CRISPR vs. RNAi / CRISPR vs RNAi
CRISPR vs. RNAi / CRISPR vs RNAi
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Screens for target identification require the ability to specifically deactivate a large number of genes in a systematic fashion. Over the past several decades, researchers have relied heavily on RNA interference (RNAi) to repress gene function. The strategy involves introducing double-stranded RNA to trigger an innate cellular defense mechanism intended for viral pathogens. After processing, one strand of the RNA is incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC), which then targets and cleaves complementary mRNA species.
Depletion of mRNA causes temporary gene silencing (knockdown). Libraries of shRNA or siRNA are often used for large-scale LOF screens and have led to many important discoveries. Because RNAi only reduces (does not eliminate) RNA transcript abundance, scientists can study the effects of perturbing essential genes without killing cells. Also, because RNAi can repress genes in a dosage-dependent manner, it can be used to more realistically mimic the effect of a drug than through complete gene ablation. Despite these advantages, RNAi-based screens have several drawbacks. For instance, knockdown efficiency can be variable and may produce inadequate signal for some assays, resulting in false negatives. Silencing is also transient, limiting the timeframe that assays can be conducted. Another potential issue is that sh/siRNA have a short region of sequence complementarity, thus often resulting in off-target silencing if sequences match regions of the 3’ UTR of transcripts. High offtargets can lead to false negatives or false positives. Both of these issues can confound results and thus require extensive validation.
CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) technology has emerged as a powerful alternative to RNAi. Instead of repressing gene function at the post-transcriptional level, CRISPR introduces mutations directly to genomic DNA. The CRISPR system consists of a programmable guide RNA (gRNA) and a Cas9 nuclease (S. pyogenes) that together form a ribonucleoprotein (RNP), as shown in Figure. The RNP binds to a region of genomic DNA that
1) has a compatible protospacer-adjacent motif (PAM) to Cas9
2) has complementary target sequence to the gRNA.
If both requirements are met, Cas9 makes a double-strand break (DSB) in the DNA. This action triggers innate cellular repair that can be harnessed for gene editing. Non-homologous end joining (NHEJ), the most common type of DNA repair in mammalian cells, is often exploited to terminate gene function. This mechanism fixes DSBs by ligating the DNA ends together, but occasionally inserts or deletes nucleotides (indels) in the process. Indels that cause a frameshift mutation will disrupt the gene so that it no longer makes a functional protein (knockout). CRISPR-mediated screens have several advantages over RNAi technology, including higher consistency and fewer off-target effects. Also, because CRISPR-Cas9 editing permanently abolishes protein expression, it can produce a stronger phenotypic signal and allow for a longer time frame for analysis. Thus, CRISPR-Cas9 technology is increasingly becoming adopted for functional genomic screens.
Functional Assays As mentioned earlier, genetic screens rely on an assay to qualitatively or quantitatively evaluate the effects of knockouts. Each assay should be customized according to the biological question that is addressed. In this section, we will go over two broad categories of assays: binary and multi-parametric.
Binary assay: an assay that measures the presence or absence of a single paramter.
Cells are catagorized as having a phenotype of interest or not.
Binary Assays
Binary assays identify cells based on the presence or absence of a desired phenotype. These simple “yes/no” assays can be conducted by either using a selective pressure to kill off a subset of cells (viability assays), or by physically sorting cells based on a biomarker (FACS-based assays). Let’s explore these two options below.
Viability Assays
Viability assays separate cells based on whether they live/ proliferate or die/ senesce. These assays apply a positive or negative selection, such as a drug, toxin, or time, to select for a fitness-associated phenotype.
Positive selection enriches cells with knockouts that provide a survival or growth advantage under a certain selective pressure, such as a drug, infection, or adverse condition. The selective pressure kills most of the cells, and the remaining cells are deep-sequenced to identify the gene perturbations associated with survival. These types of screens are often used for identifying mutations that confer drug resistance.
Negative selection selects against cell survival.
These screens, often referred to as “dropout” screens, identify genes that (when perturbed) die after the pressure is applied. This process is similar to positive selection in that a selective pressure is applied and a subset of cells survive. However, the sequences of surviving cells must be compared to the initial population (if the selective pressure is time) or to a control population in order to identify genes that, when ablated, caused cell death. Negative selection is often used to identify essential genes and genetic vulnerabilities of diseases. For instance, a negative screen can be used to identify genes that (when ablated) sensitize diseases to an existing drug. Modulating these additional targets through a cocktail of several pharmacological agents can make the original drug more effective. An additional approach that is commonly used in cancer research is to study synthetic lethality: cell death caused by the simultaneous disruption of two (or more) genes. In these screens, gRNAs that are depleted compared to a control reveal potential gene targets for cancer therapies.
FACS-based Assays Another type of binary assay involves using fluorescence-activated cell sorting (FACS) to physically sort the edited cells into two subpopulations those that exhibit desired phenotype and those that do not. The edited cells are first stained with a fluorescent antibody specific for a biomarker of interest and then FACS is used to sort the cells based on the presence or absence of the marker. These assays can be used to investigate the effects of gene knockouts on cell surface markers or reporter proteins.
Multi-parametric Assays
More sophisticated than their binary counterparts, multi-parametric assays measure multiple parameters simultaneously. Thanks to advancements in imaging, microscopy, and other technologies, there are a diverse array of assays that can measure everything from morphological features to the location of proteins in the cell. Some assays can even be used to measure markers of cellular processes over time. Below, we discuss some commonly used assay approaches.
High-Content Imaging
One of the major advantages of arrayed screens is that they can be used with high-content imaging, an analysis platform that combines automated microscopy, fluorescent detection, and advanced software algorithms. Screens that leverage this type of analysis, often called highcontent screens, can quantitatively assess complex cellular phenotypes. For instance, these screens can measure changes in cell physiology and morphology, even at the subcellular level, by visualizing endogenous tags or fluorescent antibodies. This compelling technology enables researchers to capture a wealth of phenotypic information and, as a consequence, gain more meaningful insights about the effects their manipulations have on cell models.
Protein or Metabolite Abundance
Arrayed screens that interrogate metabolic networks often have fixed endpoint readouts (a single measurement after an incubation period), where the abundance of a given protein or metabolite is assessed. The output is typically measured as a gradient of colorimetric or fluorescent signal, such as in ELISAs, β-gal assays or luciferase assays. Mass spectrometry can also be used to evaluate various molecules and compounds within cells.
Time-course Monitoring
If the aim of a study is to measure biomarkers/ morphology over a time interval, arrayed screens enable the collection of data over the course of a screen. These screens are used for studies aimed at identifying genes involved in cellular processes such as cell differentiation, migration, and phagocytosis.
ITALIANO
Gli schermi per l'identificazione del bersaglio richiedono la capacità di disattivare specificamente un gran numero di geni in modo sistematico. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto molto affidamento sull'interferenza dell'RNA (RNAi) per reprimere la funzione genica. La strategia prevede l'introduzione di RNA a doppio filamento per attivare un meccanismo di difesa cellulare innato destinato ai patogeni virali. Dopo l'elaborazione, un filamento dell'RNA viene incorporato in un complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC), che quindi prende di mira e scinde le specie di mRNA complementari. L'esaurimento dell'mRNA provoca il silenziamento genico temporaneo (knockdown). Le librerie di shRNA o siRNA sono spesso utilizzate per schermi LOF su larga scala e hanno portato a molte importanti scoperte. Poiché l'RNAi riduce (non elimina) l'abbondanza di trascrizioni di RNA, gli scienziati possono studiare gli effetti della perturbazione dei geni essenziali senza uccidere le cellule. Inoltre, poiché l'RNAi può reprimere i geni in modo dose-dipendente, può essere utilizzato per imitare in modo più realistico l'effetto di un farmaco piuttosto che attraverso l'ablazione genica completa. Nonostante questi vantaggi, gli schermi basati su RNAi presentano diversi inconvenienti. Ad esempio, l'efficienza del knockdown può essere variabile e può produrre un segnale inadeguato per alcuni test, con conseguenti falsi negativi. Anche il silenziamento è transitorio, limitando il periodo di tempo in cui possono essere condotti i test. Un altro potenziale problema è che sh/siRNA hanno una breve regione di complementarità della sequenza, risultando così spesso in un silenziamento fuori bersaglio se le sequenze corrispondono alle regioni dell'UTR 3' delle trascrizioni.
Elerati fuori bersaglio possono portare a falsi negativi o falsi positivi. Entrambi questi problemi possono confondere i risultati e quindi richiedere un'ampia convalida.
La tecnologia CRISPR (ripetizioni palindromiche in cluster regolarmente interspaziate) è emersa come una potente alternativa all'RNAi. Invece di reprimere la funzione genica a livello post-trascrizionale, CRISPR introduce mutazioni direttamente nel DNA genomico. Il sistema CRISPR è costituito da un RNA guida programmabile (gRNA) ed una nucleasi Cas9 (S. pyogenes) che insieme formano una ribonucleoproteina (RNP), come mostrato nella Figura. L'RNP si lega a una regione di DNA genomico che
1) ha un motivo protospacer-adiacente (PAM) compatibile con Cas9
2) ha una sequenza bersaglio complementare al gRNA.
Se entrambi i requisiti sono soddisfatti, Cas9 effettua una rottura del doppio filamento (DSB) nel DNA. Questa azione innesca la riparazione cellulare innata che può essere sfruttata per l'editing genetico. L'unione terminale non omologa (NHEJ), il tipo più comune di riparazione del DNA nelle cellule di mammifero, viene spesso sfruttata per terminare la funzione genica. Questo meccanismo risolve i DSB legando insieme le estremità del DNA, ma occasionalmente inserisce o elimina nucleotidi (indel) nel processo. Gli Indel che causano una mutazione frameshift interromperanno il gene in modo che non produca più una proteina funzionale (knockout). Gli schermi mediati da CRISPR presentano diversi vantaggi rispetto alla tecnologia RNAi, tra cui una maggiore consistenza e minori effetti fuori bersaglio. Inoltre, poiché l'editing CRISPR-Cas9 abolisce permanentemente l'espressione proteica, può produrre un segnale fenotipico più forte e consentire un arco di tempo più lungo per l'analisi. Pertanto, la tecnologia CRISPR-Cas9 viene sempre più adottata per gli schermi genomici funzionali.
Saggi funzionali
Come accennato in precedenza, gli screening genetici si basano su un'analisi per valutare qualitativamente o quantitativamente gli effetti dei knockout. Ciascun test deve essere personalizzato in base alla domanda biologica affrontata. In questa sezione, esamineremo due grandi categorie di saggi: binari e multiparametrici.
Saggio binario: un'analisi che misura la presenza o l'assenza di un singolo parametro. Le cellule sono classificate come aventi un fenotipo di interesse o meno.
Saggi binari
I saggi binari identificano le cellule in base alla presenza o assenza di un fenotipo desiderato. Questi semplici test "sì/no" possono essere condotti utilizzando una pressione selettiva per eliminare un sottoinsieme di cellule (saggi di vitalità) o selezionando fisicamente le cellule in base ad un biomarcatore (saggi basati su FACS).
Esploriamo queste due opzioni di seguito.
Saggi di fattibilità
I saggi di vitalità separano le cellule in base al fatto che vivano/proliferino o muoiano/senescano. Questi test applicano una selezione positiva o negativa, come un farmaco, una tossina od il tempo, per selezionare un fenotipo associato al fitness.
La selezione positiva arricchisce le cellule con knockout che forniscono un vantaggio di sopravvivenza o crescita sotto una certa pressione selettiva, come un farmaco, un'infezione o una condizione avversa. La pressione selettiva uccide la maggior parte delle cellule e le cellule rimanenti vengono sequenziate in profondità per identificare le perturbazioni geniche associate alla sopravvivenza. Questi tipi di schermi sono spesso utilizzati per identificare le mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci.
La selezione negativa seleziona contro la sopravvivenza cellulare. Questi schermi, spesso indicati come schermi "dropout", identificano i geni che (se perturbati) muoiono dopo l'applicazione della pressione. Questo processo è simile alla selezione positiva in quanto viene applicata una pressione selettiva ed un sottoinsieme di cellule sopravvive. Tuttavia, le sequenze di cellule sopravvissute devono essere confrontate con la popolazione iniziale (se la pressione selettiva è il tempo) o con una popolazione di controllo per identificare i geni che, una volta ablati, hanno causato la morte cellulare. La selezione negativa viene spesso utilizzata per identificare i geni essenziali e le vulnerabilità genetiche delle malattie. Ad esempio, uno screening negativo può essere utilizzato per identificare i geni che (se ablati) sensibilizzano le malattie a un farmaco esistente. La modulazione di questi bersagli aggiuntivi attraverso un cocktail di diversi agenti farmacologici può rendere il farmaco originale più efficace. Un ulteriore approccio comunemente utilizzato nella ricerca sul cancro è lo studio della letalità sintetica: la morte cellulare causata dall'interruzione simultanea di due (o più) geni. In questi schermi, i gRNA che sono esauriti rispetto a un controllo rivelano potenziali bersagli genici per le terapie del cancro.
Saggi basati su FACS
Un altro tipo di saggio binario prevede l'utilizzo dell'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare fisicamente le cellule modificate in due sottopopolazioni, quelle che mostrano il fenotipo desiderato e quelle che non lo fanno. Le cellule modificate vengono prima colorate con un anticorpo fluorescente specifico per un biomarcatore di interesse e quindi viene utilizzato FACS per ordinare le cellule in base alla presenza o all'assenza del marcatore. Questi test possono essere utilizzati per studiare gli effetti dei knockout genici sui marcatori di superficie cellulare o sulle proteine reporter.
Saggi multiparametrici
Più sofisticati delle loro controparti binarie, i test multiparametrici misurano più parametri contemporaneamente. Grazie ai progressi nell'imaging, nella microscopia ed in altre tecnologie, esiste una vasta gamma di test in grado di misurare qualsiasi cosa, dalle caratteristiche morfologiche alla posizione delle proteine nella cellula. Alcuni test possono anche essere utilizzati per misurare i marcatori dei processi cellulari nel tempo. Di seguito, discutiamo alcuni approcci di analisi comunemente usati.
Imaging ad alto contenuto
Uno dei principali vantaggi degli schermi ad array è che possono essere utilizzati con l'imaging ad alto contenuto, una piattaforma di analisi che combina microscopia automatizzata, rilevamento fluorescente ed algoritmi software avanzati. Gli schermi che sfruttano questo tipo di analisi, spesso chiamati schermi ad alto contenuto, possono valutare quantitativamente fenotipi cellulari complessi. Ad esempio, questi schermi possono misurare i cambiamenti nella fisiologia e morfologia cellulare, anche a livello subcellulare, visualizzando tag endogeni o anticorpi fluorescenti. Questa tecnologia avvincente consente ai ricercatori di acquisire una vasta gamma di informazioni fenotipiche e, di conseguenza, di ottenere informazioni più significative sugli effetti che le loro manipolazioni hanno sui modelli cellulari.
Abbondanza di proteine o metaboliti
Schermi a schiera che interrogano le reti metaboliche hanno spesso letture degli endpoint fissi (una singola misurazione dopo un periodo di incubazione), in cui viene valutata l'abbondanza di una determinata proteina o metabolita. L'uscita viene generalmente misurata come un gradiente di segnale colorimetrico o fluorescente, come nei test ELISA, nei test β-gal o nei test della luciferasi. La spettrometria di massa può essere utilizzata anche per valutare varie molecole e composti all'interno delle cellule. Monitoraggio dell'andamento temporale Se lo scopo di uno studio è misurare biomarcatori/morfologia su un intervallo di tempo, gli schermi ad array consentono la raccolta di dati nel corso di uno schermo. Questi schermi vengono utilizzati per studi volti a identificare i geni coinvolti nei processi cellulari come la differenziazione cellulare, la migrazione e la fagocitosi.
Da:
https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Synthego_CRISPR%20Screening_eBook/CRISPR+Screening+101_20200422_(1).pdf?hsCtaTracking=92db2854-33ab-4cf9-a664-02361ca5d424%7C0239ec24-d7ba-4b44-824a-bfabb712896e
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