly popular due to the richness of biological information that can be attained. Synthego’s Screening Libraries combine the utility of the arrayed format with the power of multi-guide design technology. Leveraging a unique design of multiple sgRNAs to generate fragment deletions, Synthego’s libraries induce highly reliable knockouts of each gene. With our standard and custom screening libraries, you can quickly and assess gene targets and move through your drug discovery pipeline with confidence.

ITALIANO

Ora che abbiamo esplorato diversi tipi di test funzionali, diamo un'occhiata a come vengono applicati ai flussi di lavoro di screening CRISPR. Esistono due tipi di formati di screening CRISPR: pooled e arrayed. Sebbene entrambi possano essere utilizzati per l'identificazione e la convalida del target, differiscono per metodologia, apparecchiature e compatibilità del test. Gli schermi in pool implicano la consegna di una popolazione mista di costrutti virali contenenti sgRNA in un singolo tubo di cellule, mentre gli schermi allineati prendono di mira ciascun gene separatamente con sgRNA su una piastra multiwell. Di seguito, forniamo una panoramica di ciascuno.

Schermi in pool

Gli schermi in pool implicano l'introduzione di un "pool" di sgRNA in una singola popolazione di cellule. Ciò si ottiene impacchettando i plasmidi contenenti sgRNA in particelle lentivirali (una per vettore) e quindi trasducendo le cellule ospiti. L'espressione stabile della guida (insieme a Cas9) facilita il knockout dei geni mirati. Poiché i knockout di tutti gli obiettivi si verificano in un singolo tubo di cellule, è difficile collegare il fenotipo di ogni singola cellula con la perturbazione genetica sottostante. Gli schermi in pool sono quindi compatibili solo con i saggi binari che separano fisicamente le cellule modificate che mostrano un fenotipo di interesse da quelle che non lo fanno. Dopo che le cellule sono state ordinate, gli sgRNA integrati vengono sequenziati in profondità ed i dati devono essere deconvoluti. Gli sgRNA arricchiti o impoveriti nella popolazione conferiscono informazioni sul coinvolgimento dei geni corrispondenti con il fenotipo. Vedere la Figura 1 per i passaggi di uno schermo in pool che utilizza un test di fattibilità positivo/negativo

Schermi allineati

Lo screening in array è una tecnologia più recente che è più versatile sia nella metodologia che nell'analisi rispetto alla sua controparte in pool. Gli schermi allineati implicano il targeting di un gene per pozzetto in un formato piastra multipozzetto. La consegna della libreria può essere ottenuta tramite trasfezione transitoria o trasduzione lentivirale. Poiché i bersagli genici sono separati tra i pozzetti, non è necessario selezionare i fenotipi e non è necessario il sequenziamento/deconvoluzione dei dati per associare i fenotipi ai genotipi. Gli schermi in array sono compatibili con i saggi binari e multiparametrici. Vedere la Figura 2 per una descrizione dettagliata di un flusso di lavoro con schermo in serie.

Quando utilizzare uno schermo in pool o in array?

Scelta di un formato di screening in base a una serie di considerazioni, tra cui il test, il modello cellulare e il lavoro, tra gli altri. Di seguito, delineiamo alcuni dei vantaggi e degli svantaggi di ciascuno. Saggio Come descritto sopra, gli schermi raggruppati sono limitati ai saggi binari, con letture semplici, come sopravvivenza/morte cellulare o biomarcatori ordinabili. Gli schermi in array sono compatibili con i saggi binari e multiparametrici, compresi quelli che valutano fenotipi complessi. Date queste differenze di versatilità, è importante considerare quali fenotipi sarebbero più informativi per rispondere alla tua domanda di ricerca. Ad esempio, se l'obiettivo è identificare i geni che sensibilizzano/desensibilizzano un tipo di cellula della malattia a un determinato farmaco, allora uno screening raggruppato può essere adeguato. Tuttavia, se l'obiettivo è identificare le interruzioni del gene che causano cambiamenti in più caratteristiche morfologiche, uno schermo in serie potrebbe essere più appropriato.

Modello cellulare

Il tipo di schermo scelto dipende anche dal modello di cellula utilizzato. I modelli cellulari appropriati spesso dipendono dalla fase del flusso di lavoro di screening e dalla malattia di interesse. Ad esempio, mentre una linea cellulare immortalata può essere sufficiente per gli schermi primari, un tipo cellulare più clinicamente rilevante può essere preferito per gli schermi secondari. Poiché gli schermi in pool richiedono l'integrazione di sgRNA nel genoma e il passaggio alle cellule figlie, sono più appropriati per l'uso con cellule che si dividono attivamente. Gli schermi raggruppati non sono quindi adatti per cellule e neuroni primari, che hanno una capacità limitata di proliferare. In alternativa, gli schermi in serie non richiedono un lungo periodo di espansione e possono essere utilizzati con un'ampia varietà di tipi di cellule.

Tempo e lavoro

Il tempo e il lavoro sono un altro fattore importante. Gli schermi in pool richiedono una notevole quantità di lavoro iniziale se l'imballaggio virale viene fatto personalmente. Inoltre, poiché le cellule con diversi knockout genici sono mescolate insieme in schermi raggruppati, la deconvoluzione dei dati è necessaria per districare le relazioni genotipo-fenotipo. In alternativa, gli schermi in serie hanno opzioni che possono far risparmiare tempo e manodopera. Ad esempio, alcuni formati di libreria (ad esempio, sgRNA sintetico) richiedono poca preparazione e l'analisi può essere relativamente semplice. Tuttavia, per queste schermate è necessaria l'ottimizzazione per garantire un'elevata efficienza di editing.

Attrezzatura

Gli schermi raggruppati e allineati richiedono attrezzature diverse. Mentre gli schermi in pool possono essere condotti con un'impostazione di laboratorio standard, gli schermi in serie possono richiedere attrezzature specializzate e capacità di automazione. Inoltre, potrebbe essere necessario un sistema ad alto contenuto per analizzare i fenotipi basati su immagini.

Costo finanziario

Gli schermi in pool sono relativamente economici da gestire e quindi offrono un modo fattibile per interrogare il genoma. Gli schermi in array hanno un costo iniziale più elevato, ma possono fornire un'abbondanza di informazioni di alta qualità. Pertanto, questi schermi possono alla fine risparmiare denaro a lungo termine se i ricercatori non hanno bisogno di condurre tanti studi di follow-up.

Pensare in grande: sfruttare una combinazione di tipi di schermo

È importante ricordare che gli schermi raggruppati ed allineati possono essere entrambi utili nei flussi di lavoro di screening. Ad esempio, se si mira a identificare nuovi bersagli farmacologici, un formato raggruppato può essere appropriato come schermo principale per identificare un'ampia serie di geni bersaglio in un modello cellulare facile da trasfettare (ad esempio, linea cellulare immortalata). Un formato in serie può quindi essere utilizzato in una schermata secondaria per convalidare i risultati utilizzando un modello più realistico (ad esempio, celle primarie). Quando progetti un esperimento di identificazione del bersaglio, considera tutti gli strumenti a tua disposizione.

Reagenti CRISPR e formati di consegna per schermi in array

Tutti gli schermi CRISPR comportano l'introduzione di sgRNA e Cas9 nelle cellule. Mentre gli schermi in pool forniscono sempre librerie di sgRNA utilizzando la trasduzione virale, gli schermi in array possono fornire componenti CRISPR in vari modi. Diamo un'occhiata alle diverse opzioni.

Formato RNA guida

 DNA (plasmide)

Un modo per fornire librerie di sgRNA è attraverso i plasmidi di espressione. Uno dei principali vantaggi di questo formato è la grande capacità di confezionamento, tale che più sgRNA che prendono di mira un singolo gene possono essere clonati in un vettore. Inoltre, i marcatori di selezione possono essere inclusi nella spina dorsale in modo che le cellule trasfettate possano essere facilmente isolate. Tuttavia, il formato plasmidico presenta diversi inconvenienti che dovrebbero essere presi in considerazione. Ad esempio, i plasmidi possono rimanere attivi nelle cellule per diverse settimane e quindi possono aumentare gli effetti fuori bersaglio. Eventi di integrazione non intenzionale nel genoma possono anche distruggere i geni circostanti. Infine, i plasmidi hanno una bassa efficienza di trasfezione in alcuni tipi cellulari, comprese le cellule primarie.

Lentivirus

Relativamente ai plasmidi, il virus è un metodo più popolare di consegna della libreria per gli schermi CRISPR. Come negli schermi in pool, il lentivirus può essere utilizzato per trasdurre in modo stabile le cellule per schermi disposti. Un vantaggio del lentivirus è la sua efficienza nel fornire librerie di sgRNA a una varietà di tipi cellulari. Come i plasmidi, i marcatori selezionabili possono essere utilizzati per isolare le cellule trasdotte. Tuttavia, la conduzione di schermate disposte su larga scala utilizzando lentivirus è impegnativa, poiché i vettori per centinaia di bersagli devono essere impacchettati separatamente. Inoltre, questi schermi sono soggetti a contaminazione incrociata e spesso hanno un'elevata variabilità del titolo da pozzo a pozzo. Inoltre, l'espressione continua di sgRNA può aumentare gli effetti fuori bersaglio e l'integrazione genomica casuale può interrompere i geni essenziali. Infine, poiché è necessario tempo aggiuntivo per la selezione delle cellule trasdotte e per la trascrizione dello sgRNA, il tempo per l'analisi potrebbe essere lungo. Ciò rappresenta una sfida per il lavoro in piastre multipozzetti che non favoriscono lunghi periodi di coltura. I virus adeno-associati (AAV) sono un'altra opzione per la consegna del transgene. Questi vettori di solito rimangono in uno stato extracromosomico, ma hanno una capacità di carico limitata (~ 4,5 kb). L'utilizzo di entrambi i virus richiede requisiti di sicurezza aggiuntivi, inclusa una struttura BSL2 con formazione e infrastruttura adeguate.

SgRNA sintetico

L'RNA guida singolo può essere prodotto su larga scala attraverso la produzione sintetica. Uno dei principali vantaggi della produzione sintetica (al contrario della trascrizione in vitro) è che le guide possono essere modificate chimicamente per aumentare la stabilità e prevenire l'innesco di risposte immunitarie innate all'interno delle cellule ospiti. Questi sgRNA modificati hanno efficienze di modifica più elevate rispetto alle guide non modificate in una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule primarie. Un altro vantaggio del formato RNA è che i test possono essere eseguiti in tempi relativamente brevi (a volte solo giorni dopo la trasfezione) rispetto ai formati virali e plasmidici. Uno svantaggio delle guide sintetiche è che è necessaria l'ottimizzazione della trasfezione per garantire un'elevata efficienza di editing.

Formato Cas9

Le linee cellulari che esprimono Cas9 sono spesso preferite per gli schermi in serie, poiché semplifica il flusso di lavoro (ovvero, è necessario fornire solo la libreria sgRNA). Tuttavia, poiché le cellule primarie hanno capacità limitate di espansione, le cellule immortalate e le cellule iPS possono essere utilizzate solo per sviluppare linee cellulari stabili che esprimono Cas9. In alternativa, Cas9 può essere co-trasfettato in un formato plasmidico. Tuttavia, la trasfezione del plasmide rischia la citotossicità nelle cellule sensibili e richiede più tempo tra la trasfezione e il dosaggio (per consentire la trascrizione e la traduzione di Cas9).

Infine, Cas9 può essere introdotto come ribonucleoproteine ​​pre-complessate (RNP). Uno dei principali vantaggi di questo formato è che la modifica è limitata a un breve lasso di tempo (riducendo il rischio di effetti fuori bersaglio). Inoltre, gli RNP producono elevate efficienze di editing su una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule primarie, le cellule iPS e le cellule immortalate.

Metodo di trasfezione

Gli schermi allineati sono compatibili con la trasduzione virale, nonché con diversi metodi di trasfezione non virale. La trasfezione a base lipidica (lipofezione) utilizza reagenti lipidici cationici per fornire componenti CRISPR (ad es. plasmide, RNP) nelle cellule. Il processo prevede innanzitutto la costruzione di strutture liposolubili, chiamate liposomi, attorno ai componenti. I componenti vengono quindi trasportati nella cellula attraverso l'endocitosi, un processo in cui la membrana plasmatica circonda i componenti sul lato esterno e germoglia all'interno della cellula. I componenti CRISPR sfuggono quindi alla via endosomiale e si diffondono attraverso il citoplasma. La trasfezione a base di lipidi è conveniente, non richiede attrezzature speciali ed è adatta per flussi di lavoro ad alta produttività. Sebbene questa tecnica sia comunemente usata per lo screening delle cellule immortalate, non è raccomandata per le cellule primarie o staminali. L'elettroporazione è un altro metodo di trasfezione popolare per lo screening ad alto rendimento. Questa tecnica prevede la sospensione delle celle in una soluzione conduttiva e l'applicazione brevemente di impulsi elettrici ad alta tensione. L'applicazione di elettricità induce la formazione di pori temporanei nella membrana plasmatica e il potenziale elettrico attraverso la membrana fa sì che le molecole cariche (ad esempio, sgRNA/RNP) entrino nel citoplasma attraverso i pori. La trasfezione è spesso altamente efficiente ed è appropriata per una varietà di tipi di cellule (comprese le cellule primarie e staminali). Tuttavia, richiede l'accesso ad apparecchiature specializzate, come un elettroporatore o NucleofectorTM.

Progettazione della biblioteca

Guida RNA

Il testo della Guida alla progettazione può avere un profondo effetto sul risultato di uno schermo. Ad esempio, le librerie di sgRNA che non eliminano i bersagli in modo robusto potrebbero non produrre un segnale rilevabile sufficiente e quindi portare a falsi negativi. Inoltre, gli sgRNA con modifiche fuori bersaglio possono introdurre rumore nel sistema e, in definitiva, complicare l'analisi dei risultati. Diversi fattori possono essere presi in considerazione per aumentare la robustezza e la specificità delle librerie di sgRNA. Ad esempio, si raccomanda che le guide prendano di mira gli esoni precoci dei geni codificanti le proteine ​​(per garantire che la funzione proteica sia completamente terminata) e che le sequenze guida siano valutate in silico per ridurre al minimo l'editing fuori bersaglio. Inoltre, è possibile progettare più guide per bersaglio per aumentare la probabilità di un knockout. Le guide possono anche essere progettate per influenzare strategicamente un tipo di interruzione genomica. La maggior parte delle librerie sono progettate per dipendere dalla generazione di indel tradizionali indotti dal frameshift. Tuttavia, poiché alcuni indel sono multipli di tre nucleotidi (e non spostano il frame di lettura), le proteine ​​associate possono mantenere la loro funzione. Pertanto, l'efficienza del knockout può variare notevolmente.

Synthego ha affrontato questo problema progettando librerie che comprendono sgRNA multi-guida, in cui ogni gene è strategicamente mirato da un massimo di tre guide. Le guide sono progettate per tagliare contemporaneamente un locus target in un esone precoce, causando una o più delezioni di frammenti. Questa strategia si traduce in maggiori efficienze di knockout (e minore varianza) rispetto a quando le stesse guide vengono introdotte singolarmente. Ora che abbiamo delineato alcuni fattori della progettazione delle librerie, diamo un'occhiata alle varie librerie disponibili per l'acquisto.

Tipi di biblioteche

A seconda dell'obiettivo, i ricercatori potrebbero voler prendere di mira un'ampia raccolta di geni che abbracciano il genoma o solo o un piccolo sottoinsieme di candidati. Per soddisfare queste esigenze, diversi fornitori offrono librerie in formati standard e personalizzati.

Biblioteche standard

Le librerie standard sono raccolte di sgRNA "pronte all'uso". Queste librerie sono spesso utilizzate per schermi primari che mirano a valutare un gran numero di geni per il loro coinvolgimento in una malattia o in un percorso. Le librerie standard più complete vengono aggiornate frequentemente per tenere conto di nuovi geni, riclassificazioni geniche e ridefinizioni SNV. Synthego offre attualmente 30 librerie standard, tra cui l'intero essere umano (19.753 geni), gli enzimi drogabili, deubiquitinanti (DUBS), GPCR, chinasi e bersagli immuno-oncologici, tra gli altri. Tutte queste librerie sono curate utilizzando più ontologia genica e database di farmaci.

Librerie personalizzate

Le librerie personalizzate sono sottoinsiemi di target genetici scelti dal ricercatore. Queste librerie vengono spesso utilizzate negli schermi secondari per convalidare i risultati del target genetico dagli schermi primari. Piccole librerie personalizzate vengono utilizzate anche nello sviluppo del dosaggio per ottimizzare le condizioni e la tempistica, nonché per miniaturizzare il dosaggio in un formato di piastra.

Conclusione

 CRISPR ha dimostrato di essere uno strumento avvincente per la genomica funzionale, poiché consente ai ricercatori di associare i cambiamenti nei fenotipi con knockout altamente specifici. Gli schermi LOF mediati da CRISPR sono ora comuni per chiarire i bersagli farmacologici per lo sviluppo terapeutico in una varietà di aree patologiche. Un'efficace identificazione dei farmaci spesso costituisce la base di interi programmi di scoperta di farmaci ed è fondamentale per il successo dell'introduzione dei farmaci sul mercato. Due tipi di schermi, raggruppati e disposti in serie, differiscono sia per metodologia che per versatilità. Mentre gli schermi raggruppati si basano sulla trasduzione virale e si limitano alla valutazione dei fenotipi binari, gli schermi allineati possono essere utilizzati con una varietà di formati di consegna e possono valutare caratteristiche cellulari complesse. Quest'ultimo metodo sta diventando sempre più popolare a causa della ricchezza di informazioni biologiche che si possono ottenere. Le librerie di screening di Synthego combinano l'utilità del formato array con la potenza della tecnologia di progettazione a più guide. Sfruttando un design unico di più sgRNA per generare eliminazioni di frammenti, le librerie di Synthego inducono knockout altamente affidabili di ciascun gene. Con le nostre librerie di screening standard e personalizzate, puoi valutare rapidamente e in modo rapido i bersagli genetici e muoverti con sicurezza nella tua pipeline di scoperta di farmaci.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Synthego_CRISPR%20Screening_eBook/CRISPR+Screening+101_20200422_(1).pdf?hsCtaTracking=92db2854-33ab-4cf9-a664-02361ca5d424%7C0239ec24-d7ba-4b44-824a-bfabb712896e