Sanger Sequencing in Diagnostic Labs / Sequenziamento di Sanger nei laboratori diagnostici

 Sanger Sequencing in Diagnostic Labs / Sequenziamento di Sanger nei laboratori diagnostici

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

The sequencing of single or multiple genes is often the first step in the genetic diagnosis of a disease and informs subsequent treatment and care. The development of the Sanger sequencing method in 1977 allowed labs to sequence DNA fragments with automated base calls for the first time. While continual developments have led to innovative technologies such as Next Generation Sequencing (NGS), Sanger sequencing is still considered the gold standard technique for some clinical scenarios, for example, 16S sequencing, human leukocyte antigen (HLA) typing, microsatellite instability (MSI), tandem repeats, and rare variant confirmation.

Sequencing in a Diagnostic Laboratory

DNA or RNA is extracted from the diagnostic sample (the latter is then converted to cDNA). Correct sample handling and extraction are critical for producing the high-quality DNA template needed for sequence analysis.

The extracted sample is sequenced.

Sequencing data is analysed by a trained scientist and any unusual laboratory findings are verified.

Sanger vs. NGS sequencing for Clinical Decisions

 Genetic/genome sequencing is critical for the management of diseases with a genetic component and is increasingly becoming part of clinical interventions. Sanger sequencing and NGS are both highly valuable and complementary tools for diagnostic laboratories. However, there are some distinct differences between the two methods, which include:

Sanger sequencing

The sequencing of single genes or regions (up to 1,000 base pairs)

Applications

Pathogen detection

Validation of PCR results

Monogenic diseases

Short tandem repeat analysis

NGS sequencing

The simultaneous sequencing of thousands of genomic variants (either concurrently identifying many individual changes in one sample or comparing many samples at once.

Microbiome analysis

Complex genetic aetiology

Pathogen subtyping in critical outbreak situations

Sequencing the entire genome/exome to find novel variants

Comparison of Sequencing Techniques

Sanger sequencing

DATA

Can only sequence a single fragment at a time

Can view the trace directly for challenging templates and interpretation by user

TIME

Fast for low number of targets and therefore a fast turnaround time

COST

Cost-effective for low number of targets such as in the screening and diagnosis of monogenic disorders

NHS single-gene Sanger sequencing reimbursement rate was £138 in one study

NGS sequencing

DATA

Can sequence millions of fragments in parallel per run 

Large data set which requires specialist training and resources to interpret

TIME

Slower overall therefore longer turnaround time, but can give data on multiple targets at once

 COST

Cost-effective for higher sample throughput and for sequencing across a large number of genes, as is necessary for the screening and diagnosis of diseases with complex genetic aetiology such as cancers 

In one study, the NHS single gene 

NGS diagnostic cost £339 per patient

NGS is becoming more accessible to clinical labs. However, approval and validation of NGS-based laboratory-developed tests (LDTs) by administrations, such as the U.S. Food and Drug Administration (FDA), is a difficult process requiring high expertise and investment. In contrast, Sanger sequencing is still a valuable asset as it has a short turnaround time and low cost making its validation uncomplicated and cost-effective.

ITALIANO

Il sequenziamento di uno o più geni è spesso il primo passo nella diagnosi genetica di una malattia ed informa il trattamento e la cura successivi. Lo sviluppo del metodo di sequenziamento Sanger nel 1977 ha consentito ai laboratori di sequenziare per la prima volta frammenti di DNA con chiamate di base automatizzate. Sebbene i continui sviluppi abbiano portato a tecnologie innovative come Next Generation Sequencing (NGS), il sequenziamento di Sanger è ancora considerato la tecnica standard per alcuni scenari clinici, ad esempio il sequenziamento 16S, la tipizzazione dell'antigene leucocitario umano (HLA), l'instabilità dei microsatelliti (MSI), ripetizioni in tandem e conferma di una variante rara.

Sequenziamento in un laboratorio diagnostico

Dal campione diagnostico viene estratto DNA o RNA (quest'ultimo viene poi convertito in cDNA). La corretta manipolazione ed estrazione del campione sono fondamentali per produrre il modello di DNA di alta qualità necessario per l'analisi della sequenza.

Il campione estratto viene sequenziato.

I dati di sequenziamento vengono analizzati da uno scienziato qualificato e vengono verificati tutti i risultati di laboratorio insoliti.

Sequenziamento Sanger vs. NGS per decisioni cliniche

 Il sequenziamento genetico/genomico è fondamentale per la gestione delle malattie con una componente genetica e sta diventando sempre più parte degli interventi clinici. Il sequenziamento di Sanger e l'NGS sono entrambi strumenti altamente preziosi e complementari per i laboratori diagnostici. Tuttavia, ci sono alcune differenze distinte tra i due metodi, che includono:

Sequenza di Sanger

Il sequenziamento di singoli geni o regioni (fino a 1.000 paia di basi)

Applicazioni

Rilevamento di agenti patogeni

Validazione dei risultati della PCR

Malattie monogeniche

Breve analisi ripetuta in tandem

Sequenza NGS

Il sequenziamento simultaneo di migliaia di varianti genomiche (identificazione simultanea di molti cambiamenti individuali in un campione o confronto di molti campioni contemporaneamente.

Analisi del microbioma

Eziologia genetica complessa

Sottotipizzazione del patogeno in situazioni critiche di focolaio

Sequenziamento dell'intero genoma/esoma per trovare nuove varianti

Confronto di tecniche di sequenziamento

Sequenza di Sanger

DATI

Può sequenziare solo un singolo frammento alla volta

Può visualizzare la traccia direttamente per modelli impegnativi e interpretazioni da parte dell'utente

TEMPO

Veloce per un basso numero di bersagli e quindi un rapido tempo di risposta

COSTO

Conveniente per un basso numero di bersagli come nello screening e nella diagnosi di malattie monogeniche

Il tasso di rimborso del sequenziamento di Sanger a gene singolo dell'NHS è stato di £ 138 in uno studio

Sequenza NGS

DATI

Può sequenziare milioni di frammenti in parallelo per corsa

Grande set di dati che richiede formazione specialistica e risorse per l'interpretazione

TEMPO

Complessivamente più lento, quindi tempi di risposta più lunghi, ma può fornire dati su più obiettivi contemporaneamente

 COSTO

Conveniente per una maggiore produttività del campione e per il sequenziamento di un gran numero di geni, come è necessario per lo screening e la diagnosi di malattie con eziologia genetica complessa come i tumori 

In uno studio, il costo diagnostico NGS del gene singolo è stato di £ 339 per paziente.

NGS sta diventando più accessibile ai laboratori clinici. Tuttavia, l'approvazione e la convalida dei test sviluppati in laboratorio (LDT) basati su NGS da parte di amministrazioni, come la Food and Drug Administration (FDA) statunitense, è un processo difficile che richiede competenze e investimenti elevati. Al contrario, il sequenziamento di Sanger è ancora una risorsa preziosa in quanto ha tempi di consegna brevi e costi bassi che rendono la sua convalida semplice ed economica.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/TN%20Email%20Campaigns%20and%20App%20Alerts/Landing%20Page%20Promotions/VHBIO_Sanger_Infographic_FINAL.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1661093359242.1661096252906.100&__hssc=8807082.1.1661096252906&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=6d73d3fd-169a-4952-b727-2dab4f3be5ad%7C7baf38f2-94a8-45eb-948b-d76d28514ec3